книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

Рис. 29. Разностные спектры по­ глощения неочищенного раствора ФПНР из хлоропластов гороха (Л. О. Эйнор, данные публикую­ тся впервые).

Для выделения	ФПНР хлоропласты или целые листья, обычно	шпината
или гороха, после измельчения в гипотоническом растворе буфера		осаждают
ацетоном. Последний	медленно при постоянном перемешивании и охлаждении

добавляют до 75%-ной конечной концентрации. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и освобождают от ацетона диализом. В ходе экстракции осадка слабыми водносолевыми растворами из него высвобождаются Фд, Пц

0\ , , . Т

400 500 600

и Фп, дальнейшее разделение которых наиболее просто достигается с помощью процедур разделения на колонках ДЭАЭ-целлюлозы.

	Борчерт	и Весселс [256] опублико­
	вали пропись совместного выделения пе­
	речисленных выше белков из одной про­
	бы, уточнив	условия	элюирования		с ко­
	лонки ДЭАЭ-целлюлозы. Согласно их
	модификации, после		обычного	получения
	экстракта ФПНР и его диализа в. тече­
	ние ночи против 5 мМ г/шс-буфера				сле­
	довало разделение		белков на	колонке.
	Для этого концентрацию ионов хлора с
	помощью NaCl повышали до 0,2/М. и
	раствор пропускали через колонку с
	ДЭАЭ-целлюлозой		(колонку	заряжали
,	0,15 М раствором rpuc-буфера). В				этих
	условиях на колонке		задерживался		толь­

700 71,нМ ко Фд. Его молено было снять с колонки при увеличении ионной силы промывного раствора (до 0,35-н. концентрации ионов хлора).

				Растзор, содержащий		Фп и Пц, кон­
				центрировали ультрафнльтрацией н фрак­
/—нулевая	лнння раствора в		кювете	ционировали осаждением		в	пределах
10 мм (проба	содержит	больше	раство­	0,4—0,75 полного	насыщения		сернокис­
ра, чем контроль); 2 — при внесении в				лым аммонием. При этом Пц оказывался
<пробу> феррицнаннда;		3— при	внесе­
нии избытка	аскорбата;	4 — при	допол­	в осадке, а Фп — в растворе. Осадок от­
нительном внесении гидросульфита.				деляли от раствора	центрифугированием.
Дальнейшие стадии		выделения включали обессолнванне			и переосаждение Пц
и Фп соответственно на колонках				с ДЭАЭ-целлюлозой. Пц элюировали с ко­
лонки в линейном градиенте			0,15—0,2 М грце-буфера. Фп элюировали				с другой

колонки в пределах концентрации буфера 0,1—0,2 М. При работе с Фп исполь­ зовали раствор, содержащий 5 мМ меркаптоэтанола, стабилизировавшего ак­ тивность этого белка. Во всех случаях переосаждение способствовало удале­ нию белковых загрязнений.

Значительно труднее выделить цитохромы из хлоропластов. Проблема выделения цитохромов группы с в принципе решена для одноклеточных водорослей (но не для высших растений!). По-видимому, это объясняется тем обстоятельством, что у таких объектов связь цитохромов внутри ПБЛВ-комплексов менее прочна, чем у высших зеленых растений. Обычная схема выде­ ления цитохромов группы с из хлоропластов водорослей вклю­ чает следующие процедуры: лиофильную сушку или получение из водорослей ацетоновых препаратов, экстракцию водносолевы­ ми растворами, фракционирование белков с помощью сернокис­ лого аммония, разделение белков на колонке с ДЭАЭ-целлюло­ зой [1017, 798, 582, 518, 514, 1019, 1021]. Некоторые из цито­ хромов зеленых и синезеленых водорослей очищены даже

до кристаллического состояния. Выделение цитохрома группы с из хлоропластов высших растений — Цит / — оказалось сложной задачей.

Хилл, Скарисбрик и Давенпорт [495, 332] впервые разрабо­ тали процедуры препаративного выделения цитохромов, участ-

						л
Рис. 30. Спектр поглощения восста-						ю \-
новленной		формы	цитохрома		f (1).	' 1
Для сравнения показан спектр погло­
щения	восстановленной формы				цито­
хрома	с из бычьих сердец			(2). [149].
						0.5
вующих в фотосинтезе. Анали­
тический		метод		выделения
Ц И Т / , К О Т О Р Ы Й			Я В И Л С Я		О С Н О -	*~ ^	'	да Д л и '
вой	этих	и других		методик

[384, 149], впервые был предложен также в лаборатории Хилла. На стр. 131 приведена наша модификация [149] схемы выде­ ления Цит /, спектр восстановленной формы которого показан на

рис. 30.

Следует подчеркнуть, что по процедуре выделения Цит / тре­ буются весьма жесткие воздействия для разрушения ламеллярной структуры хлоропластов. Для гомогенизации листьев необ­ ходимо применять сильно подщелоченные растворы этанола или метанола; экстракты с Цит f в этих условиях обладают повы­ шенной способностью к желеобразованию. На этой стадии Ц.нт f способен ко вторичному осаждению на структурах, поэтому его выход сильно колеблется от опыта к опыту.

Этап разрушения нативных ПБЛВ-комплексов для выделе­ ния Цит / по методике Давенпорта и Хилла [332] со всеми последующими ее модификациями [387, 149] состоит в гомогени­ зации листьев (или хлоропластов) в присутствии подщелоченно­ го до рН 10—11 этанола, конечная концентрация которого дол­ жна составить 50%. Выделение Цит / поэтому связано с разре­ шением противоречия, весьма характерного при работах по изучению ПБЛВ-комплексов. Подщелоченный спирт при повы­ шенных температурах вызывает денатурацию не только побоч­ ных белков хлоропласта, но и самого выделяемого Цит /. Поэтому условием успешной работы является снижение температуры на данном этапе и быстрота операций. Вместе с тем при низкой температуре экстрагирующий раствор меняет свои свойства,, в том числе вязкость, и условия разрушения ПБЛВ-комплекса в этом случае ухудшаются.

При комнатной температуре условия экстракции более бла­ гоприятны, но денатурация резко ускоряется, ввиду чего необ­ ходимо немедленно отделить раствор от осадка, поскольку при

9*

131

Краткая схема выделения цитохрома/ (149)

Измельчение листьев петрушки с подщелоченным (аммиаком) этанолом

Центрифугирование
Надосадочный раствор	Осадок	(на получе­
	ние ацетонового
	препарата)
Осаждение 1,1 объе­
ма ацетона
Декантация и центри­
фугирование
	Надосадочный
Осадок	раствор	(цитохро-
	мов не	содержит)
Промывание центрифугированием
в насыщенном растворе	серно­
кислого аммония, рН	8,0
Осадок	Надосадочный
	раствор (отброс)

Растворение в фосфатном буфе­ ре и диализ против бидистиллированной воды

Разгонка белков на колонке ДЭАЭ-целлюлозы

замедлении процедуры проявляется свойство Цит f вторично вступать в связь со структурой. Кроме того, даже в ходе отде­ ления этанолового раствора от осадка при центрифугировании час-то происходит желеобразование, так как в растворе оказы­ ваются липиды, что иногда не позволяет довести центрифугиро­ вание до конца.

Итак, хотя в результате серии	опытов и удается выделить
Цит f, многие работы оказываются	неудачными. Вышесказанное

заставляет отказаться от обработки одновременно большого ко­ личества материала в одном опыте. В противном случае про­ цедуры первой стадии должны затянуться во времени.

Такого рода трудности заставляют признать, что метод эк­ стракции с помощью подщелоченных спиртовых растворов не совсем удачен и необходим поиск новых путей выделения Цит f. Последнее является пока существенным препятствием при изу­ чении различных реконструированных моделей ЭТЦ с использо­ ванием экзогенного Цит f из высших растений. Более простым оказалось выделение из эвглены Цит с553, который выполняет в этой водоросли функцию Цит /. Однако Цит f из эвглены ве­ сьма существенно отличается от Цит / из высших растений, и подобная замена не является полноценной.

Еще более сложна проблема выделения хлоропластных цито­ хромов группы Ь: Цит Ьг и Цит Ь6. Хилл с соавт. [495, 332] в 1951 —1952 гг. предложили метод выделения этих цитохромов путем весьма сложных процедур многократного фракциониро­ вания гомогенатов листьев сернокислым аммонием без примене­ ния органических растворителей. Несмотря на весьма солидный срок со времени публикаций, вышедших из лаборатории Хилла, сообщения об использовании их методик нам не известны. Осо­ бенно удивляет в методиках из лаборатории Хилла получение Цит Ь, который, по их данным, растворим в насыщенном раство­ ре сернокислого аммония.

Следует заметить, что Хакетту, Шихи и Касинскому также, удалось выделить из растений Цит b-типа без применения орга­ нических растворителей, но не из фотосинтезирующих тканей, а главным образом из молодых этиолированных проростков фа­ соли [580, 865, 864]. Выделенный в лаборатории Хакетта Цит Ь3 участвует в цепи переноса электрона при дыхании и не имеет, по всей видимости, ничего общего с Цит 63 (Цит Ь559), находя­ щимся в хлоропластах.

Итак, цитохромы фотосинтезирующих тканей, в отличие от Фд, Пц и Фп, прочно закреплены в структуре тилакоидной мем­ браны, и их выделение связано с весьма жесткими воздействия­ ми на ПБЛВ-комплексы тилакоидных мембран.

Применение «мягких» воздействий для выделения и анализа ПБЛВ-комплексов. Следует признать, что описанные выше при­ емы разрушения структуры тилакоидных мембран хлоропластов приводят к сильному необратимому воздействию на фотохимиче­ ский и энзиматический аппарат фотосинтеза. Значительно более мягким оказывается действие детергентов — веществ, содержа­ щих в составе молекул такое сочетание гидрофобных и гидро­ фильных групп, что в конечном итоге они солюбилизируют мем­ браны. Нерастворимость тилакоидных мембран в водных сре­ дах в первую очередь обусловлена высоким уровнем содержания

различных липидов. Действие детергентов приводит к частич­ ному замещению липидов и их освобождению из мембран. Эффект зависит от концентрации детергентов. Освобождается также часть хлорофилла и белка. Эффект на солюбилизацию мембран хлоропластов зависит от свойств и процентного содержа­ ния детергента, времени инкубации, температуры, ионной силы раствора.

В зависимости от электрического заряда детергенты делят на классы: анионные (жирные кислоты, натрийдодецилсульфат, натрийхолат); катионные, несущие положительно заряженную гидрофильную группу (цетилпиридинийхлорид); неионные, в ко­ торых гидрофобный остаток сбалансирован неионизированной гидрофильной группировкой, например многоосновным спиртом (твин-80, тритон Х-100, дигитонин).

Более жесткое действие на фотохимический аппарат хлоро­ пластов оказывают анионные детергенты, например додецилсульфат натрия или холат.

Наиболее успешным оказалось применение неионных детер­ гентов— дигитонина * и тритона Х-100**. С их помощью уда­ лось выделить ПБЛВ-комплексы, сохраняющие многие свойства целых хлоропластов, в том числе способность к переносу элек­ тронов при действии света.

Хотя еще в 1941 г. была описана способность некоторых детергентов, в том числе додецилсульфата натрия, вызывать об­ разование совершенно прозрачных зеленых растворов из первона­ чально опалесцирующих суспензий хлоропластов [876], приме­ нение детергентов широко вошло в лабораторную практику выделения ПБЛВ-комплексов только в середине прошедшего де­

сятилетия. В начале 60-х гг. при обработке	дигитонином	хлоро­
пластов получили так называемый х л о р	о п л а с т и н,	спектр

которого соответствовал спектру поглощения хлоропластов. Хлоропластин включал в себя пигменты, цитохромы, фосфолипиды,

липиды и белок. При его высушивании обнаружили				различные
по величине (но	не более 1000 А)	частицы. При среднем разме­
ре 200 А частица должна содержать			225 молекул	хлорофилла,
55 — каротина,	одну — цитохрома	и	иметь молекулярный вес
около 106. Хлоропластин проявлял		фотохимическую		активность

сДХФИФ и выделял кислород.

Сэтого времени начинается широкое использование детер­ гентов для выделения различных ПБЛВ-комплексов. Анионные детергенты приводили к образованию более мелких частиц, чем детергенты стероидной природы, однако только после обработки

последними ПБЛВ-комплексы оставались фотохимически актив-

* Выделяемый из наперстянки (Digitalis purpurea) глюкозид дигитонин

ПМЄЄТ ЖИДКОКрИСТаЛЛИЧеСКуЮ ХОЛеСТерИНОВуЮ Структуру (СббИдоОго).

** Алкилфеноксиполиэтоксилэтанол, известный под названием тритона Х-100, имеет в своем составе 9 или 10 оксиэтиленовых групп (молекулярный вес около 625).

ными. Сохранение способности к выделению кислорода из воды при обработке хлоропластов зависит от соотношения дигитонина и хлорофилла [974—979]. При содержании дигитонина выше 0,5% частицы теряли способность к ФФ, хотя сохраняли спо­

собность	восстанавливать НАДФ+			при добавлении			необходи­
мых ингредиентов, включая Пц.
Кан и Банистер [563] применили для экстракции							раствори­
мого пигмент-белкового комплекса 1%-ный					тритон Х-100. По­
следний	не	осаждался	при одночасовом		центрифугировании
(190 000 g).		Содержание	хлорофилла в нем составляло 3—8%
всего хлорофилла хлоропластов. Комплекс					восстанавливал на
свету феррицианид, но не ДХФИФ				или НАДФ+.		Способность
восстанавливать феррицианид, однако, не терялась						после пяти­

минутного кипячения, что указывает на неферментативный ха­ рактер процесса.

Применяя детергенты, необходимо считаться со следующим? в очень низких концентрациях детергенты воздействуют на раз­ ные биоэнергетические реакции хлоропластов без существенного влияния на их структуру; относительно высокие концентрации детергентов фрагментируют хлоропласты на различные по вели­ чине ПБЛВ-комплексы.

Например, было установлено, что дигитонин вызывает ингибирование реакции Хилла [506, 973], но образуемые фрагменты способны осуществлять ЦФФ и фоторедукцию НАДФ+ при до­ бавлении экзогенных доноров электронов [976, 506].

Верной и Шоу [942] показали изменение фотохимических свойств хлоропластов в зависимости от содержания тритона Х-100: концентрация до 0,007% стимулировала фоторедукцию феррицианида и ДХФИФ, обусловленную разобщением ЭТЦ и ФФ, концентрация 0,01—0,02% подавляла перенос электрона на акцепторы, а концентрация выше 0,02% стимулировала фоторе­ дукцию Цит с при наличии триметилбензохинона, фотоокисле­ ние Цит с, а также фоторедукцию НАДФ+ за счет электронодонорной пары АК — ДХФИФ.

Островская и Рейнгард [103] подтвердили, что низкие кон­ центрации дигитонина (0,01 и 0,1%) вызывают активирование реакции Хилла. Однако такая активация длится недолго, зату­ хая с увеличением времени инкубации с детергентами.

Экстракция 1%-ным раствором твина-80 приводит к солюбилизации части белка и освобождению ряда ферментов цикла Кальвина. Додецилсульфат или додецилбензосульфат натрия при добавлении к хлоропластам до конечной концентрации 0,012% в течение нескольких секунд вызывали ингибирование реакции Хилла.

Уже первые опыты с использованием детергентов для фраг­ ментации хлоропластов показали, что выделяемые ПБЛВ-ком­ плексы неоднородны и различаются как по величине частиц, так

и по относительному содержанию в них составных элементов. Детергенты разрушали связи липид — липид и замещали липиды в пигмент-белковых комплексах, поскольку содержание ли-

штдов	в этих частицах (25%) было ниже, чем в хлоропластах
( ~ 3 0 % ) . Кроме того, часть хлорофилла (10—15%)		при приме­
нении	детергентов оказывалась освобожденной из	комплексов.

Отношение Хл/белок зависело не только от концентрации детер­ гентов в средах инкубации, но и от времени инкубации. В част­ ности, это отношение в хлоропластах кукурузы уменьшалось вдвое через 30 ч инкубации с дигитонином [76]. Были обнару­ жены определенные различия в соотношении Хл/белок в зависи­ мости от величины рН, ионной силы и состава среды инкубации хлоропластов с детергентами.

Боардману и Андерсон в 1964 г. [246] удалось так подобрать условия инкубации хлоропластов с дигитонином, что при.даль­ нейшем ступенчатом центрифугировании были выделены фото­ химически активные ПБЛВ-комплексы, относящиеся соответст­ венно к ФС-П или к ФС-І. Эти работы получили широкое раз­ витие во многих лабораториях мира; подробной биохимической характеристике различных ПБЛВ-комплексов посвящен следую­ щий раздел.

Все же детергенты оказываются химически достаточно ак­ тивными веществами, и их включение в частицы вызывает опре­ деленные изменения биохимических и фотохимических свойств. Поэтому были разработаны другие методы дробления тилакоидных мембран, которые (тоже достаточно условно) можно отнести к «мягким» методам. В первую очередь сюда относится фраг­ ментация хлоропластов при озвучивании.

Частицы, полученные этим способом, представляют различ­ ные фрагменты мембран и могут быть как ПБЛВ-комплексамн, обогащенными ФС-І или ФС-Н, так и просто фрагментами мем­ бран различной величины. Такие ПБЛВ-комплексы характери­ зуются прежде всего повышенной активностью реакции Хилла и соответственно утратой способности к ФФ. Степень разобще­ ния зависит от размеров частиц. Меньшие частицы обладают более слабой активностью ФФ [534, 430].

На основании значительного числа исследований [587, 538, 540] можно сделать также вывод, что для частиц, полученных озвучиванием хлоропластов, характерно резкое изменение опти­ мума рН в кислую сторону от рН 8,0 до рН 6,0 с феррицианидом [587] и на 1 ед. рН с НАДФ [538].

Джекоби и Леман [538, 539, 540] подробно рассмотрели условия получения ПБЛВ-комплексов при фрагментации озву­ чиванием, которые приводят к обогащению частицами ФС-І или ФС-П либо к получению обрывков тилакоидных мембран раз­ личной степени дисперсности. Оказалось, что различия во мно­ гом определяются концентрацией соли и временем озвучивания. Выяснилось также, что фотохимические и биохимические свой-

ства «мелких» частиц зависят ог того, выделены ли они из ламелл, находящихся внутри гран, или из ламелл, которые связы­ вают граны между собой или просто выходят за пределы гран.

Михель и Михель-Вольверц [721] для получения ПБЛВкомплексов, относящихся к двум фотосистемам, продавливали хлоропласты на прессе Френча. Хлоропласта из шпината сус­ пендировали в 0,05 М трициновом буфере рН 7,8, содержащем 0,15 М К.С1, и процедуру продавливания через игольчатый вен­ тиль пресса Френча повторяли трижды. ПБЛВ-комплексы, относящиеся к разным фотосистемам, выделяли центрифугирова­ нием в градиенте плотности сахарозы при 60 ООО g. Были отме­ чены три полосы. Отношение Хл а/Хл b в верхней полосе равня­ лось 6,5, а в двух нижних — 2,5. Анализ спектров поглощения и флуоресценции показал, что ПБЛВ-комплексы верхней полосы представляют ФС-І, а нижних — ФС-П.

Недавно Сейн, Гудчайлд и Парк [843] более подробно иссле­ довали биохимические, фотохимические и ультраструктурные особенности частиц, выделенных после дезинтеграции хлоропла­ стов по методу, предложенному Михелем. Сейн с соавт. отмеча­ ли, что при продавливании хлоропластов на прессе Френча не­ обходимо очень тщательно подбирать нагрузки, чтобы фракции после центрифугирования могли обнаружить активность реакции Хилла.

Если сравнить эту процедуру дезинтеграции с процедурой из­ мельчения хлоропластов путем инкубации в растворе дигитонина, то оказывается, что после продавливания в супернатанте фракции 160 000 g находится менее 2% всего хлорофилла про­ тив 11% во фракции 144 000 g по способу фрагментации с дигитонином. Следовательно, процедура дезинтеграции хлоропластов без применения детергента представляется более «мягкой».

Принципиальной особенностью разрушения хлоропластов с помощью пресса Френча является фрагментация в первую оче­ редь тех ламелл, которые выходят за пределы гран и находятся в строме, что четко подтверждается электронномикроскопическим контролем. Поэтому при центрифугировании удается отде­ лить ламеллы стромы от ламелл, входящих в состав гран.

Ташики, Парлетте и Пону [893] недавно удалось успешно использовать метод замораживания и оттаивания хлоропластов для выделения частиц, обогащенных ФС-І и ФС-П. Хлоропласты пятикратно последовательно экстрагировали в растворе 0,01 М Na 2 HP0 4 (рН 8). Каждый раз перед ресуспендйрованием в 0,01 М Na2 HP04 осадок хлоропластов переводили в 0,1 М NaCl и в этом растворе замораживали повторно на три недели при

•—10° С. Авторы указывали, что при «недостаточном	старении»
выделить ПБЛВ-комплексы не удавалось. Суспензии	хлоропла­

стов после размораживания при 0—5° С ресуспендировали в 0,01 М Na2 HP04 с добавлением сухого хлористого натрия и цен­ трифугировали 30 мин при 35 000 g. ПБЛВ-комплексы выделяли

из надосадочной жидкости после добавления восстановленного глутатиона (0,3 мг/мл) и сернокислого аммония (79 мг/мл). Спустя 1,5 ч раствор вновь центрифугировали при 27 000 g, оса­ док отбрасывали, а супернатант доосаждали сернокислым аммо­ нием (54 мг/мл). Очистку и разделение осадка по ряду призна­ ков на комплексы, относящиеся соответственно к ФС-І и ФС-П, проводили после обессоливания осадка на сефадексе G-200 и 15-часового центрифугирования фильтрата в градиенте плот­ ности сахарозы при 89 ООО g.

Описанный метод (или его модификация), несмотря на его сложность, может оказаться перспективным для выделения ПБЛВ-комплексов без помощи детергентов, озвучивания или пресса Френча, однако необходимо обратить внимание на сохра­ нение фотохимических свойств выделяемых частиц.

Успехи в выделении	ПБЛВ-комплексов, относящихся к ФС-І
и ФС-П, дополнительно	стимулировали	исследования	по изуче­
нию химического состава выделяемых		с помощью	различных

процедур частиц. Бейли, Тернбер и их сотрудники [907, 908, 909] изучили химический состав частиц пигмент-белковых комплек­ сов, выделяемых из тилакоидов хлоропластов шпината, свеклы, синезеленых водорослей и зеленых бактерий. ПБЛВ-комплексы получали путем последовательного замораживания и оттаива­ ния хлоропластов, после многократной экстракции с помощью додецилсульфата или додецилбензосульфата натрия в 0,05 М боратном буфере (концентрация детергента составляла 0,5%, а соотношение детергент : хлорофилл — 2,5:1 (повесу)).

Как методами электрофореза, так и ультрацентрифугирова­ нием из высших растений и зеленых водорослей было выделено по два идентичных ПБЛВ-комплекса. Один из них был обо­

гащен Хл а ( й = 12J

и содержал П700, другой содержал

примерно равные количества

ружены отличия и в составе каротиноидов. Анализ выделенных из этих двух комплексов белков выявил высокое содержание в них неполярных аминокислот (аланина, валина, лейцина и изолейцина), более высокое в первом. Оба комплекса оказались гликопротеидами.

При разделении хлоропластов на субъединицы, относящиеся

к ФС-І и ФС-П, соотношение в них этих		двух комплексов ока­
залось неодинаковым: ФС-І содержит больше			первого комплек­
са, чем второго, а ФС-П — наоборот. Комплекс I легче				экстра­
гировался из матрикса ламелл,	чем комплекс		I I . Белки,	входя­
щие в состав этих комплексов,	составляют		75% всех	белков
ламелл. Молекулярный вес комплекса I больше молекулярного
веса комплекса I I , так как их константы		седиментации		равны
соответственно 9S и 2—3S. Одновременно		в ходе электрофореза

на полиакриламидном геле, наряду с двумя пигмент-белковыми

комплексами, были выявлены две зоны белков, не связанных с хлорофиллом.

Попытки разделить эти два главных ПБЛВ-комплекса на субъединицы были предприняты в разных лабораториях [778, 872, 907]., Для разрушения на более мелкие частицы использо­ вали высокие концентрации детергентов. Разделение проводили на колонках с ионообменни-

ками

или

же

использовали

Д отпей

і

гельэлектрофорез.

Д

I

Бриантэ

[268],

Верной

[939J и Весселс [980] отме­

чали, что при действии на

хлоропласта

детергентов с

последующим

разделением

фрагментов

центрифугирова­

нием

Цит

/

обнаруживается

в составе

отдельной полосы,

не

принадлежащей

ПБЛВ-

комплексам ФС-І или ФС-П.

Выше отмечались трудности,

с

которыми

сталкиваются

исследователи

при

выделе­

нии

цитохромов,

особенно

і—

і

.

•

Цит Ьз и Цит Ь6 из хлоро­

400

500

600

700 Я,т

пластов

высших

растений.

По-видимому,

применение

Рис. 31. Разностные

спектры

поглощения

детергентов может оказаться

осадка ФПНР из хлоропластов гороха.

перспективным для

выделе­

В «пробу»

внесен

окислитель — фер­

рицианид

(1),

избыток

слабого восстано­

ния не только Цит /, но и

вителя— аскорбата

(2), избыток сильно­

Цит &б, который, как и Цит f,

го восстановителя — гидросульфита (3).

частично

находится

вне

П Б Л В-комплексов.

Трудно,

однако, предугадать, явится ли такой путь оправданным для пре­ паративного выделения этих цитохромов. Во всяком случае, при­ менение анионных детергентов используется для солюбилизации и выделения цитохромоксидазы из животной ткани [98].

Для выделения цитохромов группы Ъ из зеленых тканей пер­ спективным может оказаться и иной путь. Обработка хлоропла­ стов или целых листьев тремя объемами ацетона по методу вы­ деления Фд приводит к получению раствора и осадка после стадии диализа, как это описано на стр. 130. Фд, Пц и Фп пере­

ходят	в раствор,		а цитохромы группы Ъ, как было показа­
но в нашей лаборатории, составляют					весьма значительную часть
осадка	(ФПНР)		после	отделения	раствора	центрифугирова­
нием.
На рис. 31		представлены разностные спектры поглощения
осадка	ФПНР,	которые		четко указывают на		присутствие в ней