книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

Оказалось, что глицерин во всех взятых концентрациях уси* ливал и стабилизировал реакцию Хилла в течение суток. Эта­ нол в концентрации 10% также усиливал реакцию Хилла спустя сутки. Остальные вещества оказались неэффективными. Итак, было показано, что сахароза и некоторые соли стимулируют или сохраняют активность реакции Хилла при выделении хлоропла­ стов в описанных средах, а из органических растворителей толь­ ко глицерин способствует сохранению фотохимической активнос­ ти в течение десятков часов при температуре, близкой к нулю.

0,05 г

Рис. 11. Влияние органических растворителей на активность реакции Хилла с феррнцианндом в роли окислителя в зависимости от кон­ центрации [151].

/ — контроль		(с водоП),	/ / — контроль (0,02 М грис-НСІ-буфер), / / / — ацетон.
/V —этанол,	I' — метанол.		VI— глицерин.	VII — гексан:/—10, 2—20,	3—40%-ная
концентрация;		а — сразу	после добавления	растворителя, б — после	инкубации

с растворителем в течение суток при 4° С.

Повышение температуры инактивирует ФФ и реакцию Хилла. По данным Эммета и Уолкера [370], нагревание до 50° С в те­ чение 50—60 сек не влияло на выделение 0 2 хлоропластами или увеличивало его, причем прогретые хлоропласты оказались ме­ нее чувствительными к действию хлористого аммония (класси­ ческого разобщителя ФФ). Такое «термическое разобщение» ав­ торы объясняют разжижением липидной компоненты и соот­ ветственно изменением проницаемости мембран тилакоидов, что согласуется с хемиосмотической теорией механизма фосфорилирования Митчелла (см. часть IV) .

Пакер и Барнард [787] полагают, что наиболее лабилен про­
цесс	образования АТФ. Затем в порядке возрастания устойчи­
вости	следует фотогидролиз АТФ, способность к конформацион-

ным изменениям и фотовосстановление НАДФ+.

Хотя процесс ФФ более лабилен, чем перенос электрона, воп­ рос об относительной стабильности отдельных биоэнергетических реакций хлоропластов еще не решен окончательно. Его система­ тическое изучение зависит от решения задачи получения актив­ ного и стабильного при хранении материала. К настоящему вре­ мени собрано больше сведений о длительном сохранении хлоро­ пластов без инактивации, чем о механизме стабилизирующего действия защитных веществ.

Эмпирически было установлено, что хорошим стабилизато­ ром фотохимических систем хлоропластов при температурах,

близких к 0° С, является бычий сывороточный альбумин. В его присутствии сохраняется высокая активность сопряжения ЭТЦ и ФФ, однако белок не стимулирует активности хлоропластов, инактивированных продолжительным хранением. Яичный аль­ бумин также причислен к разряду стабилизаторов, но не акти­ ваторов. Его стабилизирующее действие, открытое на митохонд­ риях, объясняют связыванием свободных жирных кислот, вы­ свобождаемых при хранении митохондрий или хлоропластов [804, 808, 809]. Однако, по-видимому, такое объяснение стабили­ зирующего эффекта альбумина является неполным. Вассерман и Флейшер [969] показали, что добавление бычьего сывороточ­ ного альбумина к суспензии хлоропластов шпината или промы­ вание хлоропластов в растворе альбумина не восстанавливает активности реакции Хилла. Не было также обнаружено увели­ чения числа свободных жирных кислот или полярных лнпидов при хранении хлоропластов.

Внесение 9 мг бычьего сывороточного альбумина на 1 мл су­ спензии хлоропластов (2 мг хлорофилла) сохраняет активность реакций Хилла и НФФ в течение нескольких дней при 0° С [969].

По мнению Фридландера и Ныомана [399], сывороточный альбумин, напротив, стимулирует биоэнергетические реакции, способствуя более полному использованию промежуточного нефосфорилированного предшественника АТФ. Однако, если да­ же предположить, что такое объяснение правильное, речь опятьтаки может идти только о стабилизации реакций ФФ или тран­ спорта электронов, но не о стимулирующем эффекте белка на фотореакции.

Механизм защитного действия сахарозы как достаточно вы­ сокомолекулярного гидроксосоединения, вероятно, близок к ме­ ханизму действия сывороточного альбумина. Ленинджер [655] считает, что ОН-группы обеспечивают взаимодействие сахарозы с поверхностными слоями мембраны субклеточных структур, в результате чего создается защитный слой из молекул сахарозы, который и стабилизирует мембрану. В солевых инкубационных растворах активные ионы могут конкурировать с сахарозой и оттеснять ее. Предполагают, что сахароза отчасти предотвращает проникновение веществ, подавляющих ФФ. Как видим, объяс­ нение защитного действия сахарозы также не выходит за рамки весьма общих представлений.

Наиболее значительные успехи в практическом решении про­ блемы стабилизации функций фотосинтеза в изолированных хло­ ропластах достигнуты в связи с применением глицерина в соче­ тании с очень низкими температурами хранения. Еще в 1949 г. появилось сообщение о применении глицерина для замора­ живания и сохранения в нем спермы [803]. По-видимому, глицерин обеспечивает «благополучный» переход точки

4*

51

замерзання биологических структур, связывая «свободную» воду. Химические особенности глицерина (наличие незамещенных оксигрупп) позволяют считать правомерными по отношению •к нему представления о защитном действии сахарозы.

Способствуя

сохранению

без

денатурации биологических струк­

тур при очень низких температу­

рах, глицерин к тому же не яв­

ляется

помехой

для биоэнергети­

ческих

реакций

фотосинтеза. По­

этому не требуется его отмывка.

Отметим и еще одно свойство

глицерина. Глицерин

обеспечива­

ет переохлаждение

биологических

объектов

без

кристаллизации,

что весьма ценно для спектроско­

пии

при

низких

температурах.

Так,

пики

цитохромов

в

смесях

с 50%-ным глицерином при тем­

пературе

жидкого

азота

стано­

вятся более сильными и резкими,

и

это

явление

используется

в

практических

исследованиях

[255].

Пакер и Барнард в 1966 г.

[787]

обнаружили, что неотмытые

хлоропласты

шпината

сохраняют

активность ЦФФ и НФФ в тече­

ние нескольких недель при сохра­

нении в 50%-ном глицерине при

температуре —20° С.

В 1968 г. Вассерман и Флен-

шер

[969]

рекомендовали

хра­

нить

хлоропласты

при

темпера­

туре —20° С в

10%-ном

глицери­

не

и при

внесении

9 мг

бычьего

сывороточного альбумина

на

1 мл

суспензии. В том же 1968 г. опре­

деленный вклад в решение проб­

Рис.

12.

Электронномикроско

лемы

хранения

изолированных

пнческая

фотография хлоро

хлоропластов

без

изменения

ак­

пласта

шпината, X 40 000.

тивности ФФ

внесли Р. М. Беки-

на

и А. А. Красновский

[13],

ре­

комендовавшие хранить хлоропласты в смесях с 50%-ным гли­ церином при температуре твердой углекислоты или под слоем жидкого азота, В этих условиях активность хлоропластов сохра­ нялась в течение многих месяцев. Состав солевой среды при выделении хлоропластов особой роли не играл.

Рассмотрим вкратце структурную организацию хлоропласта. Хлоропласты высших растений довольно разнообразны по размерам и форме, но чаще представляют уплощенные диски диа­ метром до 5 мк и толщиной до 1 мк [44].

Рис. 13. Электронномикроскопическая фотография фототрофного штамма хлореллы (Chlorella vulga­ ris, штамм 62/36).

Пиреноид сходится по краям, четко выражена хо­ рошо развитая ламеллярная структура.

На рис. 12 представлена электронномикроскопическая фото­ графия среза хлоропласта шпината. Четко видны ламеллы (тилакоиды, по терминологии Менке), собранные в так называемые граны, и отдельные ламеллы, выходящие за пределы гран или связывающие граны между собой. Все ламеллы имеют двух­ слойную структуру.

Одноклеточные зеленые водоросли — хлорелла и дуналиелла — имеют по одному чашеобразному хлоропласту — пиренои­ ду (рис. 13), к стенкам которого прилегает оболочка водоросли, так что основное содержимое этих одноклеточных организмов находится как бы внутри «чаши». Хлорелла имеет прочную цел­ люлозную оболочку, дуналиелла таковой лишена.

Еще 15 лет назад те образования внутри хлоропласта, на­ личие которых на сегодня не вызывает сомнений, вообще не были

известны или рассматривались как артефакты фиксации сре­ зов. Успехи, достигнутые за последние годы в выяснении струк­ туры хлоропласта, связаны как с применением электронного микроскопа, так и >в еще большей степени с развитием техники приготовления срезов и техники контрастирования. Удается по­ лучить изображения участков микрообъектов диаметром в доли

Рис. 14. Модель системы тилакоидов внутри гран и между гранами по Мюлеталеру [738а].

микрона, и даже серийные приборы позволяют достичь разре­ шения 5А. Используются различные типы электронных микро­ скопов: просвечивающий, отражательный, растровый, эмиссион­ ный и зеркальный.

Метод рентгеноструктурного анализа, с помощью которого установлена структура ряда ферментов и других белков, к со­ жалению, неприменим для исследования растворов, что создает значительные трудности.

Успехи, достигнутые благодаря применению техники элект­ ронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа, стали воз­ можны при морфолого-функциональном исследовании хлоропла­ стов. Выяснение связи между структурой и функцией хлоропла­ стов привело к заключению, что фотохимические реакции и сопряженные с ними реакции переноса электронов протекают на внутренних мембранах хлоропластов, связанных с ламеллярной системой. Поэтому более всего нас интересуют мембраны хлоро-

пластон. Роли мембран в осуществлении различных биологиче­ ских процессов в последние годы уделяется большое внимание. Сформулировалось новое направление в науке — мембранная биология [142]. Значение структурной организации мембран, по-видимому, не уступает значению самих образующих их мо­ лекул [142]. Знание структурной организации фотосинтетическо­ го аппарата необходимо для успешного изучения процессов ге­ нерирования, преобразования и сохранения энергии.

Хотя потери естественного материала стромы при выделении хлоропластов приводят к значительным изменениям в функцио­

нальных	возможностях
хлоропластов,		мембран­
ные системы в них сохра­
нены, так	что	поврежден­
ные хлоропласта вполне							і	г з	4
способны	выполнять		ос­
новные	фотохимические			р 1 1 С .	15.	Модель	мембраны		тилакоида по
функции.				Крейтцу		[643].
ОСНОВУ	Л Э М е Л Л Я р Н О Й			/ — вода,		2 — лнпнд.	3 — порфнрнн, 4 — белок.
системы хлоропластов			со­
ставляют	тилакоиды — двойные				замкнутые			мембраны. Стопки
тилакоидов образуют			граны. Расстояние				между		ближайшими

внутренними промежутками тилакоидов составляет 250 А [398]. Отдельные ламеллы (тилакоиды) выходят за пределы гран. Не­ которые ламеллы связывают граны между собой. Результаты последних работ показывают, что биохимические свойства тила­ коидов внутри гран и вне их не совсем одинаковы (см. часть I V ) .

• Итак, тилакоиды представляют собой две соединенные по краям мембраны, причем в тилакоиде эти две мембраны распо­ ложены зеркально-симметрично [642]. Данные электронномикроскопического и рентгеноструктурного анализов свидетельству­ ют о таких асимметричных отношениях мембран, когда по краям имеет место их инверсия, как показано на рис. 14.

С помощью новейших методов рентгеноструктурного анализа удалось показать трехслойную структуру тилакоидной мембра­ ны. По Крейтцу [643], внутреннее пространство между мембра­

нами тилакоида заполнено водной средой		(рис. 15), затем (в на­
правлении к периферии)	последовательно	расположены слои ли-
пида (21 А ), порфиринов	(11 А ) и белка	(36 А ). На рис. 16, а

показано строение мембраны, согласно Мюлеталеру и Мэрли [739]. Мембрана состоит из двух слоев с промежутком между ними. Верхний слой представляет белок, нижний — липопротеид.

Частицы белка	размером	120 А из четырех	субъединиц (вид
сверху и сбоку)	образуют	между собою канал. Они погружены
в мембрану. Строение липопротеинового слоя			остается неясным.

Крейтц предлагает несколько моделей строения мембраны хлоропласта. Одна из моделей [642], показанная на рис. 16, б,

изображает мембрану в виде трех главных слоев на основании измерения электронной плотности (рис. 16, б, справа). Белко­ вый слой из субъединиц по 40 А подстилается липидами, в ко­ торые погружены фитольные «хвосты» молекул хлорофилла. На поверхности белкового слоя закреплены белковые образования

120

	~200
120
	о	160
І І І І І І І І і	11111111ІІ111ІІ11І
Рис. 16. Модель тилакоида	по Мюлеталеру и Верли	(а) [739] и Креит-
цу (б) [642].

Размеры указаны в ангстремах. Пояснение в тексте.

по 120 А . На этих крупных образованиях белка, принятых Пар­ ком за «квантосомы», следует остановиться подробнее.

Свыше 10 лет назад Парк [104, 797] высказал предположе­ ние, что в составе мебран находятся окруженные липидами слои из больших белковых глобул диаметром около 100—200 А, включающие пигменты.

В результате опытов, доказавших локализацию фотореакций в ламеллах, было высказано предположение о наличии в составе ламелл частиц, эквивалентных ФЕ. Изучение ламелл под элект-

ронным микроскопом с применением напыления позволило об­ наружить регулярно повторяющиеся образования на поверхнос­ ти мембран. Парк с сотр. [797, 795, 260] заключили, что такая регулярная структура представляет морфологическое выраже­ ние ФЕ Эмерсона и Арнольда, и назвали их «квантосомами». Парк [104] различал по меньшей мере три типа расположения квантосом в ламеллах хлоропластов: беспорядочное, линейное и паракристаллическое. Оказалось, что в пределах одной мемб­ раны могут встретиться все три типа упаковки; правда, послед­

ний встречается реже.
	Строго	упорядоченное, паракристаллическое				расположение
квантосом		позволило	вычислить	их	размеры	(180 X 160 X
X	100А);	с учетом их	удельного	веса	(1,17) и	массы (3,5 X
X	10~| 8 г) по расчету одна квантосома содержит 230 молекул хло­

рофилла. Поразительное совпадение последней величины с вели­

чиной	ФЕ, которую	определяют	в	физиологических исследова­
ниях,	расценивалось	как весьма	весомое доказательство того,
что квантосома — морфологическое				выражение ФЕ.
Молекулярный вес квантосомы				(2,1-Ю6 ) и молекулярный вес

ФЕ (1,9-106 ), вычисленный другими методами, также хорошо совпадают. Однако в результате исследований, отчеты о которых опубликованы в 1967—1969 гг., был сделан вывод, что представ­ ление Парка о квантосомах как морфологическом выражении ФЕ ошибочно. Те образования на электронномикроскопических фо­ тографиях, которые Парк принимал за структурное выражение ФЕ, на самом деле отвечают локализации нескольких фермент­ ных комплексов на поверхности. Поэтому понятие «квантосома» представляет исторический интерес [577, 104, 796], хотя расчеты химического состава ФЕ не утратили смысла.

Экстракция мембран водными растворами приводит к тому, что поверхность мембраны из бугорчатой, неровной становится гладкой. Оказалось, что на внешней и внутренней поверхностях мембран можно различить несколько видов частиц, резко разли­ чающихся как структурно, так и функционально. Эти экстраги­ руемые частицы не содержат хлорофилла и не могут представ­ лять ФЕ. После отмывки от всех этих частиц мембраны сохра­ няют активность реакции Хилла.

Хоуэлл и Моундрианакис [524] установили, что экстракция тилакоидных мембран с помощью раствора ЭДТА ведет к потере частиц, напоминающих на электронномикроскопических фото­ графиях квантосомы. В частицах диаметром около 120 А лока­

лизованы «белки фракции I», участвующие в фиксации			С 0 2 и
удаляемые водными	растворами. В	результате экстракции
0,75 мМ ЭДТА отделяются частицы диаметром около			100 А,
представляющие собой «сопрягающий фактор» — белок,			необхо­
димый для ФФ. Еще в 1966 г. Менке с сотр. высказали			предпо­
ложение о локализации	на поверхности	мембран не менее трех

различных в функциональном отношении факторов фотосинтеза [234]. Крейтц [642] предложил схему раздельного расположе­ ния частиц, обладающих функциями АТФ-азы и карбоксидисмутазы.

Недавно Берцборн с соавт. [233] показали, что фермент фер- редоксин-НАДФ-редуктаза структурно связан в тилакоиде и ло­ кализован между выпуклостями глобул, содержащих «сопрягаю­ щий фактор» (см. часть IV) . Применение методов рентгеноструктурного анализа позволило подойти к изучению строения мембран на молекулярном уровне.

Выше отмечалось, что тилакоидная мембрана является весь­ ма сложной асимметричной системой [739]. Предполагается, что внутренний слой мембраны состоит из липоидов или липопротеинов, причем содержание липидов в мембранах в 50 раз выше их содержания в строме. На основании собственных и литера­ турных данных Крейтц [643] представляет расположение липи­ дов и пигментов в липидных слоях тилакоидов следующим об­ разом: моногалактозилдиглицериды в липидном слое образуют собственные мицеллы; фитол соединен с дигалактозилглицеридом также в виде обособленных мицелл; отдельные мицеллы об­ разуют и пластохиноны вместе с молекулами дигалакто'зилглицерида.

Строение б е л к о в о г о с л о я тилакоидной мембраны уточ­ няется с каждым новым сообщением [739, 642, 211, 233, 643]. Рентгеноструктурный анализ выявляет весьма упорядоченное расположение белков в виде гидратированных (не менее 55% объ­ ема белкового слоя заполнено водой [543]) дискретных «микро­ кристаллов», состоящих из блоков по 16 субъединиц. С этими «микрокристаллами» структурно и функционально связаны опи­ санные выше белковые частицы, экстрагируемые водными раст­ ворами. Размеры субъединиц в блоках, по данным Крейтца [643], 42 X 42 X 36 А или 42 X 84 X 36 А. Блоки погружены в водную фазу. Молекулы хлорофилла пространственно ориентиро­ ваны на поверхности фаз (белок—вода), порфириновые кольца находятся на «микрокристаллах» белка; расположение фитольных радикалов описано выше.

Между субъединицами белка имеются гидрофобные каналы, размеры которых достаточны для включения порфириновых ядер хлорофилла. Крейтц [643] полагает, что молекулы различ­ ных форм хлорофилла ( Хл 673, Хл 683, Хл 695 и Хл 705) строго упорядочены внутри субъединиц белка. Согласно его расчетам, на участок поверхности размером 166X166 А (на 16 субъеди­ ниц) приходится 128 молекул хлорофилла; еще 11 молекул хло­ рофилла расположены внутри соединений субъединиц.

Путем подготовки препаратов для исследования под электрон­ ным микроскопом по способу замораживания с протравливани­ ем было показано [939], что экстрагируемые растворами ЭДТАча-

стицы размером ~	120 А погружены в плоскость мембран, тогда
как рентгеноструктурный анализ скорее		указывает на	то, что
эти частицы прикреплены к поверхности.
Таким образом,	данные, полученные	с помощью	методов

электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа, до­ статочно противоречивы. К настоящему времени мы не распола­ гаем достаточной информацией как о молекулярной структуре слоев в тилакоидах, так и о взаимном расположении в них бел­ ков, липидов и пигментов. Предложен целый ряд гипотетиче­ ских схем «упаковки» пигментов. По данным рентгеноструктур­ ного анализа, частицы ФС-І содержат пигменты в своих цент­ рах, а также в небольшом количестве — на внешней стороне мембраны; для ФС-П характерна концентрация всех порфиринов на внешней стороне частиц [739]. По-видимому, о располо­ жении пигментов можно сказать только, что по меньшей мере часть фоторецепторов строго упорядочена, без чего немыслимо осуществление фотосинтетической функции in vivo. Такая упоря­ доченная тонкая структура наводит на мысль о близости к системе твердого тела (стр. 12).

Имеющиеся в литературе сведения относительно структуры хлоропластов различных растений показывают постепенное ус­ ложнение строения хлоропластов высших растений по сравнению с низшими, замену ламеллярного строения гранальным, увели­ чение количества дисков в гранах и т. д. [130, 142, 143].

Хлоропласт, таким образом, будет тем «сильнее», чем боль­ ше в нем гран и чем больше тилакоидов в каждой гране. Фо­ тосинтетическая активность выше у хлоропластов с более вы­ раженным гранулярным типом мембранной организации [143].