книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

представлення Петрака с соавт. [799], которые на основании теоретических посылок разделили общую реакцию ФФ (АДФ-}-Фв —*АТФ) на четыре этапа, Маккарти и Рэкер [694] обсуждают эти этапы уже на базе накопленных эксперименталь­ ных данных.

По аналогии с ОФ следует допустить, что в ходе ФФ обра­ зуется высокоэнергетический предшественник X ~ Y:

Х ~ Ф + АДФ ^ X + АТФ.

X индуцируется при действии СЕета из неактивного предшествен­ ника Y (см. выше). СФ катализирует именно вторую реакцию, причем инкубация хлоропластов с трипсином или их нагревание разрушает механизм ФФ, так как СФ отделяется.

Маккарти и Рэкер предлагают следующую схему реакций фотофосфорилирования:

Свет <2: А ~		Y	Н+- транспорт,		(О
A ~ Y		+	X ^ X ~ Y + A,		(2)
X ~	Y +		Ф„ ^	X ~ Ф + Y,	(3)
X ~	Ф +		АДФ ^	X + АТФ.	(4)

Реакция (1), с одной стороны, связывает образование акти­ вируемого светом предшественника с действием света на акти­ вируемую светом АТФ-азу, которая зависит от магния. С другой стороны, эта реакция связана с активируемым светом процессом транспорта протонов. Важно отметить, что сторонники химической теории сопряжения, к числу которых принадлежит Рэкер, испы­ тывают большие трудности в ходе логического объяснения своих схем, избегая вводить в них реакции, связанные с мембранными переносами. То же можно сказать и о реакции (2), которая, по мнению Маккарти и Рэкера, является необратимой. Суть ее заключается в активации второго компонента этой реакции, Y, который стабилизируется в форме A ~ Y или X ~ Y при создании «высокоэнергетического состояния» и исчезает в темноте в отсут­ ствии АТФ.

Что касается реакций (3) и (4), то в них не внесено из­ менений по сравнению с тем, как их представляли Петрак и соавт. [799] десять и более лет тому назад.

3. ДВУХСТУПЕНЧАТОЕ ФОТОФОСФОРИЛИРОВАНИЕ. ПЕРЕНОС ПРОТОНОВ И ИОНОВ И СВЯЗЬ С КОНФОРМАЦИОННЫМИ ПРЕВРАЩЕНИЯМИ

На протяжении 1962—1966 гг. были сделаны чрезвычайно важные открытия в разделении процесса ФФ, которые в сущ­ ности не явились такой уже большой неожиданностью, так как

разделение процесса ФФ, как и ОФ. на отдельные стадии было предсказано теорией еще в довоенные годы.

Однако только к 60-м гг. развитие исследований по фосфорилированию достигло такого уровня, когда можно было всерьез экспериментально пытаться вычленять отдельные стадии.

«Двухступенчатое» фотофосфорилирование. В соответствии с логическими допущениями было принято считать, что инициируе­ мый светом транспорт электронов приводит к образованию одного или более высокоэнергетических интермедиатов. Образо­ вание этого интермедиата при ФФ получило подтверждение в ходе таких опытов, при проведении которых в реакционных смесях вначале отсутствовал один из факторов образования А Т Ф . Поэтому обычный процесс ФФ, при котором реакция начиналась лишь при внесении в суспензию хлоропластов всех необходимых компонентов для осуществления Ф Ф , можно назвать «одно­ ступенчатым».

В1962 г. Шен и Шеи [862] и в 1963 г. Хайнд и Ягендорф

[502]доказали накопление в освещенных хлоропластах пред­ сказанного теорией высокоэнергетического вещества ХЕ, С пре­ вращениями которого в темноте в присутствии субстратов фос­ форилирования связывают образование АТФ . Разделение ФФ на световую и темновую фазу было осуществлено освещением хлоро­

пластов в шприце при отсутствии А Д Ф , Ф Н и ионов магния, которые вносились в эту смесь после выключения света. Об об­

разовании ХЕ судили	по ходу	образования А Т Ф именно в
темноте.
Хайнд и Ягендорф в своих первых работах изучили условия
образования АТФ: зависимость		от продолжительности интерва­
лов между освещением	и добавлением субстратов фосфорилиро­

вания, а также роль рН, потребность в кофакторах и их цен­ ность. Было определено отношение ХЕ/ХЛ в хлоропластах. В ти­ пичных первых опытах освещаемая смесь содержала 0,2 мг Хл

хлоропластов и	(в мкмоль)	грыс-буфера — 12, NaCl — 10, пио-
цианина — 0,02	в объеме 0,8	мл. Содержимое шприца освещали

в течение нескольких минут и впрыскивали в смесь с агентами фосфорилирования, содержащими грыс-буфер рН 8—50, MgCb — 5, А Д Ф — 3 , КН2 Р04 —0,5 и Ф В в виде Р 3 2 .

Было обнаружено, во-первых, что выход ХЕ резко увеличи­ вался, если инкубировавшаяся на свету смесь имела более кислое рН (около 6); во-вторых, что пиоцианин или другие кофакторы резко сокращали продолжительность световой стадии, но на выход А Т Ф в конечном итоге эффекта не оказывали; и, в-тре­ тьих, что период «жизни» ХЕ весьма короткий: распад ХЕ про­ исходит за несколько секунд, если «темновую» смесь не присо­ единить сразу* Относительно кислое рН при проведении световой стадии в значительной мере было необходимо для замедления скорости распада ХЕ. Полупериод распада в кислой среде уве­ личивался до 30 сек.

Кофакторы оказались	неравноценными. Наиболее			быстрое
образование ХЕ наблюдается		с ФМС и пиоцианином,		медлен.-
нее — с феррицианидом, а	с	ФМН,	метилвиологеном,	ФПНР и
НАДФ скорость процесса	несколько		превышала контроль (без

добавок). Необходимость кофакторов, как и следовало ожидать, была показана для световой фазы. Первоначально было под­ считано, что 1 моль АТФ образуется на 15 моль Хл, но выход ХЕ еще выше, так как только около половины ХЕ наблюдалось в ка­ честве его теста — АТФ.

В этих работах Хайнда и Ягендорфа было установлено так­ же, что моноурон ингибирует образование АТФ через ХЕ В при­ сутствии феррицианида и в смеси его с ФМС, но практически не оказывает эффекта с одним ФМС в качестве кофактора. В опы­ тах с моноуроном было показано, что ХЕ образуется и тогда, когда воду заменяли электронодонорной системой ДХФИФ -+-АК, хотя при рН 6,0 (условие проведения световой стадии) реакция восстановления ДХФИФ аскорбатом проходила хуже. Как и при одноступенчатом фосфорилировании, окисленная форма ДХФИФ тормозила образование ХЕ.

При изучении действия ингибиторов на отдельные реакции двухступенчатого фосфорилирования Громет-Элханан и Аврон [449] показали, что моноурон ингибирует световую стадию, а атебрин и дио-9 — темновую стадию. Ингибиторы переноса энергии были применены для подавления конверсии ХЕ В АТФ. Атебрин очень сильно увеличивал скорость распада ХЕ, если его вносили немедленно после выключения света. Хайнд и Ягендорф [503] изучили влияние широкого спектра ингибиторов на обра­ зование и исчезновение ХЕ И изменение светорассеяния. Такие разобщители, как атебрин, хлорпромазин, ионы аммония, КЦФГ и дикумарол, не только ускоряют распад ХЕ, НО И влияют на темновую стадию. Было показано, что ЭДТА оказывает также отрицательный эффект. Это вещество, вероятно, влияет на кине­ тику образования ХЕ.

Химическая природа		ХЕ не известна,	так как	лабильность
этого	высокоэнергетического вещества делает невозможным из­
учение	его состава (как	это объясняют	сторонники	химической

теории). Были проведены опыты, в которых освещенные хлоро­ пласты фильтровали в свежую неосвещенную суспензию. Выход (по образованию АТФ) не выявил активности ХЕ [451]. Эти свойства ХЕ послужили основанием для сторонников хемиосмотической теории высказать предположение, что ХЕ представляет устройство типа протонного градиента.

Как уже упоминалось, Ягендорф, Хайнд и Ныоман в 1963— 1964 гг. подробно изучили непонятный ранее феномен изменения рН среды инкубации хлоропластов при освещении [543, 549, 756—758]. Для объяснения этого феномена была привлечена гипотеза Митчелла. В свою очередь полученные эксперименталь­ ные данные явились важным стимулом развития этой теории.

Итак, незабуференная суспензия хлоропластов обнаруживает при освещении увеличение рН на единицу и даже более (при оптимальных условиях). Было сделано заключение, что протоны собираются в пространстве внутри хлоропластов, недоступном для стеклянного электрода, и выключение света приводит к обратному перемещению. Таким образом, можно было допустить, что образование высокоэиергетического состояния, которое при наличии условий для фосфорилирования приводило к образо­ ванию АТФ в незабуференной среде, вызывало увеличение рН. Можно было также высказать предположение, что оба эти явле­ ния отражают один и тот же процесс образования АТФ, связан­ ный с перемещением протонов через мембрану. Поэтому логично было сделать следующий шаг — попытаться обнаружить образо­ вание АТФ в искусственных условиях, исключающих действие света, заставляя протоны «пересекать» мембрану.

Ягендорф и Юрайб [549] открыли, что небольшие количества АТФ могут быть синтезированы в темноте при быстром переносе хлоропластов из кислой среды в подщелоченную. При таком типе

образования

АТФ

свет оказался вовсе

не нужен.

Хлоропласты

разводили в 0,01-н. NaCl до концентрации около 0,5 мг Хл/мл

и

использовали

в

двухступенчатой

реакции, проводившейся при

0° С. Сначала

0,5

мл раствора хлоропластов суспендировали в

0,4 мл буфера

рН 4,0, содержащего диурон. Было показано, что

предосторожности

в

отношении

возможной

засветки

хлоро­

пластов

(надо

еще

доказать,

что

синтез АТФ

не зависит

от

света!)

излишни

в присутствии сильного ингибитора НФФ и в

отсутствие

в

то

же

время

редокс-красителя — катализатора

ЦФФ. Смесь

хлоропластов в

кислом

буфере

(объем

0,9

мл)

вносили спустя 60 сек во вторую смесь (с тем же объемом),

содержащую трис-буфер	(100 мкмоль), АДФ — 0,2	мкмоль	и
Ф н — 2,0 мкмоль, а также	радиоактивный фосфат и	щелочь	в

количестве, необходимом для нейтрализации кислого рН; рН суммарной смеси было 8,0. Спустя 15 сек реакцию останавли­ вали добавлением ТХУ.

Образование АТФ	было доказано как по убыли Ф н	из смеси,
так и после адсорбции нуклеозидов из раствора с последующим
анализом с помощью	высокочувствительной методики,	основан­

ной на применении люциферазы		[192, 549].
Природа	кислоты на стадии	инкубации в кислой	среде (как
и величина	рН этой среды) имела существенное значение, и наи­
лучшие результаты были обнаружены с сукцинатом			[930]. В ла­

боратории Ягендорфа было выяснено также, что условия обра­ зования высокоэнергетического предшественника во времени с момента внесения хлоропластов в кислую среду зависят не толь­ ко от природы кислоты, но и от ее концентрации, а также от разности рН в кислой и щелочной средах. Для образования АТФ с сукцинатом оптимальная продолжительность инкубации со­ ставляет 20 сек, причем полупериод образования составляет

13 з-эзо

193

8	сек	для 3	мМ и 2	сек для 10 мМ при рН 3,8, а при рН 4,5	—
4	сек	для	10 мМ	кислоты.
	Таким образом, в кислой среде происходило образование				вы­

сокоэнергетического предшественника АТФ, вызывающего фосфорилирование АДФ. Этот предшественник также назван ХЕ- Задержка во времени из-за отсутствия участников реакции образования АТФ при перенесении хлоропластов в слабощелоч­ ную среду (рН около 8) вызывала распад ХЕ. Нестабильность предшественника также во многом определялась природой ки­ слоты, но зависела от рН.

Полупериод «расходования впустую» ХЕ, индуцированного кислотой, составляет 1—2 сек. Количества образованного АТФ

зависели от всех указанных выше		условий, но	не превышали
240 мкмоль	/мг Хл-ч.
Юрайб	и Ягендорф [930, 931]	исследовали	специфичность

действия отдельных органических кислот в отношении индуци­ рования ими образования АТФ при переносе хлоропластов из кислой среды в слабощелочную. Оказалось, что колебания выхода АТФ в зависимости от индивидуальных особенностей растений шпината (из которых выделяли хлоропласты) и от се­ зона проведения опытов превышали различия, обусловленные изменениями в структуре применявшихся органических кислот. Алифатические дикарбоновые кислоты с четырьмя или пятью

углеродными	атомами	и с первой константой	диссоциации
(1 рКа.) от 4,2	до 4,4, а	второй (2 рКа) от 5,3 до	5,5 оказались
более эффективными.

Выход АТФ зависел как от различий в скорости проникно­ вения органических кислот через мембраны, так и от отравля­ ющего действия самих кислот. Для сукцината при рН 6,5 (когда эта кислота представляет собою дианион) скорость проникнове­ ния в частицы хлоропластов очень мала. Сукцинат быстро про­ никает внутрь, когда рН 4,0, но в этом случае происходит быстрое отравление ферментов фосфорилирования. При таком рН относительно неэффективные дикарбоновые кислоты, такие как малонат, обладают низкой скоростью проникновения через мембраны. Неэффективным является ацетат, который, хотя и обладает высокой проникающей способностью как в недиссоциированном состоянии, так и в виде аниона, но не задерживается в структурах при переносе хлоропластов из среды рН 4 в сре­ ду рН 8.

Высказано предположение, что недиссоциированные кислоты служат переносчиками своих протонов внутрь ламелл. Обра­ щалось также внимание [571] и на возможность немедленного гидролиза образованного АТФ за счет активности АТФ-азы

[227, 799]. Дополнительным исследованием установлено,		что	в
отсутствие специальных индукторов АТФ-азы	(типа дитиотреи-
тола) такой гидролиз не происходит. Расчеты	показали,	что	в
194

оптимальных условиях образуется 1 моль АТФ на 4 моль Хл

[ 5 4 9 , 5 3 2 ] .

Можно допустить, что при таком типе образования АТФ транспорт электронов не протекает. Действительно, с позиций хемиосмотической теории, в данном случае через мембрану пере­ носятся протоны, но не электроны. Однако группой Ягендорфа было обнаружено сильное ингибирование образования АТФ в результате кислотно-щелочных переходов при действии раз­ общителей ЭТЦ в хлоропластах (хлористого аммония, атебрина, КЦФГ, фенилацетата). Если исключить возможность транспорта электронов, то механизм действия этих ингибиторов не очень понятен.

Количественная оценка протонного градиента, образуемого при освещении, показала, что 1 моль протонов приходится на 1 моль Хл. Величина рН проявляет зависимость от инициируе­ мого светом сопряженного переноса электронов, причем уровень протонного градиента пропорционален интенсивности освещения, концентрации хлорофилла и осмотически активных веществ. Скорость изменений и величина градиента рН увеличивается в присутствии кофакторов ЦФФ и НФФ.

Карлиш и Аврон [572] установили, что индуцируемые светом изменения рН обнаруживают кинетику первого порядка процес­ сов образования и разрушения, константы скоростей которых мало зависят от рН в пределах рН 6—8, но с уменьшением рН в этих пределах увеличивается доступность мест связывания протонов хлоропластами. Определенная задержка в изменении фиксируемого рН по сравнению с изменениями ХЕ зависит от медленной реакции стеклянного электрода.

Изава [532] определял отношения	ХЕ/ + Н+ при разных рН
в присутствии ФМС (или пиоцианина)	или виологена. При рН

5 и 6 это отношение составляло 1/2, а при рН 8 ХЕ не образо­

вывался. П р и о ч е н ь		в ы с о к и х		к о н ц е н т р а ц и я х			Ф М С
п о г л о щ е н и я	п р о т о н о в		не п р о и с х о д и л о ,				х о т я
у р о в е н ь о б р а з о в а н и я ХЕ б ы л в е с ь м а						в ы с о к и м .
В первых измерениях было установлено, что в процессе вос­
становления феррицианида отношение Н+/е~ > 1					[756].		Позднее,
используя освещение		в области 730 нм в отсутствие				кофактора
и судя о работе	ЭТЦ по окислению Цит f, Аврон и Чане [201]
показали, что при переносе на каждый электрон						приходится
три протона. Линн и Браун			[687],	основываясь	на	измерении

начальной скорости поглощения протонов по отношению к ки­

слороду с использованием в роли					акцептора электрона хлора-
нила	или бензохинона, определили				Н + / е _	= 2. Карлиш и Аврон
[572]	получали	разные		величины	отношения Н+/е _		(от 1 до 6)
в пределах рН		от 6 до		8 при изменении		условий	проведения
реакции.
Одноклеточная			галофитная водоросль			Dunaliella	parva, оби­
тающая в Мертвом			море, как и хлорелла с одним				чашеобраз-

13*

195

ным хлоропластом, занимающим почти половину объема клет­ ки, явилась удачным объектом для изучения влияния индуциру­ емого светом поглощения протонов на выделение кислорода при проверке хемиосмотической теории Митчелла [221]. Выбор этого объекта вместо хлоропласта связан с тем, что, во-первых, не приходится прибегать к препаративным процедурам выделения хлоропласта, а во-вторых, через внешнюю цитоплазматическую мембрану почти свободно проходят нейтральные молекулы сахарозы и даже инулина, молекулярный вес которого 5000— 6000. Мембрана целого хлоропласта или ламеллы для инулина непроницаема.

Изучение «протонной помпы» на дуналиелле выявило опре­ деленное сходство между этой водорослью и изолированными хлоропластами высших растений. Индуцируемое светом погло­

щение протонов как на водоросли, так и у изолированных				хлоро­
пластов носит	обратимый	характер и оказывается сходным
даже в количественном выражении (2—6 и 1—6 мкмоль				Н+1мг
Хл-лшк соответственно для		дуналиеллы и для	изолированных
хлоропластов)	в зависимости от электронного		акцептора	[536].

Определенные стехиометрические отношения между процес­ сами переноса электронов, протонов и образованием АТФ явля­ ются важной характерной чертой хемиосмотической гипотезы Митчелла, результаты же измерений отношения Н+/е~ оказались невоспроизводимыми. Отсутствие такой воспроизводимости сто­ ронники хемиосмотической теории объясняют изменением рН и других условий и «утечкой» протонов.

Количественные соотношения между вызываемыми переме­ щениями протонов и синтезом АТФ на свету (—уН+/~Р) были изучены Шварцем [856]. При наличии в среде с хлоропластами Фн , АДФ и метилвиологена величина этого отношения рав­ нялась 2. Шварц пришел к следующим заключениям: а) АТФ синтезируется только в том случае, если уровень освещения превышает определенную величину; б) значительная часть по­ стоянного градиента рН, полученная при высоких интенсивностях света, строится ниже этой критической величины; в) при интен­ сивности освещения выше критической скорость синтеза АТФ прямо пропорциональна соответствующему превышению протон­ ного градиента.

Недавно Саа, Изава и Гуд [835] исследовали на хлороплас­ тах зависимость ФФ от интенсивности актиничного света в обла­ сти низких уровней освещения, т. е. не выше 5-Ю3 эрг\см1-сек. Обнаружено, что при величине интенсивности ниже порога, при котором ФФ казалось бы невозможным, оно все же происхо­ дило вопреки посылкам хемиосмотической гипотезы об «утечке» потенциала в присутствии веществ, которые повышали прони­ цаемость мембран,— 2,4-ДНФ, грамицидина, валиномицина. Однако при низких интенсивностях света разобщающее действие этих веществ действительно оказалось более сильным, чем дей-

ствие метиламина, атебрина, тритона Х-100 и ионов серебра. Гривилле [446] полагает, что эти суммированные выше данные Шварца можно рассматривать в рамках как хемиосмотической,

так и химической	теории	~		[АТФ]		,
		сопряжения. Отношению —			;	— '
	V	V	[АДФ][Фн]
определяющему критическую протондвижущую			силу, в		рамках
		[X ~	11
химической теории	соответствует отношение		. По		любой
		[Х][1]

из них можно определить критическую интенсивность освещения, при которой может начаться синтез АТФ, и поэтому при осве­ щенности выше критической скорость фосфорилирования может быть определена с помощью каждого из этих отношений.

Как подчеркивалось выше, согласно хемиосмотической тео­ рии, необходимым условием образования АТФ является цело­ стность мембран. Перенос протона рассматривается как весьма важный, но все же частный случай переноса катиона через мембрану [446, 90]. Вообще, in vivo наблюдается чрезвычайно широкий и быстрый обмен ионов, тогда как in vitro митохондрии и хлоропласты в значительной мере утрачивают контроль над процессами ионного транспорта.

Обмен ионов стимулируется светом [697]. В литературе об­ суждалось взаимодействие при поглощении катионов калия, кальция, магния, железа, рубидия, марганца, цинка и др.. [775, 877]. Представлены электронномикроскопические данные о за­ мещении кальция и стронция в ламеллах хлоропластов шпината в условиях гидролиза АТФ, причем депозитанты локализованы на внутренней поверхности тилакоида [774]. При изучении пере­ носа анионов и катионов применяют дифференцированный подход. Проводится резкое разграничение переноса одно- и двухвалентных катионов, хотя считается, что для изолированных хлоропластов не характерна широкая транслокация одновалент­ ных катионов. Тем не менее подсчитано, что in vivo за одну — две минуты через мембранные структуры может переместиться количество соли, сравнимое по массе с весом этих структур [90].

Молотковский и Дзюбенко [733] показали, что хлоропласты, освобожденные от катионов электродиализмом, не способны со­ здавать градиент рН до внесения в реакционные смеси хлористого калия, и тем самым подтвердили необходимость переноса ка­ тионов, уравновешивающих перенос протонов.

Диллей и Верной [341], а также Крофтс с соавт. [325] еще ранее показали, что при освещении хлоропластов в ответ на освобождение протонов происходит поглощение катионов калия (до 0,2 мкмоль/мг Хл) или других катионов. Поглощение ионов аммония оказалось тесно сопряженным с переносом электронов [323, 325, 326, 788].

Нишизаки и Ягендорф в порядке альтернативы к перемеще­ нию протона рассматривали перенос катионов через мембрану и возможность в связи с этим образования высокоэнергетического

состояния,		обусловленного	именно	переносом катионов	[767].
Эти	авторы	пришли к заключению, что вход катионов не являет­
ся	прямой причиной образования АТФ. С другой стороны, нель­
зя	сбрасывать со счетов возможную роль в образовании				АТФ
перемещения органических			кислот	через мембраны [931,	930].

Для объяснения механизма образования трансмембранного потенциала в последние годы стали широко использовать способ­ ность некоторых антибиотиков повышать проницаемость мембран для катионов.

К антибиотикам транспорта катионов относят две группы ве­ ществ: типа валиномицина и типа нигерицина [446]. Названия даны по наиболее изученным представителям. Антибиотики типа валиномицина включают циклические депсипептиды (валиномицин), пептиды с открытой цепью (грамицидины) и макротетралиды (нонактин). Они представляют собой липорастворимые вещества с низким молекулярным весом, без ионизируемых ос­ новных или кислотных групп. В присутствии разобщителей, допус­ кающих перенос протонов, валиномицин облегчает обмен К + и Н+.

Как же «работает» валиномицин? Это—циклический полнпептид с шестью атомами кислорода внутри кольца, располо­ женными октаэдрально-симметрично. Размер кольца таков, что валиномицин проявляет сродство к ионам калия, рубидия и це­ зия, но не соединяется, например, с натрием или литием. Вали­ номицин может находиться в двух конформациях — закрытой или открытой, когда он способен «отдавать» или «принимать» ион. Внешняя часть молекулы обладает ярко выраженными гидро­ фобными свойствами, так что комплекс антибиотик — ион хоро­ шо растворим в органических растворителях. Благодаря таким свойствам валиномицин способствует переносу калия из водной в органическую фазу. Таким образом, валиномицин способен быстро пересекать мембрану после соединения в ионный комп­ лекс с металлом и возвращаться в «некомплексной» форме, без изменения суммарного заряда—теперь в виде карбоксильной группы. Поэтому антибиотики типа валиномицина пассивно уве­ личивают проницаемость липидных мембран к указанным катио­ нам. Зато грамицидин А взаимодействуете Н + , литием и натри­ ем [172]. По-видимому, эта избирательность зависит от разме­ ров гидратированных ионов, которые могут «подходить» для молекулы антибиотика.

В противоположность антибиотикам типа валиномицина, пе­ реносчики типа нигерицина обладают диссоциирующей карбок­ сильной группой [651]. Шавнт, Сан-Пьетро и др. [859, 788] по­ казали, что нигерицин разобщает ФФ от транспорта электронов. При использовании искусственных и митохондриальных мембран удалось показать, что антибиотики нигерицинового типа увели­ чивают проницаемость таких мембран к щелочным катионам и протонам.

Е. А. Либерман, А. А. Ясайтис, В. П. Скулачев и другие советские исследователи [20] внесли существенный вклад в изу­ чение трансмембранного электрофореза. Изолированные мем­ браны, которые сохраняют способность к фосфорилированию и транспорту электронов («сопрягающие» мембраны), способны к осуществлению переноса любого иона за счет энергии переноса электрона или же энергии гидролиза АТФ. Анноны и катионы переносятся в противоположных направлениях, причем процесс неспецифичен по отношению к структуре иона и может быть про­ демонстрирован на различных синтетических ионизированных соединениях. Важным условием для осуществления возможности такого переноса является наличие высокой проникающей спо­ собности переносимых ионов.

Свойства валиномицина и ряда других антибиотиков позволя­ ют им быть пассивными переносчиками ионов через мембраны — ионофорами. Возникает следующий вопрос: под действием каких сил происходит обмен ионами? Например, при работе ЭТЦ, ини­ циируемой окислением сукцината, концентрация ионов калия внутри митохондрий в растворе 6 иМ ацетата калия в 80 раз выше, чем в растворе. В результате действия ингибитора дыха­ ния концентрации выравниваются.

Митчелл считает, что данные по механизму действия анти­

биотиков подтверждают правильность хемиосмотической концеп­
ции. Если действие разобщителей типа	2,4-ДНФ заключается
в «коротком замыкании», т. е. нарушении	непроницаемости для

протонов, то действие валиномицина — в повышении проницае­ мости мембран для ионов калия. Хемиосмотическая гипотеза, как отмечалось выше, претерпела существенные изменения под влиянием фактов, которые свидетельствовали о том, что индуци­ руемые светом изменения рН не могут быть во многих случаях условием образования АТФ.

Например, не удается обнаружить протонной помпы в субхло­ ропластных частицах, полученных в результате обработки их дигитонином, хотя эти же частицы сохранили частичную актив­ ность к ФФ [759, 573, 753). Образование АТФ не ингибируется такими частицами в присутствии хлористого аммония и нигернцина. Устойчиво к таким воздействиям и ЦФФ, катализируемое ФМС [689]. Образование АТФ, обусловленное кислотно-щелоч­ ными переходами, или же фосфорилирование в результате двух­ ступенчатого процесса при быстром изменении рН также подав­ ляются хлористым аммонием.

Исследования показали, что перенос протонов подавляется этими веществами, но подавление образования АТФ в опытах in vitro имеет место только в тех случаях, когда оно прямо зависит от переноса протонов. Исходя из этих фактов было сделано за­ ключение, что образование градиента рН является побочным результатом и в соответствии с принципом сохранения энергии