Вопросы для самоконтроля:

1. Что такое гидролиз белка, какие виды гидролиза вы знаете?

2. Каково практическое значение гидролиза белков?

3. Чем отличаются полный и неполный гидролиз?

4. Для чего служит метод формолового титрования? На чем он основан?

5. О чем говорит розовое окрашивание гидролизата белка?

Лабораторная работа № 4 физико-химические свойства белков.

Теоретическая часть.

Физико-химические свойства белков в значительной степени определяются их высоким молекулярным весом, амфотерностью аминокислот и лабильностью вторичной и третичной структур белка. Водородные связи, поддерживающие вторичную структуру белка, очень не прочны и легко разрушаются уже при нагревании раствора белка до 60-70°С или при действии 8М раствором мочевины. В результате наблюдается, так называемое, плавление вторичной структуры белка, ведущее к изменению таких физико-химических свойств раствора белка, как светорассеяние, вязкость и оптическое вращение. Белок с разрушенной вторичной структурой становится гидрофобным и имеет тенденцию выпадать в осадок.

Существует большое количество разнообразных реакций осаждения белков. Они делятся на обратимые и необратимые.

Значение реакций осаждения белков в том, что они дают возможность:1) научить свойства белков, 2) освободить жидкость от присутствия белка, что бывает необходимо при некоторых исследованиях, 3) установить наличие белка, например в моче при различных патологических состояниях. Реакции осаждения белков с помощью концентраций сернокислого аммония или других нейтральных солей позволяют разделить отдельные белковые фракции: альбумины и глобулины.

Практическая часть.

1. Осаждение белков при кипячении.

Принцип метода: Присутствие белков открывается кипячением, поскольку почти все белки свертываются при нагревании в нейтральной или слабокислой среде. В сильнокислых и щелочных средах раствор белка при кипячении не коагулирует и может дать осадок лишь при добавлении достаточного количества какой-нибудь нейтральной соли (NаС1). Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения положительного заряда в случае сильно кислой среды и усиления отрицательного — в щелочной среде.

Полное и быстрое осаждение белков происходит при достижении изоэлектрической точки. Изоэлектрической точкой называется такое значение рН, при котором частицы белка не передвигаются в электрическом поле ни к аноду, ни к катоду, и, следовательно, суммарный электрический заряд их равен нулю. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (рН около 5), за исключением протаминов и гистонов, имеющих изоэлектрическую точку в щелочной среде (рН около 8). Это объясняется тем, что протамины и гистоны в отличие от других белков содержат избыток диаминомонокарбоновых кислот — аргинина, лизина, гистидина, обуславливающих щелочной характер белка.

Итак, важную роль в свертывании белков при нагревании играет концентрация водородных ионов, т.е. реакция среды, и присутствие солей.

Реактивы: раствор яичного белка; уксусная кислота, 1% раствор; едкий натр, 10% раствор; хлористый натрий, насыщенный раствор.

Ход работы: Эта работа проводиться с целью выяснения значения рН для растворимости белков при нагревании. Сравнивают отношение к нагреванию нейтральных, слабокислых и сильнокислых, а также щелочных растворов белка.

В 5 пробирок наливают по 5 капель раствора яичного белка (без NаС1). В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают до кипения. Жидкость мутнеет, т.е. наблюдается опалесценция, поскольку разрушаются водные оболочки вокруг белка, и происходит укрупнение взвешенных его частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.

Во второй пробирке раствор белка нагревают до кипения и прибавляют 1каплю 1% раствора уксусной кислоты для слабого подкисления. При стоянии выпадает хлопьевидный осадок белка. Частицы белка теряют заряд, так как приближаются к изоэлектрическому состоянию.

В третью пробирку добавляют 5 капель 1% раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые частицы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость.

В четвёртую пробирку приливают 5 капель 1% раствора уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок белка, так как частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами NaС1.

В пятую пробирку добавляют 2 капли 10% раствора едкого натра, создавая щелочную среду. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Указания к составлению отчета. Отметить положительный результат осаждения плюсом, а отрицательный — минусом. Записать в таблицу результаты осаждения белков при кипячении в различных средах и указать в каждом случае причины появления или отсутствия осадка белка.

Осаждение белка при кипячении при различных реакциях среды.

Нейтральная среда

Слабокислая среда

Сильнокислая среда

Сильнокислая + электролит

Щелочная среда