3.2.Решение обратной задачи светорассеяния для эритроцитов, используя простую форму и постоянный показатель преломления*

Вданном разделе светорассеяние зрелыми эритроцитами исследуется теоретически и экспериментально с помощью МДД и сканирующего проточного цитометра (СПЦ) соответственно. Использовалась модель формы в виде двояковогнутого диска, и исследовалось влияние ориентации эритроцита относительно падающего излучения на его индикатрису. Проведены вычисления индикатрис для нескольких диаметров и объёмов эритроцитов, и показано их согласие с экспериментом. Также моделировались индикатрисы для приближённых моделей эритроцита: шарового диска и сплюснутого сфероида, рассматривая две ориентации: с осью симметрии вдоль и перпендикулярно падающему излучению. Удовлетворительным приближением можно назвать только модель сплюснутого сфероида для ориентации оси симметрии эритроцита перпендикулярно оптической оси.

3.2.1.Методология моделирования

Вкачестве модели формулы эритроцита использовалась формула (173) с параметрами Эванса и Фанга [208], что эквивалентно:

z(ρ)= ±ηD 1−(2ρ D)2 (0.1583 +1.5262(2ρ D)2 −0.8579(2ρ D)4 )

(176)

для определённых значений D и отношения размеров η = h/D. Эта форма схематично показана на рис. 34. Мы расширили эту одиночную форму до множества, разрешив варьирование η и D в формуле (176). В данном разделе мы используем простейший подход, фиксируя показатель преломления эритроцита равным 1.40 (относительный показатель преломления 1.05), что соответствует типичной концентрации гемоглобина (см. формулу (175) и таблицу 12). Также мы пренебрегаем мнимой частью показателя преломления.

Моделирование индикатрис производилось предшественницей программы ADDA, которая была основана на той же формулировке МДД, но имела намного меньшую вычислительную эффективность чем последняя версия (см. подраздел 2.4.2).

Рассматривалась длина волны 0.6328 мкм, соответствующая λ = 0.4733 мкм в среде.

* Результаты данного раздела опубликованны в Yurkin M.A., Semyanov K.A., Tarasov P.A., Chernyshev A.V., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Experimental and theoretical study of light scattering by individual mature red blood cells with scanning flow cytometry and discrete dipole approximation. // Appl. Opt. – 2005. – V.44. – P.5249-5256.

143

X

Z'

рас

X' β

θ

пад

ϕ

Y'

Y

Z

Рис. 34. Форма зрелого эритроцита и его ориентация относительно падающего света. xyz это лабораторная система отсчёта, а x′y′z′ – связанная с эритроцитом (z′ – ось симметрии); “пад” и “рас” обозначают вектора распространения падающего и рассеянного света соответственно.

	30
	20
), %	10
(θ
11
S	0
ошибка
	-10
Относительная	-20
	-30
	-40	d = λ/5
		d = λ/10
	-50	d = λ/20
	-60	30	60	90	120	150	180
	0
			Угол рассеяния θ, градусы

Рис. 35. Относительные ошибки при МДД моделировании шара с диаметром 4.56 мкм и m = 1.10 для различных дискретизаций (в сравнении с теорией Ми).

Размер диполя d был в диапазоне λ/11–λ/8 для различных размеров эритроцита из-за негибкости размера вычислительной решётки в старой программе. Для оценки точности МДД для данных задач мы сравнили результаты МДД с точным решением Ми для шаров диаметром 4.56 мкм и относительным показателем преломления 1.10. Относительная ошибка S11 как функция угла рассеяния приведена на рис. 35 для трёх значений d: λ/5, λ/10 и λ/20. Относительная погрешность при d = λ/5 составляют примерно 10% для углов рассеяния меньше 50°. Эта точность достаточна для сравнения с экспериментальными индикатрисами, измеренными в диапазоне углов от 10° до 50°.

144

3.2.2. Экспериментальный метод и процедура обращения

Эксперименты проводились на СПЦ, лазерный луч которого (λ = 0.6328 мкм) направлен вдоль гидродинамически сфокусированного потока, в котором движутся анализируемые клетки. Измеряемая интенсивность I(θ ) описывается формулой (1), но при интегрировании по азимутальному углу второй член под интегралом исчезает, ввиду осесимметричности эритроцитов [см. формулу (A5) из приложения A2; мы также проверяли это напрямую для всех вычислений]. Поэтому измеряемая интенсивность есть усреднённый по азимутальному углу S11. Наш прибор позволял надёжно измерять индикатрису в угловом диапазоне 10°–50° (из-за динамического диапазона аналоговоцифрового преобразователя).

Цельная венозная кровь была взята у здорового донора с использованием антикоагулянта ЭДТА (калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Далее клетки разбавлялись забуференным физиологическим раствором до концентрации

106 клеток/мл и хранились при комнатной температуре (23°C) не более трёх часов до измерений. С помощью СПЦ мы последовательно измерили 3000 индикатрис эритроцитов, каждая из которых сравнивалась с каждой из вычисленных индикатрис

(см. подраздел 3.2.4) взвешенным χ2 методом:

2

1

n

2

2

χ

=

∑i=1

[I

exp

(θ

i

) − I

th

(θ

i

)]

w

(θ

i

) ,

(177)

n

где Iexp(θi) это экспериментальная индикатриса,

измеренная для n углов θi

(θ1 = 10°,

θn = 50°), Ith(θi) – теоретическая индикатриса, вычисленная для тех же углов, а w(θi) – следующая весовая функция:

	2			θ	i	−θ
w(θi ) = sin			π	θ		1		,	(178)
						−θ
					n	1

что соответствует стандартному окну Хенинга, которое сильно уменьшает влияние разрывов в начале и конце измерительного диапазона СПЦ [38]. Более того, эта функция напоминает аппаратную функцию СПЦ [22] и упрощает визуальное восприятие индикатрис, так как логарифмический масштаб можно заменить линейным. Мы считаем, что анализируемый эритроцит имеет те же характеристики, что и ближайшая модель (по χ2 расстоянию), если значение χ2 меньше заданного уровня. Последний был эмпирически выбран равным 40.

3.2.3. Эффект формы и ориентации

Используя МДД, мы исследовали влияние ориентации двояковогнутого диска на его индикатрису. Для этого мы варьировали угол Эйлера β – угол между осью

145

Интенсивность I(θ )

104

103

102

β= 90°

β= 70°

β= 50°

β= 30°

β= 0°

(а)

	101
1 200								(б)
1 000
(θ )	800
)I
. w(θ	600
.интен
	400
Модиф
	200
	0	15	20	25	30	35	40	45	50
	10
				Угол рассеяния θ, градусы

Рис. 36. (а) Исходная в логарифмическом масштабе и (б) модифицированная индикатрисы, вычисленные с помощью МДД для пяти ориентаций двояковогнутого диска относительно падающего света.

симметрии частицы и направлением распространения падающего света (рис. 34).

Использовалась форма, определённая формулой (176) с D = 8.28 мкм и η = 0.323, что приводит к V = 110 мкм3. Индикатрисы для пяти ориентаций показаны на рис. 36(а), а

после умножения на весовую функцию w(θ ) – на рис. 36(б). Видно, что ориентация существенно влияет на индикатрису. В частности, средняя интенсивность в диапазоне от 15° до 50° мала для симметричной ориентации (β = 0°), а при увеличении β исчезает колебательная структура. Следовательно средняя интенсивность и структура индикатрисы являются индикаторами ориентации эритроцита в СПЦ.

На практике интересно знать чувствительность индикатрисы к объёму и диаметру двояковогнутого диска, когда его ось перпендикулярна падающему лучу (т.е. при

β = 90°). Последнее условие вызвано ориентирующим эффектом гидрофокусирующей головки в СПЦ, в которой несферические частицы ориентируются длинной осью вдоль линий тока [225]. Мы вычислили индикатрисы эритроцитов с V = 100 мкм3 и различными диаметрами – результаты приведены на рис. 37(а). Также мы варьировали

146

	1400
	1200					D = 8.28 мкм, η = 0.294
						D = 7.60 мкм, η = 0.380
	1000					D = 6.75 мкм, η = 0.542
)							V = 100 мкм3
)I(θ	800						β = 90°
. w(θ
	600
интен								(а)
Модиф.	400
	200
	0
	1200					V = 110 мкм3, η = 0.595
						V = 100 мкм3, η = 0.541
	1000					V = 92 мкм3,		η = 0.498
)							D = 6.75 мкм
)I(θ	800
							β = 90°
. w(θ
	600
.интен								(б)
	400
Модиф
	200
	0	15	20	25	30	35	40	45	50
	10
				Угол рассеяния θ, градусы

Рис. 37. Модифицированные индикатрисы двояковогнутых дисков (а) с разными диаметрами при постоянном объёме и (б) с разными объёмами при постоянном диаметре.

толщину эритроцита, что эквивалентно изменению объёма при постоянном диаметре

D = 6.75 мкм – результаты для трёх объёмов показаны на рис. 37(б). Изменения как диаметра, так и объёма не сильно изменяют интенсивность, в то время как контраст колебательной структуры, который характеризует относительную разницу между максимумами и минимумами [22], увеличивается с отношением размеров η.

Приведённые результаты позволяют сделать вывод, что перпендикулярная ориентация относительно падающего луча приводит к низкой чувствительности индикатрисы к характеристикам эритроцита. Напротив, ориентация осью вдоль луча

(т.е. β = 0°) более предпочтительна при решении обратной задаче светорассеяния, так как колебательная структура индикатрисы более чувствительна к изменениям характеристик (данные не приведены). К сожалению, как обсуждается в подразделе

3.2.4, ориентация эритроцитов в СПЦ близка к β = 90°.

147