Все лаборатарные работы

простейших, но именно инфузории (круглоресничные - прикрепленные к субстрату), такие как сувойки (Vortictlla), имеют наибольшее значение.

Механизм биологического окисления в аэробных условиях может быть представлен схемой:

микроорганизмы + органические вещества + О2 + N + P → новые микроорганизмы + CO2 + H2O + биологически неокисляемые вещества.

Реакция символизирует окисление исходных органических загрязнений и образование новой биомассы.

Для роста биомассы необходимы следующие условия:

-жизнеспособный посевной материал;

-источники энергии и углерода;

-все остальные питательные вещества, необходимые для роста биомассы;

-отсутствие ингибиторов роста;

- соответствующие физико-химические условия (температура, рН и

т. д.).

Температура - важнейший фактор, влияющий на рост биомассы. Для классификации типов роста биомассы используются три температурных интервала: психрофильный рост, для которого оптимум температур лежит ниже 10 оС; мезофильный рост, для которого оптимум температур лежит между 15 и 40 оС и термофильный рост, для которого оптимум температур выше 50 оС. Большинство процессов биологической очистки проводят при мезофильных температурах.

Все процессы микробной очистки протекают в гетерогенных условиях, включают сложную последовательность биологических реакций и лимитирующей стадией в большинстве случаев является стадия массопереноса.

Существенно влияет на рост биомассы и концентрация водородных ионов (рН среды). Биологическая очистка наиболее эффективна, если значение рН не выходит за пределы 5-9, оптимальной считается среда с рН 6,5-7,5. Отклонение рН от 5-9 влечет за собой уменьшение скорости окисления вследствие замедления обменных процессов в клетке.

Физические свойства, которые в первую очередь влияют на микробиологические свойства системы, - это растворимость газов, вязкость и др. Растворимость кислорода играет важнейшую роль в аэробных процессах, так как в таких системах процесс переноса кислорода часто является лимитирующей стадией. Далее, бактерии восприимчивы к действию различных химических веществ, которые в зависимости от их природы либо ингибируют рост бактерий, либо убивают их. Широко известен ингибитор фенол, а хлор - бактерицидный агент.

Анаэробная очистка сточных вод наиболее типична для сбраживания ила. Уменьшение его массы и количества патогенной микрофлоры в нем протекает в реакторах, называемых сентиктенками. Сентиктенки

155

представляют собой отстойники, в которых осевший ил подвергается анаэробной деградации в температурном интервале 34-38 оС, что экономически выгодно и к тому же допускает существование большего числа

микроорганизмов.

Процессы

анаэробного

сбраживания

загрязнений

включают

конверсию

сложных

органических

субстратов,

таких как полисахариды, липиды

и белки, в метан

и диоксид углерода и

протекают, в

основном,

в

бактериальной

биомассе. Это

симбиотическое

сообщество

может

менять

используемые

им пути

ферментации,

функционирует

как

саморегулирующаяся система, поддерживающая

значение

рН,

окислительно - восстановительные потенциалы и термодинамическое

равновесие

итаким

образом

обеспечивающая стабильность сбраживания. На

рис. 6.1

показаны

пути биодеградации субстрата при анаэробном

сбраживании.

I

Гидролитические (ацидогенные)

Органические кислоты,

нейтральные соединения

С1-соеди-

II

нения

Гетероацидогенные бактерии

ацетат

ацетата

Н2

СО2

III A

III В

Метаногенные бактерии,

Метаногенные бактерии, потребляю-

потребляющие СО2 и Н2

щие СН3СООН, НСООН, СН3ОН

СН4 + Н2О

СН4 + СО2

Рис. 6.1. Пути биодеградации субстрата при анаэробном сбраживании

По своим пищевым потребностям бактерии в анаэробном сбраживателе могут быть разделены на три группы:

I - гидролитические бактерии, называемые ацидогенными, так как они обеспечивают начальный гидролиз субстрата до низкомолекулярных

156

органических кислот и других малых молекул (спирты, кетоны, газы, ферменты - целлюлоза, витамины). Размеры их популяции колеблются между 105-106 и 108-109 клеток гидролитических бактерий на 1 мл сбраживаемого ила. Кроме природных субстратов, анаэробные популяции разрушают фенол и серусодержащие соединения.

II - гетероацетогенные бактерии, которые продуцируют уксусную кислоту и водород. Размеры их популяций 4·106 клеток на 1 мл сырого ила.

III - метаногенные бактерии, которые продуцируют метан. Они делятся на хемолитрофные бактерии, которые превращают водород и диоксид углерода в метан, используя газообразный водород как донор электронов:

CO2 + 4 H2 → CH4 + 2 H2O.

Микроорганизмы второй подгруппы III группы перерабатывают уксусную и муравьиную кислоту, метанол и метил-амины в метан:

СН3СООН → СН4 + СО2.

Эмпирическая брутто - формула для анаэробной биомассы - С5Н9О3N, т. е. молярное отношение С:N = 5:1, что также примерно равно массовому отношению. Отношение N:P = 5:1 одинаково применимо как для аэробной, так и анаэробной биомассы.

Одним из преимуществ анаэробных процессов перед аэробными является высокая степень превращения углерода органических веществ в метан и диоксид углерода, что сопровождается образованием меньшего количества удаляемого ила и ценного топлива - биогаза. Главный недостаток анаэробных процессов - меньшая скорость реакции по сравнению с аэробными процессами.

6.2.2. Борьба с загрязнениями окружающей среды с помощью микроорганизмов

Загрязнение биосферы происходит в результате выброса в окружающую среду ксенобиотиков, которые почти не включаются в элементные циклы углерода, азота, серы или фосфора. Эти вещества временно или постоянно накапливаются и приводят к вредным влияниям на природную флору и фауну.

Одной из важных проблем генной инженерии является создание микроорганизмов с новыми ферментативными свойствами, способных разлагать потенциально токсичные вещества до их попадания в окружающую среду или удалять вещества, уже попавшие в среду.

Токсичность ряда ксенобиотиков первоначально осталась незамеченной в основном из-за убеждения, что природные сообщества микроорганизмов способны усваивать все органические соединения. Уверенность в безопасности пошатнулась с появлением неразлагаемых

157

пестицидов, таких как дихлордифенил-трихлорэтан (ДДТ), в пищевых целях и накоплением этих веществ в высших животных.

Ниже приведены примерные значения коэффициента увеличения концентрации ДДТ в живых организмах:

109 Водная среда → Фитопланктон → Зоопланктон

106 Мелкая рыба → Крупная рыба → Скот(хищные птицы) 103.

Эти наблюдения привели к исследованию способности природных микробных популяций к детоксикации ксенобиотиков в природных условиях.

Соединение, попадающее в окружающую среду, может подвергнуться либо полной минерализации, либо частичной деградации, либо полимеризации (рис. 6.2).

Ксенобиотик

Биологическая

трансформация

Минерализация Накопление Полимеризация

Рис. 6.2

Соединения, которые подвергаются полной деградации, т. е. минерализации до диоксида углерода, воды, аммиака, сульфатов и фосфатов, обычно проходят весь метаболический путь и могут использоваться микробиологическим сообществом в качестве источника углерода и энергии.

Каждый тип окружающей среды обладает своей популяцией микроорганизмов. Вследствие гетерогенности природных популяций ксенобиотики могут подвергаться биодеградации.

Использование галогенпроизводных в качестве источника углерода и энергии требует разрыва галоген-углеродной связи. Причиной устойчивости и токсичности галогенсодержащих ксенобиотиков, используемых в качестве огнетушителей, красок, лаков, охладителей, гербицидов, пестицидов, растворителей, является труднорасщепляемая галоген-углеродная связь. Наличие дополнительных заместителей - галогенов - превращает соединение, способное к деградации, в устойчивое:

158

После расщепления галоген-углеродных связей продукты реакции легко усваиваются микроорганизмами через основные пути метаболизации. Для выделения микроорганизмов, способных к эффективному росту на данном субстрате, необходим период обогащения или селекции.

Дегалогенозами называются ферменты, катализирующие гидролиз галоген-углеродной связи, образуя оксикислоты и кетокислоты. Дегалогенирование представляет собой лимитирующую стадию в процессе утилизации субстрата. Следовательно, процесс селекции, по-видимому, заключается в увеличении скорости дегалогенирования за счет повышения содержания дегалогеноз. Это может быть достигнуто одним из трех способов отбора:

-конститутивных мутантов;

-на генную дубликацию;

-штаммов с более чем одной дегалогенозой, получаемых с помощью механизма переноса генов.

Предпосылкой деградации ксенобиотиков в природной среде является присутствие в ней структурно-родственных соединений. Природные механизмы сначала могут быть неэффективными в трансформации ксенобиотиков вследствие кинетических ограничений, вызванных субстратной специфичностью ферментов. Со временем это может быть преодолено за счет сверхпродукции этого фермента, благодаря снятию или изменению регулярного контроля его синтеза, генной дубликации, приводящей к фазовому эффекту или мутационной изменчивости, создающей фермент с измененной субстратной специфичностью. Дальнейшая адаптация может произойти благодаря адаптивной пластичности микроорганизмов с помощью генетической перестройки.

Одна из важнейших проблем для генетиков, желающих сконструировать суперштамм, способный разлагать один (или более) ксенобиотик, - отсутствие знаний о путях деградации. Наиболее изучена деградация хлорбензоатов и хлорфеноксиацетатов.

159

6.2.3.Биотехнологические альтернативы (биопестициды)

всельском хозяйстве

Пестициды используются в сельском хозяйстве для уничтожения насекомых, сорняков и болезнетворных микробов, из-за которых значительно уменьшается урожай возделываемых культур. Применяемые синтезированные химические вещества не обеспечивают должную защиту сельскохозяйственных культур в связи со специфическим местообитанием и особым поведением вредителей, выработанной устойчивостью к определенным инсектицидам и фунгицидам. Кроме того, возрастающее использование химических пестицидов оказывает вредное воздействие на людей и другие организмы, а также на окружающую среду в целом (например, ДДТ).

Применение биологических агентов для уничтожения вредителей известно давно, и в настоящее время микроорганизмы - бактерии, грибы, вирусы - нашли распространение в качестве промышленных пестицидов.

Бактерии. Бактерии в природе чрезвычайно многочисленны и имеют гибкий метаболизм, позволяющий им жить в любой части биосферы. Известно около 90 бактерий, инфицирующих насекомых. Большинство промышленных штаммов принадлежит к роду Bacillus, основная часть широко распространенных продуктов изготовлена из Bacillus thuringiensis (Bt), которых имеется свыше 22 типов.

Штаммы Bt используются для борьбы с вредителями - гусеницами, комарами, мошкой. Bt был выделен из шелковичных червяков в Японии в начале ХХ века. Препараты Bt составляют больше 0,1 % мирового производства пестицидов, однако более 90 % всех продающихся микробных пестицидов.

Грибы. Известно более 400 видов грибов, заражающих насекомых и клещей. Грибы обычно заражают своих хозяев путем прямой инвазии и, следовательно, способны, в отличие от бактерий и вирусов, вредить насекомым, не будучи ими съедены. Они не только губят тех особей, на которых поселяются, но и контролируют численность всей популяции хозяина в течение длительного периода. В некоторых случаях своевременное применение грибных спор может эффективно контролировать численность вредителей в течение роста сельскохозяйственных культур. К сожалению, эффективность грибов зависит от влажности и температуры. Чтобы сделать использование грибов эффективным, следует применять их вовремя и в оптимальном количестве.

Вирусы. Описаны свыше 1200 вирусных болезней насекомых, причем почти три четверти из них приходятся на болезни чешуекрылых. Большая часть этих болезней была обнаружена случайно, без намерения искать средства борьбы с насекомыми.

160

6.2.4. Получение металлов методом «бактериального выщелачивания» минерального сырья

К наиболее важным минералам, являющимся природным источником тех металлов, которые можно получить бактериальным выщелачиванием, относятся: пирит FeS2, халькопирит CuFeS2, халькозин CaS, сфалерит ZnS, ниллерит NiS, молибденит MoS2 и другие.

Исследования показали, что процесс бактериального выщелачивания зависит от образования серной кислоты (так как среда должна быть кислой) и ионов Fe (III), которые образуются в результате бактериального окисления из восстановленных соединений серы и ионов железа (II) cоответственно. Окислительные реакции, происходящие при бактериальном выщелачивании сульфидных минералов, могут быть представлены лучше всего при рассмотрении окисления пирита FeS2. Пирит является самым важным сульфидным минеральным субстратом для активно выщелачивающих бактерий, он содержит Fe (II) и серу, которые являются основными источниками энергии для таких бактерий.

Обычно окисление протекает по реакциям:

2 FeS2 + 7 O2 + 2 H2O → 2 FeSO4 + 2 H2SO4;

2 FeS2 + 2 H2SO4 + O2 → 2 FeSO4 + 2 H2O + S.

Эти реакции в обычных условиях идут с очень малой скоростью из-за образования слоя продуктов реакции (сера) на поверхности частиц пирита, что приводит к протеканию реакции в диффузионной области.

В присутствии бактерий, окисляющих железо и серу, эти реакции изменяются за счет бактериального окисления железа (II) и элементарной серы, образующихся в процессе химического окисления:

бактерии

4 FeSO4 + 2 H2SO4 + O2 → 2 Fe2(SO4)3 + 2 H2O ;

бактерии

2 S + 3 O2 + 2 H2O → 2 H2SO4.

И далее:

бактерии

FeS2 + Fe2(SO4)3 → 3 FeSO4 + 2 S.

Образующиеся FeSO4 и S вновь окисляются бактериями до Fe2(SO4)3 и H2SO4. Суммарное уравнение окисления пирита в присутствии бактерий имеет вид

бактерии

4 FeS2 + 15 O2 + 2 H2O → 2 Fe2(SO4)3 + 2 H2SO4.

Эта реакция протекает быстро в кинетической области. Продукты реакции (сера) не образуются на поверхности пирита, так как они окисляются бактериями.

161

Аналогичные уравнения могут быть написаны и для процессов бактериального окисления других сульфидных минералов, например Cu и Zn.

Метод «бактериального выщелачивания» имеет ряд преимуществ: он гибок, так как может быть применен для переработки различных сульфидных минералов и их смесей; не требует высоких давлений и температур; способствует образованию жидких стоков в виде водных растворов, которые могут быть легко нейтрализованы; включает реакции, которые не могут быть проведены химическим путем; может быть использован в непосредственной близости от места добычи перерабатываемых минералов.

К недостаткам можно отнести необходимость поддержания активной культуры микроорганизмов, что требует управления температурой реакции, рН и так далее.

В промышленных масштабах этот метод применяется в основном для выщелачивания куч, отвалов, отходов горнодобывающей промышленности либо в тех случаях, когда минералы могут быть подвергнуты выщелачиванию без извлечения их из земли с помощью шахт.

6.3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Загрязнение природных и сточных вод различными химическими веществами (фенолы, тяжелые металлы, нефтепродукты, поверхностноактивные вещества и другие) требует разработки специальных методов контроля и оценки их качества. Наблюдения и эксперименты с водными организмами, жизнедеятельность которых существенно нарушается в токсичной среде, могут лежать в основе оценки опасности добавок в воде. Среди водных организмов - микроорганизмы активного ила, водоросли, зоологические объекты и другие; а среди количественно измеряемых показателей биологических реакций - прирост биомассы, активность газообмена, электрофизиологические характеристики. Например, биотестирование сточных вод основано на измерении активности жизнедеятельности микроорганизмов активного ила, которые обеспечивают биологическую очистку. Микроорганизмы проявляют специфическую чувствительность к токсичным веществам, присутствующим в воде, и могут быть качественными и количественными индикаторами их присутствия.

6.3.1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ

По показателям биологических реакций живых организмов опытным путем обнаружить и оценить степень токсичности добавок в воде, характерных для отдельных производств.

Опыт 6.1

Одними из наиболее доступных и наглядных методов оценки токсичности химических веществ являются методы, основанные на изме-

162

рении дегидрогеназной активности ила из аэротенков очистных сооружений. Процессы окисления загрязняющих, прежде всего, органических веществ протекают в клетках микроорганизмов при активном воздействии ферментов. В активном иле бактерии синтезируют около ста различных ферментов. Каждый фермент селективно воздействует и катализирует обычно только одну из многочисленных стадий превращений, которые претерпевают загрязнители при их окислении.

Одними из важнейших ферментов, катализирующих непосредственно окислительно-восстановительные превращения органических компонентов,

являются дегидрогеназы.

Дегидрогеназы - ферменты, катализирующие процесс дегидрирования углеводородных субстратов. Они активируют определенные атомы водорода в молекуле субстрата, придавая им способность переходить с субстрата на соответствующий акцептор с более высоким окислительновосстановительным потенциалом. Акцептором водорода и электронов может быть кислород или другое соединение, участвующее в цепи переноса электрона и водорода. По химической природе дегидрогеназы бывают пиридиновыми и флавановыми. Они имеют в своем составе белковую часть - анофермент и кофермент (никотинамидадениндинуклеотид).

Общая дегидрогенозная активность ила (ДАИ) характеризует его биохимическую активность. Снижение величины ДАИ свидетельствует о снижении жизнедеятельности микроорганизмов и уменьшении очищаемой способности ила, что в условиях достаточной концентрации усвояемых форм органических соединений обусловлено наличием токсичных веществ.

Активность дегидрогеназ можно определить с использованием в превращениях молекулы красителя. Так, для тетразолиевых красителей характерно, что окисленные формы их бесцветны, а восстановленные - ярко окрашены.

Таким образом, молекулы указанного соединения могут акцептировать водород субстрата с помощью дегидрогеназы по следующей схеме:

дегидрогеназа	А	+ ТТХН2.
АН2 + ТТХ →
окисленная фор-		восстановленная
ма субстрата		форма красителя

163

Методика проведения работы

Принцип определения ДАИ заключается в измерении количества красного формазона, который образуется в результате восстановления бесцветной окисленной формы трифенилтетразолия хлористого (ТТХ), являющегося акцептором хлористого водорода, переносимого от окисляемых субстратов ферментами дегидрогеназами. Количество образованного формазона пропорционально активности дегидрогеназы и, соответственно, обратно пропорционально величине токсичности исследуемого объекта.

В опытах используется активный ил из аэротенков-регенераторов. Перед проведением опыта активный ил разбавляют иловой водой в соотношении 1:1 по объему. Каждый студент исследует модельный раствор сточной воды согласно варианту (табл. 6.1).

					Таблица 6.1
Ном	1	2	3	4	5	6
ер
варианта
Состав	Cu2+	Fe3+	Zn2+	Cu2+	Фенол	Хлор-
раствора,				10		амин
С, мг/л	10	10	5	Fe2+ 10	500	30
Ном	7	8	9	10	11	12
ер
варианта
Сост	м-Крезол	β-нафтол	Cu2+-	м-Крезол	Крезол-500	Cu2+
ав			5	250, фе-	β-нафтол	10
раствора	500	100	хлорамин	нол 500	100	Zn2+ 20
,			30
С,
мг/л

1.Пробу активного ила объемом 5 мл отбирают из емкости и помещают в пронумерованные 4 пробирки для центрифугирования в течение 2-х мин.

2.Сливают из пробирок жидкость над осадком и вместо нее заливают

впервую пробирку дистиллированную воду до 10 мл, во вторую и все последующие - по 5 мл раствора глюкозы (0,04 %) и по 1 мл раствора ТТХ (0, 5 %). После этого во второй и третьей пробирке доводят объем жидкости до 10 мл дистиллированной водой. В четвертую и (по вариантам) добавляют исследуемые растворы с заданной концентрацией загрязнителей, также доводя объем жидкости до 10 мл.

164