- •Лабораторная работа № 1 цветные реакциии на белки и аминокислоты.
- •1. Биуретовая реакция
- •2. Нингидриновая реакция.
- •3. Ксантопротеиновая реакция (Мульдера).
- •4. Реакция Фоля.
- •5. Реакция на тирозин (Миллона).
- •Вопросы для самоконтроля.
- •Лабораторная работа № 2. Хроматографический метод определения аминокислот
- •Радиальная (распределительная) жидкостная хроматография
- •Вопросы для самоконтроля:
- •Лабораторная работа № 3 кислотный гидролиз и формоловое титрование по серенсену.
- •1. Кислотный гидролиз.
- •2. Формоловое титрование.
- •Вопросы для самоконтроля:
- •Лабораторная работа № 4 физико-химические свойства белков.
- •1. Осаждение белков при кипячении.
- •2. Реакции осаждения белков при комнатной температуре нейтральными солями — высаливание.
- •3. Диализ белка.
- •4. Осаждение белков солями тяжелых металлов.
- •5. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами
- •6. Осаждение белков органическими кислотами.
- •7. Осаждение белков органическими растворителями.
- •8. Осаждение белков алкалоидными реактивами.
- •Вопросы для самоконтроля:
- •Лабораторная работа № 5. Строение сложных белков.
- •Н уклеопротеиды
- •1. Гидролиз нуклеопротеидов.
- •2. Качественные реакции на открытие составных частей нуклеопротеидов.
- •Вопросы для самоконтроля:
- •Лабораторная работа № 6 ферменты.
- •1. Влияние реакции среды на активность амилазы.
- •2. Специфичность действия ферментов.
- •3. Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы.
- •4. Активность α-амилазы слюны (количественное определение).
- •Вопросы для самоконтроля:
- •Лабораторная работа № 7 витамины.
- •1. Качественная реакция на витамин в2.
- •2. Качественная реакция на витамин рр.
- •3. Качественная реакция на витамин в6.
- •4. Качественная реакция на витамин с.
- •5. Качественная реакция на викасол (жирорастворимые витамины).
- •Вопросы для самоконтроля:
- •Лабораторная работа № 8 липиды.
- •1. Растворимость и эмульгирование жиров.
- •2. Гидролиз (омыление) жира.
- •3. Открытие в гидролизате составных частей жира.
- •4. Открытие ненасыщенности жирных кислот в жире.
- •5. Получение нерастворимых солей высших жирных кислот.
- •6. Гидролиз лецитина (фосфатидилхолина).
- •7. Качественная реакция на холестерин (реакция Шиффа).
- •Вопросы для самоконтроля:
- •Лабораторная работа № 9 углеводы.
- •1. Доказательство наличия гидроксильных групп
- •2. Доказательство наличия карбонильных групп (альдегидная проба Мура).
- •3. Реакции восстановления металлов и окисления моносахаридов.
- •3А. Проба Троммера.
- •3Б. Проба Фелинга.
- •3В. Получение серебряного зеркала.
- •3Г. Проба Подобедова — Молиша с α- нафтолом.
- •3Д. Проба Барфеда.
- •4. Качественные реакции на дисахариды
- •4А. Реакции на сахарозу.
- •4Б. Реакция на мальтозу и лактозу
- •5. Цветные реакции на крахмал и гликоген.
- •6. Гидролиз крахмала.
- •7. Гидролиз клетчатки.
Вопросы для самоконтроля:
Какие существуют разновидности хроматографического метода разделения веществ?
В чем заключается сущность хроматографического метода определения аминокислот на фильтровальной бумаге?
Какая фаза растворителя в данной работе является подвижной, а какая – неподвижной?
От чего зависит коэффициент распределения аминокислот?
Для чего в данной работе проделывают реакцию с нингидрином?
Лабораторная работа № 3 кислотный гидролиз и формоловое титрование по серенсену.
Теоретическая часть.
Гидролиз — распад сложного вещества на более простые составные части, связанный с присоединением воды по месту разрыва связей.
В зависимости от применяющегося катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.
Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом исследования для расшифровки первичной структуры белков. При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин — частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов для парентерального питания.
Практическая часть.
1. Кислотный гидролиз.
При кислотном гидролизе белки распадаются на высокомолекулярные пептиды, низкомолекулярные пептиды, дипептиды и аминокислоты. Полный гидролиз белка протекает при многочасовом кипячении раствора в круглодонной колбе с воздушным холодильником в присутствии хлористоводородной или серной кислоты.
Реактивы: хлористоводородная кислота концентрированная.
Ход работы: Белок от 2-х куриных яиц растворяют в 1 литре воды, фильтруют через 4 слоя марли. Раствор переносят в большую круглодонную колбу с воздушным холодильником и добавляют 250 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь кипятят 45 мин от начала кипения, затем фильтруют.
2. Формоловое титрование.
Служит для определения количества карбоксильных групп, которое увеличивается вследствие разрыва пептидных связей в процессе гидролиза. В водных растворах аминокислоты образуют внутримолекулярные соли, например глицин:
Поэтому без предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом непосредственно титровать карбоксильные — группы аминокислот щелочью невозможно.
Принцип метода. В процессе реакции формальдегид блокирует α-аминогруппу. Образующееся метиленовое соединение (метилен-аминокислота) оттитровывается щелочью с образованием:
Определяя количество карбоксильных групп титрованием, одновременно можно судить и о содержании аминных групп, так как количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп. Метод формолового титрования позволяет следить за ходом гидролиза белка и изучить действие протеолитических ферментов. При полном гидролизе белка количество аминных и карбоксильных групп в гидролизате перестает увеличиваться и биуретовая реакция становится отрицательной.
Реактивы: раствор яичного белка; гидролизат белка; формалин нейтральный, 20% раствор; фенолфталеин, 0,5% раствор; едкий натр, 0,05 н раствор (готовят из 0,1 н NаОН обязательно ех temporae); едкий натр, 1% и 10%, растворы; уксусная кислота, 1% раствор.
Ход работы:
1. Титрование карбоксильных групп в растворе белка до гидролиза. Отмеривают в колбочку 1мл раствора яичного белка, приливают 5 капель 20% нейтрального раствора формалина и 3 капли 0,5% раствора фенолфталеина. Титруют из микробюретки 0,025н раствором едкого натра до устойчивой бледно-розовой окраски.
2. Титрование карбоксильных групп в гидролизате. Отмеривают в колбочку 1,25мл гидролизата, добавляют 3 капли фенолфталеина и нейтрализуют 10% раствором едкого натра из макробюретки (шприц) до слабо-розовой окраски. Щелочь используется для нейтрализации соляной кислоты, поэтому количество щелочи не учитывается. Если при нейтрализации окраска делается ярко красной, то добавляют до обесцвечивания по каплям 1% раствор уксусной кислоты, избыток которой нейтрализуют 1% раствором едкого натра до слабо-розовой окраски. Затем приливают 5 капель нейтрального 20% раствора формалина и обесцвеченный раствор титруют 0,025н раствором NаОН до бледно-розового цвета и точно отмечают количество затраченной щелочи. Производят расчет азота аминогрупп по количеству затраченной щелочи, исходя из ее нормальности. Нормальному раствору щелочи соответствует 14г азота в одном литре или 14мг в 1мл; 1 мл 0,025н раствора соответствует 0,033 мг азота.
3. Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате при помощи биуретовой реакции. В пробирку наливают 5 капель гидролизата белка и нейтрализуют 10% раствором щелочи. После нейтрализации гидролизата проводят биуретовую реакцию, прибавляя 2 капли CuSO4. Появляется фиолетово-розовое окрашивание. При полном гидролизе белка до аминокислот биуретовая реакция с гидролизатом отрицательная.