книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

На возможность существования двух типов ФС-І указывали несколько ранее Дюйсенс [353] и Элстнер с соавт. [363]. По­ следние изучили роль Пц и Цит f из эвглены в качестве доноров электронов при фоторедукции НАДФ+ ПБЛВ-комплексами, вы­ деленными при фрагментации хлоропластов с помощью дигито­ нина или путем озвучивания. С хлоропластами, фрагментированными дигитонином, Цит / способен заменить Пц в качестве до­ нора электрона. Наоборот, с частицами, также относящимися к •ФС-І, но полученными после «мягкого» озвучивания, Пц явля­ ется значительно лучшим донором при фоторедукции НАДФ+, чем Цит / из эвглены.

Объясняя эти данные, Элстнер с соавт. [363] пришли к за­ ключению, что существует две формы ФС-І: одна участвует в циклическом транспорте электронов н Цит f является компонен­ том этой системы, а другая форма — в нециклическом транспор­ те, причем здесь компонентом выступает Пц. В связи с этим за­ манчиво предположить, что легкоподвижный Пц является в не­ которой мере регулятором транспорта электронов. Кроме того, данные Элстнера хорошо согласуются с гипотезой Кнаффа и Арнона.

Джекоби и Леман [540] отмечали высокую скорость фото­ редукции НАДФ4 - с полученными озвучиванием ПБЛВ-комплек­ сами ФС-І при внесении в систему Фд, Пц и Фп, причем макси­ мальная скорость получена при добавлении АК без ДХФИФ; необходимости в добавке ДХФИФ не было. Зато при фрагмен­ тации с помощью дигитонина добавление этого красителя для восстановления НАДФ+ было необходимо, тогда как внесения XIц не требовалось.

Джекоби и Леман [540] высказывают предположение, что легкие частицы, освобождаемые из межгранных ламелл при «мягком» озвучивании, когда во фракции оказывался только 1 %'

всего хлорофилла, ответственны за циклический		тип	переноса
электрона, но к осуществлению реакции	Хилла	не	способны.
Вместе с тем детергенты освобождают	какой-то другой тип
ФС-І из ламелл, расположенных внутри	гран, когда		в составе
ПБЛВ-комплексов оказывалось уже 80%	всего хлорофилла. По­

следние для восстановления НАДФ+ нуждаются в электронодонорной паре АК +ДХФИФ . Эти авторы весьма серьезное внимание уделяют значению ионной силы среды при озвучива­ нии. Фотохимические свойства частиц, полученных при озвучива­ нии в 2 % - г о м растворе хлористого натрия, отличны от озвучен­ ных в 0,2%-ном растворе этой соли. В первом случае стопки гран сохраняются лучше. При увеличении времени озвучивания, как и при озвучивании среды с низкой ионной силой, частицы из ла­ мелл внутри гран или из межгранных ламелл распадаются на мелкие фрагменты, способные поддерживать реакцию Хилла с феррицианидом, а в присутствии Пц — и с НАДФ+.

В ходе обсуждения этих работ, допуская наличие двух типов ФС-1, следует в качестве альтернативы не упускать из виду возможность самого эффекта озвучивания. Нельзя исключить возможность и того, что во время озвучивания физически одно­ родные частицы были повреждены в разной степени. В частности, Мурата и Браун [745] отмечали различия между ПБЛВкомплексами ФС-І в потребности в Пц для поддержания высо­ ких скоростей фоторедукции НАДФ+, полученными фрагмента­ цией в присутствии детергентов — дигитонина [166] или трито­ на Х-100 [943], озвучиванием [539, 540] и по способу Михелей.

Михель	и Михель-Вольверц [722] после центрифугирования
в градиенте	плотности сахарозы хлоропластов, разрушенных с

помощью пресса Френча, получили три зоны. Одну из зон, на

основании данных фотохимических	тестов, они	отнесли к ФС-1,
а две других — к ФС-П. Последние,	по мнению	авторов, хими­

чески не отличались, хотя по удельным активностям фоторедук­ ции НАДФ+ несколько различались.

Мурата и Браун [745], использовав такой способ выделения, добились значительно лучших показателей по скоростям отдель­ ных фотохимических реакций из разных фракций, что было до­ стигнуто после уточнения оптимумов рН этих реакций.

Худзисидже и соавт. [527] провели эксперименты по очистке ПБЛВ-комплексов ФС-П. По их мнению, очистка центров ФС-П значительно сложнее, чем очистка реакционных центров ФС-1. Описанная процедура включала выделение хлоропластов из шпи­ ната и комбинацию методов озвучивания, обработки дигитони­ ном и обработки тритоном Х-100. Оказалось, что дигитонин бо­ лее удобен при выделении ФС-1, тогда как тритон Х-100 пред­ почтительнее при выделении ФС-П. Озвучивание в процессе инкубации с дигитонином облегчает выход фракций без потери активности.

Перед разделением ПБЛВ-комплексов методом дифференци­ ального центрифугирования эти авторы применяли центрифуги­ рование в градиенте плотности сахарозы, которое не требовало много времени, но улучшало качество последующего разделения методом дифференциального центрифугирования. Было отмечено, что фильтрация через гель-сефадекс эффективна при разделении частиц, сильно различающихся по размерам, поэтому данный метод применяли только на ранних стадиях работы.

Изучение условий выделения ПБЛВ-комплексов, относящих­ ся к ФС-1 и ФС-П, и их дальнейшей очистки с выделением реак­ ционных центров двух фотосистем оказалось непосредственно связанным с реконструкцией ЭТЦ от воды до НАДФ+.

Такую реконструкцию	осуществляли в Японии Худзисидже
и во Франции Бриантэ.	Очистку ПБЛВ-комплексов ФС-1 и

ФС-П с последующей реконструкцией полной цепи транспорта электрона проводили следующим путем. Худзисидже с соавт. [527] фрагментировали хлоропласты шпината инкубацией с

0,25%-ным дигитошшом (4 мг дигитонина : 1 мг Хл) в течение 40 мин при 0° С, затем озвучивали 30 сек при 20 килоциклах. Ме­

тодом последовательного центрифугирования при 2000 g	(20	мин),
12 000, 30 000 и 70 000 g (по 30 мин) и 144 000 g	(60	мин)

получили соответствующие осадки, которые ресуспендировали в 0;017 М rpwc-буфера рН 7,2. «Тяжелые» фрагменты (12 000 g)

инкубировали в течение 20 мин с 0,2% тритона			Х-100 при темпе­
ратуре 0° С	(0,5 мг Хл/мл) и снова	озвучивали, но уже в тече­
ние 15 мин.		12 000 g	30 мин. Осажден­
Препарат	центрифугировали при

ные частицы ресуспендировали в малом объеме буфера и разде­ ляли центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (15—50%) при 70 000 g в час. Получались четыре зеленые поло­ сы с высоким отношением Хл а/Хл b в двух верхних и низким (2,0) — в двух нижних полосах. Эти две нижние полосы препа­ ративно отделялись разрезанием пробирок в специальном уст­ ройстве, причем нижний слой частиц представлял высокоочпщенную ФС-П, что показано с помощью спектральных, фотохи­ мических и биохимических тестов. Так, фракция была способна выделять Ог со скоростью 49 мкмоль 1мг Хл-ч и была активна в реакции Хилла с ДХФИФ, но не с НАДФ+, независимо от на­ личия искусственных доноров электрона. В нижних фракциях удалось обнаружить только один цитохром — Цит 559.

Удалось частично реконструировать ЭТЦ по восстановлению НАДФ+ смешиванием фракции ФС-П и ФС-І с добавлением Пх А, Пц, Фд и Фп. Скорость восстановления НАДФ+ в этом случае достигла 48 мкмоль/мг Хл-ч. В роли ФС-І выступали частицы фракции 144 000 g. Таким образом, удалось добиться реконструкции ЭТЦ, используя хорошо очищенные ПБЛВ-комп- лексы ФС-І и ФС-П. Следует подчеркнуть, что в составе рекон­ струированной системы были именно ПБЛВ-комплексы, а не очищенные реакционные центры обеих фотосистем.

Прямые доказательства возможности реконструкции физиче­ ски разделенных с помощью детергентов фотосистем получены также Бриантэ [266—268]. Порознь выделенные ПБЛВ-комп­ лексы, обогащенные ФС-І и ФС-П, были смешаны снова в раз­ личных пропорциях. После 10 ч инкубации проводилось разде­ ление центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Был выделен ПБЛВ-комплекс, в котором отношение Хл а/Хл Ъ со­ ответствовало отношению в целых хлоропластах. О реконструк­ ции можно было судить по восстановлению цепи переноса элект­ рона от воды до НАДФ+, а также по проявлению эффекта усиления.

При исследовании под электронным микроскопом было по­ казано, что дигитонин или тритон Х-100 изменяют структуру гран. Отличия между частицами, выделенными из хлоропластов в результате механического разрушения или действия детерген­ тов, обнаруживались и в биохимических свойствах.

Вописанных работах по реконструкции ЭТЦ обращает на се­ бя внимание роль детергентов как «заместителей» части липидов.

Влаборатории Бенсона [554а, 555, 230а] значению липидов для реконструкции фотохимического аппарата уделяется особое внимание. Липидные компоненты мембраны хлоропласта доволь­ но немногочисленны и относительно просты по структуре, они включают моно- и дигалактолипиды, сульфолипиды и фосфатидилглицерол. Их удаление может быть достигнуто экстракцией мем­ бран холодным 70%-ным ацетоном, так как связи белка, липи­ дов и пигментов носят гидрофобный характер. Показателем нарушения этих связей в нативных комплексах служат, в част­ ности, сдвиги в максимумах поглощения. Используя такой инди­ катор, Джн и Бенсон [554а] смогли доказать обратное воссо­ единение р-каротина и белка в каротинбелковый комплекс после их диссоциации при действии на нативные структуры органиче­ скими растворителями. Авторы подчеркивали, что мембранные белки не пересекаются дисульфидными связями и после обра­ ботки липопротеидов с применением ступенчатой экстракции аце­

тоном и гексаном имеют сравнительно низкий	молекулярный
вес — около 25 ООО. Поэтому они оказываются	устойчивыми к

денатурирующему действию метанола. Джи, Хесу и Бенсону уда­ лось добиться реассоциации каротин-протеида путем суспендирования белка в метаноле (после озвучивания) в диализационном мешочке внутри другого мешочка с метаноловым раствором каротина. Спустя 10 ч диализа равновесие нарушали, помещая систему для диализа в водный метанол, и после снижения кон­ центрации во внутреннем мешочке до 60% диализ прекращали. Таким образом, в метаноловом растворе гидрофобные группы белка и липида легко ассоциировали, а при уменьшении кон­ центрации в растворе метанола сохраняли близкую к нативной пространственную организацию; прогретые белки такую способ­ ность утрачивали.

Недавно из лаборатории Бенсона появилось сообщение [230а] о реконструкции липопротеида, содержащего Хл, в том числе П700, способного к фоторедукции низкопотенциального красителя метилового красного. Показано также, что скорость фоторедукции ДХФИФ этим комплексом в три — пять раз пре­ вышает скорость фоторедукции с одним Хл, солюбилизированным в 2%-ном тритоне Х-100, и дополнительно повышается вдвое при внесении в систему Пц и Фд, хотя для проявления им максимальной активности фоторедукции требовалось внесение тритона Х-100. Пигментбелковый комплекс получен суспендированием структурного мембранного белка в 80%-ном ацетоне в

присутствии	липидов	и пигментов с последующим снижением
концентрации	ацетона	в растворе до 65% (за 16 ч). Работу про­
водили при —10° С.
її*		163

Удалось установить, что с каждой молекулой мембранного белка (молекулярный вес 23 000—28 000) может быть связано около тридцати углеводородных цепей (например, молекул хло­

рофилла).
Итак,	можно сделать вывод, что при определенных условиях
удается	восстановить — частично или полностью — ЭТЦ	от Н2О
до НАДФ+. Достигнуты большие успехи в изолировании		частиц,
относящихся к двум фотосистемам. Ведется интенсивная		работа

по выделению ПБЛВ-комплексов и очистке реакционных цент­ ров, и одним из главных направлений исследований остается дальнейший поиск естественных линий раздела биоэнергетиче­ ского аппарата.

Таков путь, который пройден в изучении реакции Хилла за 30 лет, .

Ч а с т ь ГУ

АНАЛИЗ И РЕКОНСТРУИРОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ФОТОФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

В части I было дано описание феномена ФФ в хлоропластах

без попыток разобраться в деталях		механизмов реакций,
которые	приводят к образованию АТФ.	АТФ	выбран	здесь
потому,	что это вещество — наиболее важное		соединение	для

всех форм жизни на Земле, если вообще можно говорить о «наиболее важном» соединении из ряда всех тех веществ, на­

личие	которых определяет	совокупность протекания процессов
жизни	в целостной системе [87]. И		все-таки	именно	адено-
зин-5'-трифосфат участвует		в многочисленных реакциях			обмена
веществ на всех уровнях,		независимо	от пути	образования —

в результате дыхания, брожения, фотосинтеза или как-нибудь иначе. АТФ снабжает энергией процессы биосинтеза, протекаю­ щие во всех организмах, и тем самым обеспечивает возможность совершения жизни.

Открытие ФФ как характерного для растений процесса обра­ зования АТФ сделано в 50-х гг., и уже в течение последующего десятилетия накопилось много сведений о главных чертах этого процесса. На первом этапе исследований потребовалось накоп­ ление экспериментального материала относительно протекания процесса ФФ в целых хлоропластах, причем по сути исполь­ зовались физиологические методы изучения применительно к изолированным хлоропластам. Иначе говоря, на первых порах изучение феномена ФФ проводилось по тому же историческому и логическому пути, по которому шло изучение фотосинтеза в целом.

До недавнего времени все попытки вмешательства в меха­ низм образования АТФ теми методами, которые используются

в энзимологии,		с дроблением хлоропластов или гран, приводили
к	потере самой	функции ФФ. Реконструкция процесса			касалась
в	основном использования различных		субстратов,	и	особенно
кофакторов ФФ. В целом хлоропласты			выступали	как	«единый
фермент».

Такие работы были начаты в 60-х гг. Был открыт ряд различ­ ных механизмов образования АТФ. Удалось показать, что ФФ может зависеть от перемещения протона через мембрану, при­ чем свет предопределяет условия неравномерного распределения ионов, и особенно протонов, по обе стороны мембран. Было уста­ новлено также, что освещение хлоропластов вызывает обрати­ мый рост величины рН в суспензионной среде и образование

высокоэнергетического состояния ХЕ. Количество образованного ХЕ определяется по количеству синтезированного АТФ в после­ дующий период темноты. Такой процесс можно условно назвать

дв у х с т у п е н ч а т ы м ф о с ф о р и л и р о в а н н е м [207]. Были изучены также условия проведения искусственного

двухступенчатого процесса, совершенно не требующие света для образования АТФ хлоропластами. При экспонировании хлоро­

пластов в среде с некоторыми		органическими кислотами			при
рН 4 и перенесении их затем в среду с рН 8, содержащую					АДФ
и Ф„, также происходит	образование		АТФ. Наконец,	открыты
механизмы образования	АТФ в	чисто	бесструктурной	системе.

Следует подчеркнуть, что в определенных условиях эксперимен­ тов образование АТФ происходит в присутствии Цит с, выпол­ няющего важную каталитическую роль.

В то же время —на протяжении 1962—1965 гг.— был открыт феномен изменения объема хлоропластов при действии света. Таким образом, обнаружен целый ряд путей, ведущих к обра­ зованию АТФ, причем между многими, казалось бы совершен­ но не связанными, процессами намечаются общие черты. Синтез макроэргических фосфатных связей происходит за счет исполь­ зования освобождающейся энергии различных окислительновосстановительных реакций независимо от абсолютного значе­ ния уровня редокс-потенциала этих систем. Процессы окисли­ тельного и фотосинтетического фосфорилирования, или, как иногда их называют, «электронотранспортное фосфорнлирование», затрагивают, согласно утвердившимся представлениям, пе­

ренос двух типов частиц — электронов и протонов,	а также
включают этап дегидратации с образованием АТФ.
Решение проблемы фосфорилирования состоит в раскрытии
последовательностей реакций, реализующих перенос	электро­

нов и протонов, или конформационных переходов в образование макроэргической фосфатной связи в молекуле АТФ. В этой же части монографии разбираются теории и некоторые эксперимен­ тальные данные, касающиеся отдельных реакций, осуществление которых приводит к образованию АТФ при фотосинтезе.

1. ГИПОТЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ СОПРЯЖЕНИЯ ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

Умозрительные схемы сопряжения электронного транспорта и фосфорилирования предлагались неоднократно. И для ды­ хания, и для фотосинтеза процесс фосфорилирования можно представить следующим образом.

Процесс химического сопряжения начинается с восстановле­ ния переносчика электрона А, который входит в ЭТЦ:

A-f-e- -*- А е - .

Присоединение электрона повышает электронную плотность на редокс-группе дыхательного переносчика А, тем самым уве­ личивая сродство переносчика Ае~ к компоненту сопряжения, несущему электрофильный центр 6+ [87]. Этот электрофильный центр атакуется нуклеофильной группой переносчика Ае~. В результате происходит соединение переносчика с компонентом сопряжения [126]. При окислении этого продукта реакции плот­ ность электронов уменьшается, и связь между партнерами ста­ новится неустойчивой. Данная схема была предложена Липманом [667] еще в 40-х гг. и представляется сторонниками химической теории сопряжения более упрощенной, чем она долж­ на быть в действительности, так как уже первичное соединение, согласно данному типу схем, содержит фосфат. По современ­ ным представлениям, присоединение фосфата лишь завершает процесс.

Ягендорф и Юрайб [549] рассматривают одну из таких обычных гипотетических схем сопряжения между транспортом электронов и фосфорилированием в виде следующих пяти урав­ нений:

	АН 2 + В - > ВН2 + А
		ВН2 + I -*- ВН2 — I
	ВН2 —I + С ->• В~1 +			СН2
	В~1 + Фн ->• Ф н ~ 1 +			В
	Ф Н ~ І + АДФ - * АТФ +			I
АН2 + С + АДФ +			Ф„ -»- А + СН2 + АТФ.
В этой схеме	(рис.	37)	А, В и С являются			электронными
переносчиками, причем		в результате переноса электрона от А
к С освобождается энергия. При не очень строгом						рассмотрении
восстановленная	форма	комплекса В реагирует				легко и обра­
тимо с некоторыми другими			компонентами		(ферментами), на­
званными I , а затем именно			комплекс B H 2		— I в	соединении с
новым компонентом С является донором электрона							для С. При
этом связь ВНг — I в процессе окисления становится							макроэрги-
ческой, причем на	последнем		этапе реакции		обмена		она перено­

сится на АДФ. Согласно этой простой гипотезе фосфорилирования, при окислении переносчика компоненты — участники реак­ ции типа В и I — должны, в конечном итоге, существовать в не­ связанном виде, следовательно, быть в какой-то мере стабильны­ ми. В данном случае их можно было бы, в принципе, выделить в чистом виде. Логично допустить, что если комплекс В ~ I ста­ билен в хлоропласте, то поток электронов не может «нормально течь» до тех пор, пока не произойдет освобождения В в резуль­ тате реакции комплекса с Ф н и АДФ.

Промежуточные стадии переноса вовлекают гипотетические вещества. Скулачев отмечал [126], что своим проявлением они обязаны в значительной мере опытам с применением

ингибиторов, и хотя применение ингибиторов часто позволяет рас­ членить сложную последовательность реакций на отдельные звенья, сами они не могут дать точных сведений о природе реа­ гирующих веществ, в связи с чем неизвестные компоненты системы переносчиков приходится обозначать условными сим­ волами. Скулачев в своей монографии ([126], стр. 100—102)

Рис.	37. Схема	химического		пути сопряжения электрон­
ного	транспорта	и	фосфорилирования.
подробно анализирует		состояние		вопроса о механизме	сопряже­
ния, относящегося к окислительной цепи, и «эпопею»,					связанную
с появлением	большого		числа	символов, и нам нет нужды по­

вторять это. Суть дела состоит в том, что представленные схемы пока не могут претендовать на сколько-нибудь точное описание феномена фосфорилирования как на животных, так и на расти­

тельных объектах. С таких же позиций эта проблема	освещалась
в монографии Рэкера [115].
Итогом большого числа работ по расшифровке	механизма

окислительного фосфорилирования (проведенных на животных объектах) явились следующие заключения [126]:

1. В препаратах не удается обнаружить соединение, в ко­ тором совмещались бы свойства переносчика электрона со свой­ ствами переносчика энергии.

. 2. Фосфат не участвует в образовании первого высокоэнерге­ тического соединения.

3.Среди переносчиков энергии дыхательного фосфорилиро­ вания не удается идентифицировать какие-либо специфические коферменты, помимо адениннуклеотидов.

4.Невозможно перевести ферменты фосфорилирующего ды­ хания в раствор без потери сопряженности между переносом электрона и фосфорилированием.

Сформулированные выше заключения негативного характера определили необходимость поиска новых путей раскрытия тайны образования АТФ. Успехи в электронномикроскопических ис­ следованиях на митохондриях и хлоропластах заставили обра­ тить серьезное внимание на значение строения мембранной си­ стемы для преобразования энергии.

Возможность синтеза молекулы АТФ в результате конформационных изменений молекул или изменений электростатических свойств мембран неоднократно обсуждалась в литературе 50-х гг. [126]. Наиболее решительная попытка оторваться от догматизма химических схем образования АТФ была сделана на рубеже 60-х гг. Митчеллом. Основной чертой его «хемиосмотической», первоначально казавшейся фантастичной концепции является отсутствие необходимости в особом интермедиате, функциониру­ ющем одновременно в редокс-цепи и цепи транспорта энергии. Роль связующего звена играет сама мембрана благодаря ани­ зотропным свойствам и способности к накоплению и сохранению потенциала ионов по обеим своим сторонам.

Хемиосмотическая теория Митчелла освещается в значи­ тельном количестве работ [726—728, 543, 446]. Первый вариант ее, основанный на теоретических посылках, опубликованный в 1961 г. [725], предусматривал простую организацию компонен­ тов, а также такое сопряжение, при котором не требовалось бы

большого		числа интермедиатов типа	В ~ 1 , как	в	приведенных
выше	схемах. Вариант сопряжения		без интермедиатов			типа
В ~ 1	был	сформулирован Митчеллом	потому,	что	их, по	его

мнению, в природе не существует *.

В дальнейшем хемиосмотическая гипотеза претерпела весьма существенные изменения. Основу ее составляют четыре сформу­ лированных Митчеллом постулата. Смысл первого постулата заключается в том, что перемещение протонов связано с обрати­ мым действием АТФ-азы в мембране, а второго — в том, что перемещение протона связано с окислительно-восстановитель­ ными изменениями.

* Следует отметить, что теория	Митчелла возникла не	на	пустом месте,
а явилась последовательным развитием представлений Лунда			[675],	Люнде-
гарда [676], а позднее — Робертсона	[821].
Характерным для концепций этих и некоторых других		авторов		было то,
что особое внимание уделялось роли	мембран как полупроницаемых			барьеров
и роли протонов в процессах переноса	энергии. Так, согласно	Робертсону [821],

митохондриальная мембрана непроницаема для протонов. Дыхательные пере­

носчики	инициируют перемещение ионов, разделяя ионы Н+ и О Н - по обе
стороны	мембраны.