3.1.8. Стабильность липидного слоя мембран и явление электрического пробоя

Стабильность липидного слоя и электричес­кий пробой мембраны. В отличие от белков и нуклеиновых кислот, которые в клетке собира­ются каждый по своему чертежу сложнейшими молекулярными роботами, липидный слой мем­браны обладает способностью собираться сам по себе из молекул фосфолипидов и холестерина, если только они содержатся в водном растворе в достаточной концентрации. Это связано с осо­бым свойством молекул липидов, входящих в состав мембран, которое принято называть ам-фифильностью, т. е. сродством одновременно к воде (гидрофильность) и к неводным средам, та­ким как растительное масло или жидкий пара­фин (гидрофобность). Молекула фосфолипида (основной липид клеточной и внутриклеточных мембран) имеет форму сплющенного цилиндра (рис. 13, А), один (меньший) конец которого хорошо растворяется в воде («полярная голова»), а другой - в воде не растворяется («жирный хвост») (рис. 13, Б). В водной среде такие моле­кулы самособираются в липидный бис л ой (рис. 13, В), который сам на себя замыкается, обра­зуя везикулы - липосомы (рис. 13, Г).

Под влиянием тепловых движений молекул в липидном слое могут образоваться дефекты, которые приводят к образованию заполненных водой трещин и щелей (назовем их «порами»). Через такие дефекты могут проходить водора­створимые молекулы и ионы. Однако их появ­ление крайне невыгодно с энергетической точки зрения, поскольку при этом граница раздела липид - вода сильно увеличивается, а это требу­ет затраты работы на преодоление силы поверх­ностного натяжения. С ростом радиуса поры энер­гия системы растет пропорционально радиусу в соответствии с уравнением:

При наличии мембранного потенциала (т. е. разности потенциалов между водными фазами

по сторонам мембраны), который обозначается как ф_ш, энергия образования поры снижается. Как показывает теория, в этом случае энергия системы изменяется с ростом поры по уравне­нию:

Изменение энергии поры с ростом ее радиуса при трех разных мембранных потенциалах по­казано на рис. 14, В. Видно, что с ростом радиу­са энергия системы сначала растет, а затем на­чинает уменьшаться. Это означает, что после преодоления некоторого энергетического барье­ра рост поры будет происходить самопроизволь­но, пока мембрана вообще не разрушится. Вели­чина барьера снижается при увеличении мемб-

ранного потенциала. При небольших потенциа­лах, существующих в живой клетке (70 мВ на цитоплазматической мембране и 175 мВ на внут­ренней мембране митохондрий), этого не проис­ходит, потому что барьер достаточно высок.

С ростом потенциала может наступить момент, когда в мембране начнут формироваться и расти поры и она будет разрушена. Такое явление но­сит название электрического пробоя мембраны.

Величина потенциала, при котором начинается электрический пробой, называется потенциалом пробоя и обычно обозначается как U* или ср*. Величина потенциала пробоя, несколько разли­чающаяся для мембран с разным составом бел­ков и липидов, может служить количественной мерой электрической стабильности мембраны. Чем стабильнее мембрана, тем выше потенциал, который ее «пробивает» (т. е. ср*) .

Электрическая прочность различных мем­бранных структур. Явление электрического про­боя мембран изучалось многими авторами на искусственных мембранах и отдельных клетках. Мембраны обладают определенным сопротивле­нием R электрическому току I, которое при не­большой разности потенциалов ср между двумя сторонами мембраны является постоянной вели­чиной. Иными словами, для мембраны соблюда­ется закон Ома:

Это означает, что зависимость между напря­жением на мембране ср и током через мембрану / - линейная. Однако такая зависимость сохраня­ется при сравнительно небольших величинах ср: обычно не выше 200-300 мВ. При определенной разности потенциалов на мембране (потенциале пробоя ср*) происходит резкое возрастание тока (рис. 14, Г). При постоянном мембранном по­тенциале, если он превышает критическое зна­чение, ток самопроизвольно нарастает во време­ни до полного разрушения мембраны.

На рис. 14 представлены результаты опыта на бислойных липидных мембранах. Аналогич­ные опыты были проведены на везикулярных мембранных структурах: фосфолипидных вези­кулах - липосомах, изолированных митохондри­ях и эритроцитах. В случае липосом и эритро­цитов потенциал на мембране создавался за счет разности концентраций проникающих ионов по сторонам мембраны, в случае митохондрий - за счет энергии окисления субстратов. Измерение мембранного потенциала осуществлялось различ­ными способами, например в случае митохонд­рий, - с помощью потенциалчувствительного флуоресцентного зонда. Явление пробоя мемб­ран наблюдалось во всех случаях. В табл. 11 приведены величины потенциалов пробоя мемб­ран всех этих объектов. Разумеется, потенциал пробоя во всех случаях выше потенциала, суще­ствующего на мембранах в живой клетке: иначе

все мембраны пробились бы своим собственным потенциалом и клетка не могла бы существовать. Однако запас электрической прочности невелик: всего 20-30 мВ. Это означает, что при снижении прочности мембраны может произойти ее «са­мопробой».

Электрический пробой как универсальный механизм нарушения барьерной функции мем­бран. Чрезвычайно важно, что электрическая прочность мембран, мерой которой служит по­тенциал пробоя, снижается под действием по­вреждающих факторов. Как уже говорилось, основными причинами нарушения барьерных свойств мембран при патологии являются: пе-рекисное окисление липидов, действие мемб­ранных фосфолипаз, механическое растяже­ние мембран или адсорбция на них некоторых белков. Изучение влияния этих действующих факторов на электрическую прочность мембран показало, что все они снижают потенциал про­боя мембран (рис. 15).

При повреждении мембранных структур про­исходит снижение потенциала пробоя <р* и мо­жет сложиться ситуация (р* < ср, когда мембрана будет «пробиваться» собственным мембранным потенциалом. К чему это приводит в условиях живой клетки? Предположим, клетку облучают

ультрафиолетовыми лучами, под влиянием ко­торых в липидных мембранах активируется пе-рекисное окисление. В неповрежденных мито­хондриях потенциал на мембране равен 175 мВ, а потенциал пробоя составляет около 200 мВ (см. табл. 11). В процессе активации перекисного окисления липидов потенциал пробоя начинает постепенно снижаться, и как только он достига­ет значения 175 мВ, мембрана митохондрий «про­бивается» собственным мембранным потенциа­лом. То же происходит и при активации фосфо­липаз-. снижение потенциала пробоя до величи­ны, равной существующему на мембране потен­циалу, приводит к электрическому пробою мем­браны и потере ею барьерных свойств. В услови­ях эксперимента на эритроцитах и митохондри­ях было показано, что осмотическое растяжение мембраны и добавление чужеродных белков, так же как и действие перекисного окисления и фос-фолипазы, снижают потенциал пробоя мембран настолько, что они начинают «пробиваться» соб­ственным мембранным потенциалом.

Естествен вопрос, почему такие, казалось бы, разные воздействия, как перекисное окисление липидов, ферментативный гидролиз фосфолипид-ных молекул, механическое растяжение мемб­раны или адсорбция полиэлектролитов, приво-

дят к одному и тому же результату - снижению электрической прочности (т.е. уменьшению ве­личины потенциала пробоя) мембраны? Теория электрического пробоя дает четкий ответ на этот вопрос. Самопроизвольному росту пор, случай-' но зародившихся в липидном бислое, препятству­ют силы поверхностного натяжения на границе раздела фаз: липидный слой мембраны - окру­жающий водный раствор. Нужно приложить (довольно большую разность потенциалов к мем­бране, чтобы преодолеть эти силы и вызвать рост поры. Все вещества, снижающие поверхностное натяжение (детергенты), облегчают самопроиз­вольный рост пор и снижают величину потен­циала пробоя. И продукты перекисного окисле­ния липидов, и продукты гидролиза фосфоли-пидов фосфолипазами (лизолецитины), и мно­гие белки снижают поверхностное натяжение на границе раздела фаз и таким образом уменьша­ют электрическую прочность мембраны. Меха­ническое растяжение мембраны действует сход­но, так как противодействует силам поверхност­ного натяжения. Таким образом, электрический пробой мембран оказывается универсальным механизмом нарушения барьерной функции мембран при патологии.

Мембранные системы защиты от электри­ческого пробоя. Известны два фактора, с помо­щью которых живые клетки повышают элект­рическую стабильность своих мембранных струк­тур: асимметричный поверхностный потенци­ал и холестерин.

Поверхностный потенциал возникает на мем­бране в случае появления на поверхности ли-пидного слоя заряженных химических группи­ровок, например таких, как карбоксил или фос­фат. Непосредственно на липидный бислой дей­ствует потенциал, равный разности величины мембранного потенциала (т.е. потенциала меж­ду водными средами, омывающими мембрану) и поверхностного потенциала (рис. 16). За счет нео­динаковой плотности зарядов на поверхностях мембраны реальная разность потенциалов, при­ложенная к липидному бислою, может быть боль­ше или меньше трансмембранной разности по­тенциалов. В большинстве биологических мемб­ран заряды распределены между поверхностя­ми таким образом, что разность потенциалов на липидном бислое меньше разности потенциалов между водными растворами, омывающими мем-

брану. Это снижает вероятность пробоя мембра­ны разностью потенциалов, которая существует между водными фазами по сторонам мембран в живых клетках.

Второй фактор, повышающий электрическую прочность мембран, - это холестерин. Было по­казано, что включение молекул холестерина в фосфолипидный бислой весьма заметно увели­чивает электрическую прочность мембран, т. е. повышает потенциал пробоя (см. рис. 14, Г). Осо­бенно заметно действие холестерина на повреж­денные мембраны. Защитные свойства холесте­рина против электрического пробоя мембраны можно объяснить влиянием холестерина на вяз­кость липидного бислоя. Известно, что введение холестерина в фосфолипидный бислой может по­высить вязкость последнего в 2-3 раза. Это при­водит к замедлению образования и роста дефек­тов (пор) в липидном бислое мембран. Как уже говорилось, именно образование и увеличение де­фектов в липидном бислое под действием при­ложенного электрического поля лежит в основе явления электрического пробоя.

Нарушение структурных (матричных) свойств липидного бислоя. Наиболее изучены три характеристики липидного слоя мембран, от которых зависят его свойства как жидкой фазы (матрицы), обеспечивающей функционирование мембранных белков и рецепторов: поверхност­ный заряд, вязкость и площадь липидного слоя. Все эти характеристики исследуются с помощью флуоресцентных и спиновых зондов.

Перекисное окисление липидов и действие мембранных фосфолипаз приводят к накоплению в липидной фазе мембран полиненасыщенных жирных кислот, которые придают мембране при нейтральных рН отрицательный заряд. Увели-

чение отрицательных зарядов на поверхности мембраны облегчает связывание с мембраной ионов и белковых молекул, несущих положи­тельные заряды, и, наоборот, уменьшает взаи­модействие мембран с отрицательно заряженны­ми молекулами или другими мембранами. Свя­зывая больше ионов Са²⁺, мембраны с большим числом отрицательных зарядов на поверхности становятся более доступными для действия фос-фолипаз, но зато хуже связывают ионы Fe²⁺, которые ускоряют пероксидацию липидов.

С другой стороны, при перекисном окисле­нии липидов происходит увеличение вязкости липидного слоя мембран. Значительное увели­чение вязкости имеет место также при увеличе­нии содержания в мембранах холестерина. Воз­растание вязкости приводит к торможению ра­боты мембранных рецепторов, а также встроен­ных в мембраны ферментов, таких как Na⁺ -K⁺ -АТФаза и Са²⁺ - Mg²⁺-ATOa3a. В свою очередь, это изменяет ионный баланс клетки и может при­вести к нарушениям метаболизма.

С помощью флуоресцентных зондов было по­казано, что при перекисном окислении проис­ходит уменьшение площади поверхности липид­ного слоя мембран, а также площади, занимае­мой фосфолипидами на поверхности липопроте-инов плазмы крови. Это связано с окислением части жирно-кислотных цепей фосфолипидов и выходом их в водную фазу. Одним из результа­тов такого явления оказывается увеличение от­носительной концентрации холестерина в липид-ном монослое на поверхности липопротеинов, подвергнутых перекисному окислению.

Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) в

результате этого переносят еще боль­ше холестерина в клеточные мемб­раны сосудистой стенки, чем нео-кисленные ЛПНП, и их атероген-ность возрастает. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП), в нор­ме акцептирующие холестерин с мембран клеток и обладающие ан-тиатерогенным действием, в резуль­тате перекисного окисления полно­стью теряют способность акцепти­ровать холестерин. Возрастание ате-рогенных (холестерин-донорных) свойств ЛПНП и утрата антиатеро-генных (холестерин-акцепторных) свойств ЛПВП, несомненно, отно-

сятся к числу причин того, почему перекисное окисление липидов в районе сосудистой стенки способствует развитию атеросклероза.