Вопросы для самоконтроля.

1. Объясните принципы цветных реакций на белки и аминокислоты.

2. Как каждое из приведенных ниже полипептидов ведет себя при различных цветных реакциях на белок: треонил-аспарагил-лизил-тирозил-глутаминовая кислота и серил-цистеил-аланин?

3. Все ли пептиды дают положительную биуретовую реакцию?

4. Почему пролин дает с нингидрином желтую окраску?

5. Наблюдается ли положительная реакция Фоля в присутствии метионина? Почему?

Лабораторная работа № 2. Хроматографический метод определения аминокислот

Теоретическая часть.

Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков, липидов и их метаболитов. В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ хроматографию подразделяют на несколько видов:

адсорбционная — основана на различной способности отдельных компонентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента;

распределительная — основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях:

ионообменная — основана на различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы сорбента;

осадочная — основана на образовании труднорастворимых осадков в определенной последовательности;

диффузионная — основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул (гель-фильтрация).

Различают хроматографические методы анализа и по технике выполнения их: колоночная и плоскостная (на бумаге или в тонком слое). В зависимости от агрегатного состояния фаз хроматографию подразделяют на газовую, жидкостную и газожидкостную. Различаются виды хроматографии и по направлению движения растворителя (подвижной фазы): восходящая, нисходящая, одномерная, двухмерная и радиальная.

Практическая часть.

Радиальная (распределительная) жидкостная хроматография

Принцип метода. Отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель, например, фенол, бутанол с уксусной кислотой. Из двух частично смешивающихся жидкостей один растворитель должен быть полярным - неподвижная фаза, а другой неполярным — подвижная фаза. Более гидрофобная аминокислота или другое вещество, лучше растворяющееся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматографического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.

Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри. Растворитель перемещается от центра к периферии и захватывает аминокислоты, которые распределяются концентрическими кругами и обнаруживаются после высушивания бумаги и проведения нингидриновой реакции.

Реактивы: 0,5% раствор смеси аминокислот: аланин, аргинина и лейцина. Можно использовать смесь других аминокислот, Rf которых при работе с соответствующими растворителями резко отличаются друг от друга. Растворитель: смешивают 40 мл бутилового спирта, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл дистиллированной воды. После расслоения используют верхний слой уксусной кислоты с бутанолом, насыщенный водой. 0,1% раствор нингидрина на водонасыщенном бутиловом спирте.

Ход работы: На диске фильтровальной бумаги с помощью 2-х параллельных разрезов выделяют бумажный «хвостик». Разрезы должны проходить от края до середины диска и располагаться друг от друга на расстоянии 1см. Затем бумажный «хвостик» укорачивают на 1,5 — 2см и отгибают по месту соединения с бумагой перпендикулярно плоскости диска. Для получения при хроматографии вполне круглых зон необходимо, чтобы длина разрезов была одинаковой (рис.1). Раствор смеси аминокислот (0,002 мл) наносят на место сгиба и высушивают на воздухе. Затем бумажный диск помещают между двумя половинками чашки Петри, нижняя из которых наполовину заполнена растворителем.

Скорость хроматографирования зависит от ширины «хвостика» и от расстояния между поверхностью жидкости и поверхностью бумаги, а также от качества фильтровальной бумаги.

Через 1 час, когда растворитель на диске фильтровальной бумаги будет иметь диаметр 6-7 см, бумагу высушивают на воздухе или в сушильном шкафу при температуре 70 — 80⁰С для удаления растворителя. Высушенную хроматограмму быстро, одним движением, смачивают раствором нингидрина, налитым в чашку Петри, и вновь высушивают в сушильном шкафу при температуре 90-100⁰С в течение 5 минут. При этом проявляются аминокислоты в виде трех колец, окрашенных в фиолетово-красный цвет, которые указывают на разделение аланина, аргинина и лейцина.

Рис 1 Заготовка для хроматограммы Рис. 2 Хроматограмма.

Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент Rf или скорость перемещения по формуле: а/b, где а — расстояние в миллиметрах, пройденное аминокислотой от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна; b — расстояние в миллиметрах от места нанесения аминокислоты (линии старта) до фронта растворителя (рис. 2). Чем меньше растворимость аминокислоты в воде и чем больше ее растворимость в органическом растворителе, тем быстрее она движется вслед за фронтом органического растворителя, тем больше величина Rf, и, наоборот, чем больше ее растворимость в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и тем меньше величина Rf. Сравнивают коэффициент распределения известных стандартных аминокислот с коэффициентом распределения аминокислот, полученных для исследуемой смеси и определяют наличие отдельных аминокислот в исследуемом материале. Rf для аланина должно быть в пределах от 0,40 до 0,42; для аргинина — 0,12-0,20; для лейцина — 0,60-0,72.