3.4. Визначення відновленого глутатіону.

Г лутатіон один із найбільш поширених природних пептидів, який знайдено майже у всіх клітинах рослин, тварин, а також у бактеріях і дріжджах. Він складається з трьох амінокислот – глутамінової кислоти, цистеїну і гліцину. Глутатіон виконує роль коферменту в деяких реакціях внутрішньо молекулярного перенесення водню та ізомеризації; функціонально активною групою є сульфгідрильна група цистеїну. Відновлена форма глутатіону (Гл – SH) легко окислюється, наприклад молекулярним киснем у присутності металів або йодом, утворюючи окислену форму (Гл–S–S–Гл).

Відновлена форма – Гл–sh

Окислена форма Гл–s–s–Гл

Окислення може відбуватися також ферментативно за участю глутатіондегідрогенази, а також, дегідроаскорбінової кислоти.

Глутатіон бере участь у багатьох фізіологічних процесах в організмі, йому належить велика роль а оборотних перетвореннях дисульфідних груп білків в сульфгідрильні. Зокрема, відновлена форма глутатіону підвищує активність тіолових ферментів, які містять в активному центрі сульфгідрильну групу. До тіолових ферментів належить протеолітичний фермент рослинного походження папаїн. Папаїн міститься у борошні, і підвищення його активності призводить до розпаду білків борошна і дріжджів, що знижує якість харчових продуктів. Для запобігання руйнування клейковини під впливом папаїну відновлений глутатіон окислюють, наприклад, (KBrO₃) або дегідроаскорбіновою кислотою.

Мета роботи: засвоєння методу визначення відновленого глутатіону.

Завдання на виконання роботи: провести кількісне визначення відновленого глутатіону у борошні чи дріжджах.

Апаратура: лабораторна центрифуга, шутель-апарат, годинник.

Лабораторний посуд: мірні колби на 100 мл; мірні циліндри на 100 мл; піпетки на 5 мл; конічні колби на 100 мл; скляні палички.

Матеріали та реактиви: 1. 1 М розчин сульфосаліцилової кислоти; 2. 4%–й розчин сульфосаліцилової кислоти; 3. 0,005 н. розчин КJOз; 4. 0,001 н. розчин KJO₃; 5. 5%–й розчин KJ; 6. 1%–й розчин крохмалю; 7. 5%-й розчин сульфату кадмію.

Принцип методу оснований на окисленні відновленого глутатіону йодом у кислому середовищі;

Хід роботи. У мірну колбу на 100 мл вносять 10 г дослідного матеріалу (борошно або дріжджі). Поступово, перемішуючи, доливають 80 мл дистильованої води. Колбу з сумішшю поміщають на шутель–апарат і перемішують протягом 10 хв. Потім, повільно перемішуючи, додають 5 мл 1 М розчину сульфосаліцилової кислоти, залишають на 30 хв., після цього доводять водою до мітки і знову інтенсивно перемішують. Суміш переносять у центрифужні пробірки і центрифугують. У центрифугаті визначають загальну кількість SH–груп, перераховуючи на відновлений глутатіон.

У конічну колбу на 100–150 мл піпеткою вносять 25 мл центрифугату (що відповідає 2,5 г наважки), додають 25 мл дистильованої води і, перемішуючи,вносять по 2,5 мл 4%–го розчину сульфосаліцилової кислоти і 5%–го розчину KІ. Додають 10 краплин 1%–го розчину крохмалю і титрують 0,001 н. розчином KІO₃ до появи синього забарвлення. Для контролю чистоти реактивів в аналогічних умовах титрують 50 мл дистильованої води.

Розрахунок кількості сульфгідрильних сполук у перерахунку на відновлений глутатіон проводять за формулою;

,

де А – кількість сульфгідрильних сполук, мг%; a і b – об’єми 0,001 н. розчину KJO₃ , які пішли на титрування, відповідно до проби і контролю, мл; 12,28 – коефіцієнт перерахунку на відновлений глутатіон.

Для визначення кількості відновленого глутатіону піпеткою Мора відбирають 50 мл центрифугату (5 г не важки) в мірну колбу на 100 мл. Додають 40 мл 5%-го розчину сульфату кадмію і 4 мл 1 н. розчину гідроксиду натрію. Суміш ретельно перемішують, доводять дистильованою водою до мітки і залишають стояти протягом 30 хв. Потім суміш центрифугують,

У конічну колбу на 100–150 мл вносять 50 мл центрифугату (2,5 г наважки) і визначають кількість SH –сполук, що залишилися в розчині, за допомогою описаної вище методики;

,

де B – кількість SH–сполук, мг%; a₁, і b₁ – об'єми 0,001 н. розчину KJO₃, які пішли на титрування, відповідно до проби і контролю, мл.

Кількість відновленого глутатіону в наважці визначають за різницею між загальною кількістю сульфгідрильних сполук і кількістю, що залишилась після осадження відновленого глутатіону сульфатом кадмію: