20. Генетический подход оценки качества окружающей среды. Предложить бальную оценку состояния тест-объектов по уровню генетических нарушений. Указать известные методы, предлагаемые данным подходом.

Наличие и степень проявления генетических изменений характеризует мутагенную активность среды, а возможность сохранения генетических изменений в популяциях отражает эффективность функционирования иммунной системы организмов.

В норме большинство генетических нарушений распознаются и элиминируются клеткой, например путем апоптоза за счет внутриклеточных систем или посредством иммунной системы. Достоверное превышение спонтанного уровня таких нарушений является индикатором стресса. Генетические изменения могут выявляться на генном, хромосомном и геномном уровнях. Принято выделять следующие типы мутаций.

 Генные, или точковые, - их делят на две группы:

• замены оснований в ДНК и вставки или выпадения нуклеотидов, приводящие к сдвигу рамки считывания генетического кода.

• на прямые и обратные (реверсии). Мутации типа сдвига рамки считывания значительно менее склонны к спонтанным реверсиям, чем мутации типа замен оснований. 

Хромосомные перестройки (аберрации) заключаются в различных нарушениях структуры хромосом. 

Геномные мутации - изменение количества хромосом в ядре.

Методы:

1. Метод учета соматических мутаций. Принцип метода оценки мутагенного воздействия факторов основан на учете соматических мутаций в клетках волосков тычинок традесканции.

Этапы работы.

1) После 7-дневного проращивания срезать цветки в чашку Петри и поместить их на 15 мин в холодильник.

2) Тычинки аккуратно отделить и поместить в смесь глицерина и воды на предметное стекло .(Изменение голубой окраски клеток волосков тычиночных нитей на розовую рассматривают как фенотипическое проявление мутации в гетерозиготных по окраске клетках)

2. Тест Эймса.

Для создания тест-системы Эймсом и его сотрудниками были сконструированы специальные штаммы бактерий Salmonella typhimurium, у которых были выделены ауксотрофные по гистидину (незаменимая аминокислота) мутанты his G-46 (мутация замены оснований в his G-гене) и his D-3052 (мутации типа сдвига рамки считывания в гене D).

На основе штаммов сальмонеллы были созданы полуколичественные и количественные тесты для оценки мутагенной активности.

Суть метода Эймса заключается в регистрации способности испытуемого соединения и (или) его метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активности in vitro. Метаболитом выступает печень крысы

3. Анафазный метод

Заключается в подсчитывании нормальных и аномальных анафаз и телофаз в делящихся клетках.

• Вычисляют процент клеток с аберрациями от общего числа клеток, находящихся в этих же фазах деления.

• Метод удобен для анализа растений с большим числом хромосом и/или с плохо изученной морфологией.

4. Метафазный метод.

Учет аберраций хромосом в клетках апикальной меристемы растений

1. Изучение на стадии метафазы.

2.Хромосомы каждого кариотипа обладают постоянством числа, формы и внутренней структуры.

Принцип метода основан на учете образованных хромосомных аберраций в клетках апикальной меристемы растений после обработки семян мутагенами.

5. Микроядерный тест - заключается в количественной регистрации микроядер в клетках, находящихся на стадии телофазы митоза. Как сравнительно простой метод выявления химических веществ, способных индуцировать хромосомные повреждения.

Принцип метода заключается в образовании микроядер вследствие нарушения распределения генетического материала между дочерними клетками (5%) или формирующихся из обломков хромосом (до 95%) при митотическом делении.

• лимфоциты периферической крови сохраняют полученные повреждения в течение длительного времени.

• Микроядра обнаруживаются в лимфоцитах сразу после первого митоза.

• Для построения дозовой зависимости кровь облучают in vitro (или вносят в культуру мутаген) и спустя 72 ч от начала ФГА-стимуляции анализируют.

• Подсчитывают обычно 500 бинуклеарных клеток, используя метод цитокинетического блока (цитохолазина-Б блокирует разделение цитоплазмы).

• Возможность применения теста для биодозиметрии ограничена 2 – 4 годами после облучения.

• Для проявления биологического эффекта в лимфоцитах крови необходимо, вероятно, несколько месяцев, т.ч. существует органические и «снизу».

Тест-объекты:

• Растения (лук 16 n , конские бобы 12 n, кукуруза 20 n,, традесканция 12 n , ячмень 14 n , соя 12 n);

Преимущества

1.Хорошо изучен генетический аппарат растительных клеток.

2.Возможность получения репрезентативных генетически однородных выборок.

3.Низкая частота спонтанных мутаций.

4.Простота учета генетических эффектов.

5.Короткие сроки вегетации.

6.Простота проведения экспериментов.

7.Возможность получения нужных объемов выборок.

8.Высокая чувствительность.

9.Высокая воспроизводимость результатов

Недостатки

1.Отсутствие информации о механизмах влияния на метаболизм растений ксенобиотиков.

2.Прочная целлюлозная оболочка препятствует проникновению в клетку отдельных химических веществ.

3.Клетки высших растений содержат больше цитоплазматической ДНК, чем клетки животных

• Животные

• Бактерии

Преимущества бактерий как тест-объектов:

1.Легкость культивирования в лабораторных условиях,

2.Короткий жизненный цикл,

3.Возможность работать с большими популяциями клеток (статистика).

4.Разработан широкий арсенал методов, позволяющих изучать летальные и генетические эффекты, а также механизмы биологического действия повреждающих агентов.

Недостатки:

1.Не существует надежной количественной связи между способностью повреждающего агента индуцировать мутации у бактерий с развитием повреждений ДНК у животных и человека.

2.Не способны выявлять химические вещества, вызывающие рак не в результате повреждения ДНК, а посредствам других механизмов, которые еще плохо изучены.