книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

ФМН + АДФ + Фн	ФМН • Н 2 + 4"02 + АТФ
ФМН • н2 + о2 -»- ФМН + н2 о2
н2 о2 - н2о + -І- о2
АДФ + Ф„ АТФ +	Н А

Можно добиться не выделения, а поглощения кислорода при ФФ в модельной системе с изолированными хлоропластами, ви­ доизменив реакцию переноса электрона по типу реакции Мелера [716] (см. стр. 146). Если Нг0 2 улавливать в присутствии до­ бавляемых каталазы и этанола, то этиловый спирт будет окис­ ляться в уксусный альдегид с поглощением кислорода в стехиометрическом отношении 72О2/2Є-

Каково же физиологическое значение разных типов ФФ? Природа, как известно, отвергает логическую стройность на­

вязываемых ей схем. Вероятно, in vivo одновременно осущест­ вляется несколько типов переноса электронов, сопровождаемого фосфорилированием. В работах, выполненных в 1965—1968 гг. Спенсером, Антом, Нобилем, Межине-Масловой, Моизом [768, 884, 723], было показано, что ПФФ играет наиболее важную физиологическую роль по сравнению с другими типами ФФ.

Чрезвычайно запутанным и сложным представляется вопрос

о локализации пунктов		фосфорилирования в ЭТЦ,	т. е. опреде­
лении того	компонента	цепи, окислительно-восстановительные
превращения	которого	сопряжены с реакциями	образования

АТФ. Локализация наиболее вероятных пунктов ФФ рассматри­ валась в рамках сравнительно простой Z-схемы. Сторонники так называемой химической теории сопряжения (см. часть IV),

Аврон и Чане считали, что как при ЦФФ, так и при НФФ	один
из пунктов фосфорилирования находится в ЭТЦ до, а не	после

Цит f [200].

С другой стороны, при использовании в качестве донора электрона ДХФИФ восстанавливаемого АК и выключении тран­ спорта электронов от воды диуроном (стр. 65) было показано ФФ при нециклическом типе переноса электронов. В этом случае Цит / мог не участвовать, но участвовал Цит b [196, 976, 447, 434]. При нециклическом типе транспорта электронов рассматривается возможность наличия двух пунктов сопряжения [208]. Выдвинуто предположение, что один из них находится рядом с пунктом раз­ ложения воды [202] (см. часть I I ) .

Высказано мнение о том, что при ЦФФ и НФФ места фос­ форилирования совершенно разные [452, 473].

Скорость фосфорилирования в различных условиях. Арной [6] отмечал, что ФФ по скорости (из расчета на единицу азота) в несколько раз превосходит ОФ в митохондриях растительного или животного происхождения. К тому же, так как число мито-

хондрий в листьях невелико, образование АТФ в них зависит в основном от процесса фотосинтеза, а не дыхания. Важное зна­ чение имеет изучение химических, физических и биологических факторов процесса ФФ.

В моделях с хлоропластами скорость НФФ и ЦФФ, катали­ зируемых, в частности, Фд, по данным Арнона [6], составляет, соответственно 300 и 180 мкмоль образуемого АТФ в расчете на 1 мг Хл за 1 я и совпадает со скоростью ФФ in vivo, что не явля­ ется пределом, и именно для достижения высоких величин необ­ ходимо знание конкретных условий проведения реакции.

Еще в 1958 г. на Брухавенском симпозиуме были подведены итоги исследования условий сопряжения фосфорилирования с восстановлением феррицианида [158]. При температуре 25° С скорость восстановления феррицианида составляла 240 мкэкв/мг Хл-ч, или QO2 = 1344 мкэкв-ч.

Ягендорф [158] четко проанализировал условия стимуляции фоторедукции феррицианида магнием, Фн , АДФ и АТФ. Серьез­ ные сомнения, по его мнению, вызывает вопрос: законно ли при­ менять исходную скорость реакции Хилла как уровень, от которого отсчитывается увеличение скорости, обусловленное фосфорилированием? Конечно, можно исходить из скорости восста­

новления в контрольном	препарате без всяких добавок. Но Ф н
сам оказывает некоторое	стимулирующее действие, таким же об­

разом действует и магний, а оба вместе стимулируют реакцию на 65%, даже в отсутствие АДФ. Поэтому добавление АДФ, ини­ циирующее процесс фосфорилирования, фактически только удваи­ вает скорость в этом случае, тогда как стимуляция по сравне­ нию с контролем (без магния и Фн ) составляет 310%. Необхо­ димо учесть и влияние продуктов реакции, так как образуемый АТФ снижает скорость ФФ на 30%, что составляет максималь­ ную степень торможения, которую может вызывать АТФ (при концентрации Ю - 5 М). Тщательный контроль необходим и при рассмотрении многих других вопросов, связанных со стимуля­ цией различными веществами.

Бернштейн и Рейнгард [19] выяснили влияние изменений ус­ ловий проведения реакций ФФ в моделях с хлоропластами на скорость фосфорилирования. Оказалось, что кинетика процесса будет зависеть от таких факторов, как количество хлоропластов и других ингредиентов в пробе, а также от продолжительности проведения реакции и уровня освещения. Хлоропласты не спо­ собны к ФФ при суспендировании в средах с низким осмотиче­ ским давлением. Наиболее благоприятны концентрации 15 мкМ NaCl и 30 мкМ сахарозы.

Чрезвычайно важную роль играет уровень освещения. ЦФФ, катализируемое ФМС или пиоцианином, насыщается при очень высоких уровнях освещения — до 200 000 лк. В противополож­ ность электронным переносам, кривая зависимости скорости фос­ форилирования от интенсивности света обнаруживает различные

лаг-периоды, во время которых, по-видимому, происходит на­ копление пулов, например пулов переносчиков (в восстановлен­ ном состоянии), или концентрационного потенциала, например протонов, по обе стороны полупроницаемой мембраны внутри хлоропласта. Важное значение имеет также уровень Фн . Срод­

ство хлоропластов к	Ф н	довольно низкое [193, 687]. Величина
константы Михаэлнса	Кт	(около	1 мМ	и ниже)	зависит от рН
-и наличия некоторых веществ в среде				инкубации	хлоропластов
[861]. Аврон и Ньюман		[207]	приводят величину константы

для АДФ 5 - Ю - 5 М. Отмечается, что образование АТФ не долж­ но снижать скорость ФФ, но АТФ и даже АДФ уменьшают ско­ рость транспорта электронов с феррицианидом в роли окисли­ теля [206, 888].

До недавнего времени оставалась не вполне понятной роль ионов магния для ФФ, хотя еще до 1958 г. [6] было совершен­ но очевидно, что магний выступает катализатором ФФ. Позднее в связи с открытием «сопрягающих факторов» ФФ (см. часть IV) стало ясно, что, по крайней мере частично, функция магния за­ ключается в активизации АТФ-азы, активируемой M g 2 + .

Не совсем ясна и роль аскорбата (АК) в ФФ. АК часто до­ бавляют в среду для выделения хлоропластов. Арнон указы­ вал [4], что АК не служит кофактором, а предохраняет какие-то компоненты хлоропласта от инактивации в ходе выделения и, кроме того, способствует стабилизации биоэнергетических функ­ ций в течение нескольких часов. ЦФФ в аэробных и анаэробных условиях усиливалось АК в равной степени. Определенную роль играет АК в стимуляции поглощения кислорода на свету. На­ конец, АК выступает как донор электрона, замещая воду при нециклическом транспорте электронов [192, 6, 546].

В середине 60-х гг. было выяснено значение постоянного уровня редокс-потенциала переносчиков на свету для макси­ мального выхода ФФ. В лаборатории Аврона [1033] было пока­ зано влияние внешнего редокс-потенциала на систему ЦФФ с участием ФМС и установлено, что скорости максимальны только при соответственно отрегулированном уровне редокс-потенциала интермедиатора. Сходные данные приведены в работах Кейстера, Громат-Элханана, Шварца и других [606, 1033, 853, 447].

Очевидно, многие противоречия в данных о стимулирующем или ингибирующем действии АК [192, 546] и о стимулирующем действии диурона на ЦФФ при одних условиях и ингибирующем его действии при других условиях [191, 545, 983, 984] объясня­ ются различиями в значениях уровней редокс-потенциала.

Это же	можно сказать о стимулирующем или ингибирующем
.действии	кислорода на ЦФФ [6]. Таким образом, кислород, АК
и другие	физиологические факторы выступают отчасти и как ре­
гуляторы	редокс-уровня среды.

Роль рН. В первых работах по ФФ [6] не вызывало сомне­ ний, что оптимум ФФ находится при рН около 8, тогда как «раз-

обтенный» электронный перенос (в отсутствие фосфорилиро­ вания) имеет оптимум рН около 7,4. Позднее было показано, что оптимум при рН 8 зависит от разобщающего действия триса, а если в качестве буфера использовать трицин, то оптимум рН от­ клоняется до 8,8. Применяя ФМС как катализатор ЦФФ, обнару­ живают два оптимума рН — около 7 и 8.

При выделении хлоропластов поддерживают рН 7,8: в более щелочной среде хлоропласта повреждаются. При рН б многие фотореакции тормозятся, но скорость восстановления ДХФИФ имеет оптимум при рН 4,5. Было установлено, что эти изменения определяются активацией галактолипидгидролизирующих фер­ ментов и освобождением свободных кислот, которые оказывают повреждающее действие.

Влияние температуры изучено еще недостаточно [207], хотя ФФ протекает даже при температуре —10° С. Чувствительность к низким температурам различна для НФФ и ЦФФ и определя­ ется, по-видимому, уровнем освещенности и связана с более сложным путем транспорта электронов при НФФ. Обычно же ФФ проводят при комнатной температуре. При 30° С обнаруже­ но резкое обострение оптимума рН.

Роль СОг. Вслед за более ранними данными о стимуляции реакции Хилла С 0 2 [810, 811, 886] было показано, что СОг сти­ мулирует также ФФ [218].

Роль Oj. Начиная с работ группы Арнона [6], в которых опи­ сан феномен ФФ, кислороду было уделено особое внимание, тем более что многие из экспериментов проводились с использовани­ ем манометрического метода. Хотя в первых опытах процесс поглощения Ог обнаружить не удалось, образование АТФ с замет­ ной скоростью происходило только в аэробных условиях. Отсю­ да был сделан вывод, что кислород выступает в роли катализа­ тора, а не субстрата, как при ОФ. Значение этого открытия, как отмечал Арнон на Брухавенском симпозиуме в 1958 г. [6], со­ стояло в том, что было выяснено отличие по меньшей мере от­ дельных этапов ФФ и ОФ между собой и что такого рода неза­ висимость ФФ от постоянного снабжения кислородом указывала на определенное принципиальное сходство в ЭТЦ с механизмом фотосинтеза у анаэробных фотосинтезирующих бактерий.

Исследования недавних лет показали, что кислород в опре­ деленной мере — антагонист НАДФ+. Вероятно, оба эти вещест­ ва, несмотря на большую разницу в редокс-потенциалах, конку­ рируют за электроны. Поглощение кислорода в процессе ФФ при использовании НгО в качестве донора электронов оказывается сбалансированным с его выделением, но обменные реакции рез­ ко ускоряются в присутствии ФМН или витамина К (см. стр. 39).

Необходимость СОг и следов 0 2 для поддержания процесса образования АТФ постоянно подчеркивал Варбург, который вы­ двигал весьма оригинальные идеи о промежуточном образовании фотолита в ходе фотосинтеза йотом, что механизм ФФ является

частью механизма дыхания [967]. В настоящее время пра­ вильным будет признать, что гипотеза Варбурга в первоначаль­ ном виде представляет только исторический интерес, хотя до сравнительно недавнего времени разделялась и другими иссле­ дователями, в том числе Веннесланд [933].

Роль НАДФ. Восстановление хлоропластами НАДФ + , как и феррицианида, сопровождается фосфорилированием, но в пер­ вом случае мы имеем дело с физиологическим вариантом. При НФФ одновременно с восстановлением НАДФ+ выделяется кис­ лород воды в стехиометрических отношениях по отношению к НАДФ+. Эту реакцию разложения Арнон [6] выразил в виде

следующего уравнения:
2АДФ + 2ФН + 2НАДФ + 2 Н 2 0	2АТФ + 0 2 + 2НАДФ • Н 2 .
В присутствии разобщающих	агентов	(например, N H 4 C I ) или
в отсутствие субстратов ФФ — АДФ и		Ф н — скорость реакции

возрастает и осуществляется реакция Хилла, которая, как отме­ чалось, является частью системы разобщенного ФФ.

В отравленных диуроном хлоропластах ФС-П выключается, но восстановление НАДФ+ и сопровождающее этот процесс фосфорилирование не прекращается, если в систему внести искус­ ственный донор электронов ДХФИФ и для поддержания послед­ него в восстановленном состоянии — АК [674, 915, 976, 447].

Моиз [738, 723] исследовал влияние Ог на реакцию Хилла и ФФ в изолированных хлоропластах шпината. Обнаружено, что выделение Ог слегка чувствительно к его повышенному парци­ альному давлению в присутствии феррицианида в качестве окис­ лителя. Наличие следов Ог необходимо для осуществления этих реакций хлоропластами, тогда как избыток его оказывает зна­

чительный	отрицательный эффект, особенно	в	присутствии
Н А Д Ф + (вместо феррицианида). Этот эффект		Ог	уменьшается
при внесении в систему ферредоксина или бикарбоната.
В работе Моиза обсуждался вопрос о месте ингибирующего
действия 0 2	в ЭТЦ. Так как ферредоксин стимулировал фотопо­

глощение Ог (фотодыхание), то высказано предположение, что

главный	пункт ингибирующего действия Ог находится вбли­
зи ФС-І,	причем один из участков ингибирования находится

перед Фд, а другой — за ним. Если количество НАДФ+ не огра­ ничено, внесение Фд стимулирует НФФ, сопряженное с восста­ новлением Ог. Скорость поглощения 0 2 и скорость ФФ находят­ ся в прямой зависимости друг от друга. Объясняя «эффект Вар­ бурга» (угнетение фотосинтеза избытком 0 2 ) , Моиз указывал на регуляторную функцию кислорода как в ФФ, так и в процессе восстановления НАДФ+.

Вряде исследований была рассмотрена прямая связь между

ФФи синтетическими процессами в клетке [176, 207]. Согласно Арнону с сотр. [815], синтез белка зависит только от АТФ, об-

разуемого в ЦФФ, а ассимиляция СОг и синтез углеводов за­ висят как от НФФ, так и от ЦФФ [887, 810, 807, 218].

Итак, скорость ФФ будет	максимальной при благоприят­
ном сочетании физиологических	и физико-химических условий,

а в живых организмах еще и при оптимальном сочетании про­ цессов синтеза и распада АТФ.

В заключение рассмотрим проблему ФФ in vivo. Со времени работ Форти и Парией [391], Сантариуса и Хебера [845], кото­ рые показали удвоение уровня АТФ при освещении целых листь­ ев, ФФ (как ЦФФ, так и НФФ) in vivo считается эксперимен­ тально доказанным. Для изучения ФФ in vivo обычно исполь­ зуют изотопную технику [390], с помощью которой измеряют изменение концентраций интермедиатов при ФФ.

Доказано, что в живых листьях протекают процессы как НФФ, так и ЦФФ. Опыты по ЦФФ проводят после удаления Ог и СОг либо после введения в систему диурона при ДК-свете. Увеличение уровня АТФ наблюдается в анаэробных условиях или в присутствии ингибитора ФС-П соответственно с условиями освещения. В экспериментах с водорослями было установлено превращение глюкозы в крахмал даже в анаэробных условиях, но обязательно при освещении [568] или стимуляции светом по­ глощения двухвалентных ионов. Мутанты водоросли сценедесмус, у которых нарушена ФС-П, осуществляют ФФ, тогда как мутант этой водоросли с нарушением ФС-І не осуществляет ФФ [899].

Успехи, достигнутые в изучении ФФ на изолированных хло­ ропластах, в частности О. В. Заленским с сотр. [46, 52, 422], являются хорошей предпосылкой для углубленного исследова­ ния ФФ уже на целостных объектах.

7. ФУНКЦИЯ И СТРУКТУРА ХЛОРОПЛАСТОВ

Для понимания работы реакционных центров, механизмов реакции Хилла, ФФ и других энергетических реакций на уровне хлоропласта необходимо знание его структурной организации. Парк [794] предостерегал биохимиков от пренебрежительного отношения к морфологическому состоянию используемого ими материала. Необходимо также уделять серьезное внимание фи­ зиологическому состоянию растений, из которых выделяют хло­ ропласта.

Наконец, изучение механизмов биоэнергетических реакций немыслимо без представлений об условиях сохранения биологи­ ческой активности хлоропластов in vitro в течение максимально длительных сроков с момента выделения хлоропластов из расте­ ний.

Обзоры более старых работ с описанием техники выделения хлоропластов содержатся в сводках Рабиновича [107], Кледенинга [312], Ягендорфа [542] и других. Недавно были опубли-

кованы материалы Всесоюзного семинара (16—18 июля 1969 г.), специально посвященного методам выделения хлоропластов [82]. Для краткости мы рассмотрим только некоторые аспекты проблемы выделения и сохранения активности хлоропластов, связанные с изучением биоэнергетических процессов.

Для выделения хлоропластов чаще всего используют листья шпината, гороха и фасоли. Из листьев многих растений вообще не удается выделить активные хлоропласты,поскольку сильные кислоты или дубильные вещества вызывают немедленную инак­ тивацию ферментов. Сохранение целостности хлоропластов не играет существенной роли в отношении их способности к ФФ,

однако они теряют	часть белков, необходимых для	фиксации
С 0 2 . Для получения	«разрушенных» хлоропластов	используют

эффект осмотического шока, суспендируя хлоропласты в 0,035 М NaCl.

Хлоропласты, выделенные в водных растворах (буферные растворы с NaCl), теряют водорастворимые компоненты и не могут фиксировать СОг, но сохраняют способность к фосфорилированию и переносу электронов. В противоположность этому, хлоропласты, выделенные в неводных растворителях (например, в смеси гексана и четыреххлористого углерода), уже не спо­ собны осуществлять фотохимические реакции, но активны в ре­ акциях, связанных с восстановлением С 0 2 . В последнем случае под электронным микроскопом обнаруживали разрушение струк­ тур ламелл хлоропластов. Процедура изоляции хлоропластов в водной среде с сохранением в них водорастворимых форм азот­ содержащих соединений (белков) описана в работе Ботрилла и Поссингхема [257].

Значение целостности хлоропластов подчеркивалось Уолкером [955—958], который изображал процедуру выделения хло­ ропластов в виде двух таких последовательностей:

1) Вода -f- Сахар + Хлоропласты -> «Целые» хлоропласты;

2) Вода + Хлоропласты -{- Сахар -> Хлоропласты без оболочек.

Разница между вариантами состоит в порядке внесения реа­ гирующих веществ. Две смеси могут быть даже химически идентичны, но при коротком осмотическом шоке во втором случае хлоропласты на 100% лишены оболочек. В отсутствие искусст­ венного акцептора электрона выделение 0 2 , сопряженное с ас­ симиляцией углекислоты, для «целых» хлоропластов (класса I) намного выше, чем для хлоропластов без оболочек (класса I I ) . Наоборот, в реакционной смеси с НАДФ+ или феррицианидом Б качестве акцептора водорода скорость выделения 0 2 выше для хлоропластов класса I I .

Блокируя доступ С 0 2 к интактным хлоропластам, Уолкер вы­ зывал прекращение выделения 0 2 ) а внося бикарбонат в систе­ му, возобновлял его. Скорость фиксации С 0 2 резко увеличива-

лась при добавлении к суспензии рибулозо-5-фосфата. Таким образом, одной из причин резкой потери хлоропластами клас­ са I I способности к фиксации СОг является вымывание фермен­ тов, функционирующих в цикле Кальвина.

По данным Спенсера и Анта [89], скорость восстановления' НАДФ+ у хлоропластов класса I на порядок выше, чем у клас­ са I I , и не меняется при внесении Фд. Однако отношения между вносимыми компонентами определяются и другими факторами. В частности, наличие мембраны препятствует проникновению НАДФ+ внутрь хлоропласта [469], и, кроме того, образуемый НАДФ-Н не накапливается, а расходуется в процессе ассимиля­

ции	СОг. Спектрофотометрическая методика количественного
учета	интактных	(класса I) хлоропластов описана Карлстоном
и Альбертсоном		[576].
Парк и Пон		[797] показали, что после реконструкции разру­

шенных озвучиванием хлоропластов и разделенных последую­ щим центрифугированием фракций ламелл и супернатанта в определенной мере восстанавливается утраченная отдельными фракциями способность к фиксации СОг с образованием первого стабильного углеродного продукта фотосинтеза — фосфоглицериновой кислоты.

Разработка методик выделения интактных хлоропластов [89] связана с использованием новых буферных растворов, введен­ ных в биохимическую практику в лаборатории Гуда [431]. Это трицин — г^-трис(гидроксиметил)метилглицин, хепес — N-2-гид- роксиэтилпиперазин-Ь1'-2-этансульфоновая кислота, мэс-буфер — 2-(Ы-морфолино)-этансульфоновая кислота и тэс-буфер — N-трис- (гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновая кислота. Эти бу­ фера имеют явные преимущества перед широко применяемым 7т?«с-НС1-буфером [139]: они не обладают токсичностью и не­ оказывают разобщающего действия на ФФ. С их помощью уда­ лось повысить скорость фиксации СОг до 155 мкмоль/мг Хл-ч (против 245 для целых листьев) и сохранять ее на протяжении 10 мин [89].

Применение фосфатного или пирофосфатного буфера менее желательно по следующим причинам. Ортофосфат в концентра­ ции выше 0,05 мМ ингибирует выделение 0 2 и поглощение С 0 2 целыми хлоропластами, а пирофосфат, хотя и не проявляет ингибирующего действия в концентрации до 0,005 мМ, является мощным ингибитором ряда ферментов [313].

В последнее время проницаемость хлоропластной оболочкиизучалась после выделения хлоропластов в неводных раствори­ телях [478, 784, 57]. Было показано, что одни углеродные про­ дукты фотосинтеза легко проходят через оболочку пластид, а. другие остаются внутри хлоропласта.

Среди главных проблем метаболизма, рассмотренных Хебером [929], одна касается специфического распределения фер­ ментов, а другая — различий в проницаемости для их субстратов.

При освещении листьев резко изменяется уровень проме­ жуточных метаболитов. Одни из них (рибулозодифосфат, седогептулозофосфат и пиридиннуклеотид) обнаружены только в хлоропласте, тогда как другие (АДФ, АТФ, фосфоглицерат и дигидроксиацетонфосфат) — как в хлоропласте, так и в цитоплаз­ ме. Опыты с изолированными хлоропластами приводят к выво­ ду, что оболочка хлоропласта представляет серьезный барьер на пути тех соединений, концентрация которых изменяется толь­ ко внутри хлоропласта. По отношению к некоторым соединениям эта оболочка обладает переменной проницаемостью. Ферменты, специфически вовлекаемые в реакции фотосинтеза и гликолиза, встречаются как в хлоропластах, так и в цитоплазме. Хлоро­ пласта содержат глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, 6-фосфоглю- конатдегидрогеназу, а также ферменты, участвующие в окисли­ тельном разрушении гексозофосфата [845], но ключевые фер­ менты гликолиза в них отсутствуют.

Хебер с соавт. пришли к заключению, что 3-фосфоглицерат может выполнять роль транспортного метаболита в активно •функционирующих зеленых клетках. Это было подтверждено и на интактных хлоропластах, выделенных в водной среде [959]. Менее определенны представления относительно АТФ, АДФ, Фн , НАДФ+, НАДФ-Н [845]. Сантариус и Хебер показали [845], что АДФ и АТФ преодолевают оболочки гораздо легче, чем НАДФ+, НАДФ-Н и Фн .

Интересен и другой аспект регуляторных отношений. Соглас­ но Моору с соавт. [734], скорость фотосинтеза в изолированных хлоропластах зависит от весьма сложных отношений между сами­ ми хлоропластами, клеточным соком и пирофосфатом, который вносят в среду в оптимальной для фотосинтеза концентрации (5 мМ). При отношении концентрации клеточного сока в системе in vitro к предполагаемой его концентрации (в расчете на то же количество хлоропластов) in vivo, равном 'Д, скорость фотосин­ теза повышалась на 20%, тогда как при отношении 3 Д наблю­ далось 90%-ное ингибирование. Следовательно, отдельные ком­ поненты клеточного сока и пирофосфата являются регулятора­ ми фотосинтеза, а само открытие Мора с соавт. относится к проблеме полной реконструкции фотосинтеза, включая поглоще­

ние	С 0 2 .
	В этом аспекте значительный интерес представляет	изуче­
ние	одноклеточных водорослей. Толберт в 1961 г. [909]	описал

гликолат-карбонатный цикл у хлореллы. Замечательно здесь то, что внешняя среда выступает в известной степени как регулятор образования или накопления гликолата, для которого наружная механически весьма прочная оболочка хлореллы не является непроницаемым барьером.

Итак, сохранение структурной организации, характерной для хлоропластов in vivo, обеспечивает выполнение различных функ­ ций фотосинтеза. Повреждение оболочек хлоропластов вызыва-

ст изменение в скорости и направленности многих важных биоэнергетических реакций. Наконец, оболочки хлоропластов и одноклеточных водорослей избирательно проницаемы для нейт­ ральных молекул и ионов.

Рассмотрим теперь вопрос о сохранении активности изоли­ рованных хлоропластов во времени в процессе их «старения» in vitro.

Учитывая, что многие промежуточные реакции транспорта электронов являются энзиматическими, исследователи уже при первых попытках выделения хлоропластов соблюдали обязатель­ ные в белковой химии условия — пониженные температуры и не­ замедлительное использование изолированных хлоропластов. Сохранение, хлоропластов при температуре, близкой к точке за­ мерзания воды, к сожалению, оправдывает себя только в тече­ ние считанных часов и даже минут. Замораживание и оттаива­ ние хлоропластов также приводит к необратимой утрате части биоэнергетических функций [477].

Консервация хлоропластов с сохранением ими полного комп­ лекса биоэнергетических функций имеет важное значение: эко­ номится время исследователя и затрата реактивов и Материала на приготовление новой порции .хлоропластов; появляется воз­ можность использовать в разных опытах и в любое время года один и тот же унифицированный материал.

Еще до открытия ФФ делались попытки выяснить способ­ ность отдельных химических веществ стабилизировать фотохи­ мические комплексные реакции типа реакции Хилла. Описание этих работ содержится в энциклопедической сводке Рабиновича [107]. В ней, в частности, отмечено стабилизирующее действие метанола и глицерина на активность реакции Хилла в течение нескольких часов.

Эйнор и Дзюбак [151] изучили влияние ряда органических растворителей и неорганических солей на активность реакции Хилла с феррицианидом на хлоропластах, выделенных из листь­ ев гороха в среде, содержащей 0,35 М NaCl или 0,4 М сахарозы.

Оказалось, что сахароза и хлористый натрий в концентрациях
Ю - 3 М взаимно усиливают реакцию восстановления	феррициани-
да (или способствуют сохранению ее активности)	в опытах при

выделении хлоропластов в соответственно противоположных сре­

дах выделения. Весьма сильными		активаторами	(или стабилиза­
торами) реакции Хилла в опытах, проведенных			в день выделе­
ния хлоропластов,	оказались	AlgSO^ LiS04 , NaMo04 и
ЭДТА - № 2 в концентрациях Ю - 3 М.
Влияние разных	концентраций	(10, 20 и 40%)	этанола, мета­

нола, глицерина, ацетона и гексана на активность реакции Хил­ ла, определяемую сразу после добавления в среду с пробами

хлоропластов	и спустя 24 я после	их сохранения в присутствии
органических	растворителей при	температуре 0—4° С, показа­
но на рис. 11.

4 3-930

49