3. Диализ белка.
Принцип метода: Удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей, например, избытка солей после высаливания, является диализ. Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и др.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.
Реактивы: раствор яичного белка; NaCl, насыщенный раствор; АgNO3; NаОН, 10% раствор; СuSO4, 1% раствор.
Ход работы: В стаканчик на 100 мл наливают 30 мл дистиллированной воды и опускают трубку для диализа, в которую предварительно был налит раствор белка куриного яйца (2мл) и добавлено 3 капли NaCl насыщенного раствора. По истечении 5-10 минут берут воду из стаканчика на анализ: проводят биуретовую реакцию на обнаружение белка и качественную реакцию на присутствие хлоридов с помощью AgNO3.
Примечание: раствор белка в трубке для диализа по уровню должен быть ниже жидкости в стакане.
4. Осаждение белков солями тяжелых металлов.
Принцип метода: К необратимым реакциям осаждения белков помимо реакции осаждения при кипячении, относятся реакции осаждения солями тяжелых металлов. В отличие от высаливания осаждение белков солями тяжелых металлов происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют, образуя с ними соли и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей азотной кислого серебра и хлористой ртути), но нерастворимые в воде.
Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатурацию. Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие появления одноименного положительного заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла в виде нерастворимых в воде осадков используется при отравлении солями ртути, меди, свинца и др., пока эти соли еще не успели всосаться. В качестве противоядия применяют белки молока, яиц.
Реактивы: раствор яичного белка для высаливания; сернокислая медь, 1% раствор; уксуснокислый свинец, 5-10% раствор.
Ход работы:
1) Осаждение белков медным купоросом. К 5 каплям раствора яичного белка прибавляют 1-2 капли 1% раствора сернокислой меди, образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. К другой такой же порции раствора белка приливают вначале1-2 капли 1% раствора сернокислой меди, а затем еще 5-10 капель и наблюдают растворение осадка в избытке реактива.
2) Осаждение белков уксуснокислым свинцом. К 5 каплям раствора яичного белка прибавляют 2 капли; 5% раствора уксуснокислого свинца. Образуется осадок, также не растворимый в воде, но легко растворяющийся в избытке осадителя.
5. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами
Принцип метода: Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белковых частиц с образованием комплексных солей из белка и кислот. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В осадке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. В связи с этим реакция осаждения белков азотной кислотой особенно распространена при клинических исследованиях мочи (проба Геллера).
Реактивы: раствор яичного белка для высаливания; азотная кислота концентрированная; серная кислота концентрированная.
Ход работы:
1) Осаждение азотной кислотой (проба Геллера). К 5 каплям концентрированной азотной кислоты приливают равный объем раствора белка осторожно по стенкам пробирки, наклонив ее под углом так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты, осадок не растворяется.
2) Осаждение серной кислотой. Проводится аналогично реакции с азотной кислотой. Однако в этом случае осадок растворяется в избытке серной кислоты.