Эффективность биохимических тестов при исследовании состояния организма и среды обитания. Рассказать суть любого метода, применяемого в данном подходе.
Принцип метода определения активности ферментов основан на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, рН среды и концентрации субстратов.
Для количественного определения применяются химические, фотометрические, колориметрические, поляриметрические и другие методы.
Для качественных измерений широко используются хроматографические методы.
Требования к методам оценки ферментативной активности почв
Необходимо соблюдать оптимальные значения таких констант, как
температура инкубации,
концентрация водородных ионов,
состав применяемых буферных растворов,
концентрация субстрата,
величина навески почвы,
наличие различных активаторов и ингибиторов, которые для разных групп и даже отдельных ферментов различны
Для корректировки результатов ставят следующие контрольные опыты
Почва, стерилизованная сухим жаром при 180о 3 часа.
Нестерильная почва без субстрата (увлажненная водой до 60%-ной влагоемкости).
Субстрат без почвы со всеми реактивами.
Ферментативную активность выражают в
физических изменениях субстрата (изменение вязкости, поляризации, оптической плотности),
количествах продуктов реакции,
количествах превращенной или остаточной части субстрата,
ферментных или энергетических единицах.
В соответствии с рекомендацией Международного биохимического союза по ферментам, за единицу измерения принята стандартная ферментная единица (Е).
1Е соответствует такому количеству фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин.
При определении почвенных ферментов это количество рассчитывают на единицу веса почвы (например, на 1 г почвы).
Методы биотестирования с использованием позвоночных животных. Перечислить основные типы, классы, виды животных, применяемых в качестве тест-объектов. Привести пример метода биотестирования с помощью позвоночных в рамках любого подхода.
Костистые рыбы, форель, карп, гуппи, дарио рерио, сазан, серебрянный и золотой карась, вьюн, амфибии, травяная и шпорцевая лягушки, обыкновенная бурозубка, европейский крот, алтайский крот, бурый медведь, лось, рыжая полевка, красная полевка
Биохим подход:
Исследование нарушений развития эмбрионов водных животных с применением метаболического крите
Генетич подход:
Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека
Частота бинуклеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов человека после •у-облучени
Морфологический:
Нарушение эмбрионального морфогенеза амфибий в условиях техногенного загрязнения сред
Физиологический:
Биотестирование с использованием рыб
Сперматозоиды костистых рыб как тест-объект в эколого-эмбриологических исследованиях
НАРУШЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОГО МОРФОГЕНЕЗА АМФИБИЙ
В раннем эмбриогенезе имеются особо чувствительные к повреждающим воздействиям фазы («критические периоды»), которые связанны с межклеточными взаимодействиями при морфогенезе.
Метод оценки токсичности среды по нарушению ЭМБРИОНАЛЬНОГО МОРФОГЕНЕЗА АМФИБИЙ
основан на определении физиологического состояния зародышей амфибий по морфологическим аномалиям и смертности.
Применение эмбриональных моделей позволяет сделать предположения о механизмах повреждения, используя в качестве биотестов эмбрионы на разных стадиях развития
В качестве тест объекта используются эмбрионы лягушки на стадии закладки нервной системы (нейруляции).
Эта фаза развития характеризуется резким повышением уровня окислительного метаболизма и инициацией экспрессии генов, связанных с начальными процессами дифференцировки.
Методы изучения фитопланктона и его активности (отбор проб, консервация и хранение, концентрирование фитопланктона). Количественный учет фитопланктона. Определение биомассы фитопланктона по содержанию хлорофилла.
Растительные сообщества являются одним из основных компонентов любого экотопа. В водоемах растения представлены планктоном, в состав которого входят водоросли (харовые, зеленые, протококковые, диатомовые) и высшие растения (гигро- и гидрофиты).
Планктонные и высшие водные растения являются надежными индикаторами качества среды их обитания, т.к. напрямую связаны с водной средой, обитают в экотопах длительное время, имеют высокую численность, удобны для отбора проб, а в условиях хронических антропогенных нагрузок могут реагировать даже на относительно слабые воздействия вследствие куммулятивного эффекта.
При отборе проб надо учитывать, что влияние промышленных и бытовых стоков на фитопланктон сказывается только через 2−3 сут. Поэтому при большой протяженности водных объектов и высокой скорости течения (например, 0,5 м/с) первый пункт отбора проб следует расположить через 43 км, второй − через 86 км, а третий – через 130 км, что соответствует расстоянию, пройденному водной массой за 1, 2, 3 сут соответственно.
В реках вертикальное распределение фитопланктона относительно равномерное, поэтому отбор проб обычно производят с горизонта 0,2−1 м зачерпыванием определенного объема воды (в зависимости от степени развития фитопланктона 0,2; 0,5 или 1 л).
Существуют разные методы сбора и орудия лова фитопланктона. В ряде случаев наиболее эффективным по-прежнему остается метод сетяного лова, который предназначен для отбора качественных проб фитопланктона всех категорий, кроме нанопланктона. При таком способе отбор пробы происходит в результате процеживания большо го объема воды. Для выявления видового состава фитопланктона лучше использовать планктонную сеть Джеди, изготовленную из очень мелкого мельничного сита шелковой или капроновой нити. Материал, отобранный сетью, может быть просмотрен в живом состоянии в полевых условиях с помощью микроскопа или бинокулярной лупы.
Для отбора проб фитопланктона применяют батометры. Для исследования планктона из неглубоких медленно текущих или стоячих водоемов можно использовать самодельные батометры.
Бутыль-батометр следует погрузить в воду на необходимую глубину с закрытой крышкой, под водой открутить крышку, произвести забор необходимого количества воды (как правило, полную бутыль «под горлышко»), закрыть крышку и извлечь бутыль из воды.
Однако некоторые из них имеют недостатки и не рекомендуются к использованию в ряде случаев. Например, батометр Руттнера погружаясь в водоем, своим нижним диском разбивает поверхностную пленку и перемешивает организмы водной толщи, что не позволяет проводить послойный анализ фитопланктона. Лучший результат дают батометры, у которых при погружении обе створки находятся в вертикальном положении и не мешают вырезанию определенного столба воды. Наиболее прост в использовании батометр А.В. Францевича. Его способность вырезать метровый слой жидкости особенно ценна при исследовании вертикального распределения водорослей.
При комплексных работах, когда необходимо получить одновременно воду для биологического и химического анализов, следует применять батометры большего рабочего объема. К таким приборам относится планктобатометр ДК (Дьяченко-Кожевниковой), емкость которого у большой модели равна 10, а у малой − 5 л. Еще более удобен батометр Молчанова ГР-18. Он предназначен для взятия проб воды с разных глубин водоема и одновременного измерения температуры воды
исследуемого слоя (от 1 до 40 С). Батометр ГР-18 имеет два цилиндра из органического стекла, емкость которых не менее 4 л.
Для анализа фитопланктона в случае его небольшого количества необходимо прибегать к методам сгущения и консервации. Наиболее распространенными методами концентрирования планктона являются седиментация (осаждение отстаиванием) или фильтрация пробы воды через мелкопористые мембранные фильтры. Седиментационный метод заключается в отстаивании законсервированной исследуемой пробы воды в темном прохладном месте не менее 10 сут. Объем пробы обычно составляет от 0,5 до 1 л.
Для фиксации проб применяется формалин, однако он разрушает нежные флагеллаты и не ликвидирует газовые вакуоли у сине-зеленых, что мешает их осаждению. Поэтому в качестве фиксаторов можно использовать йодистый калий или раствор, приведенный в таблице
Оба раствора сливают и хранят в темном месте. При применении йодных фиксаторов в клетках водорослей хорошо обнаруживаются пиреноиды, жгутики, окрашивается слизь, исчезают вакуоли у большинства имеющих их сине-зеленых. Наличие формалина в составе консерванта позволяет хранить пробу длительное время.
Фиксированную пробу после отстаивания концентрируют отсасыванием воды с помощью трубки-сифона с загнутым на 2 см вверх концом, затянутым газом No 70 − 76, или с помощью устройства для автоматического концентрирования фитопланктонных проб. Устройство состоит из двух расположенных на разных уровнях штативов (на верхний штатив устанавливается сосуд с концентрируемой водой, на нижний − мерный цилиндр, в который отсасывается вода), сифона, трубок и двух вентилей (обычного и соленоидного). Это устройство позволяет создать стандартные условия концентрирования, а также отрегулировать скорость отсасывания воды таким образом, чтобы исключить возможность попадания в фильтрат мелких видов фитопланктона. После отсасывания остаток пробы в 30−80 мл переливают в склянку. Туда же сливают воду после ополаскивания стенок сосуда, в котором происходило осаждение.
Широкое применение в гидробиологии получил метод мембранной фильтрации, который способствует быстрой концентрации проб и дает возможность просматривать фитопланктон в живом состоянии. Пробу фильтруют до определенного объема, оставляя над фильтром столбик воды высотой 1 см, или до момента, когда воды над осадком уже нет, но фильтр еще остается влажным. Затем планктон осторожно смывают с фильтра мягкой кисточкой и просчитывают в счетной камере. Желательно сразу после фильтрации просмотреть живой материал, что позволяет не только обнаружить нежные формы водорослей, но и определить общее состояние фитопланктона. Если нет необходимости просматривать живую пробу, фильтр помещают в пенициллиновую склянку объемом 20 мл, заливают 5−10 мл фильтрата и консервируют до слабо-желтого цвета. В этом случае за 30 мин до фильтрации можно провести предварительную консервацию пробы несколькими каплями фиксатора, что предотвратит деформацию водорослей на фильтре, которая может иметь место при фильтрации живой пробы.
Опыт работы специалистов показывает, что довольно близкие результаты с отстойным концентрированием получаются только в случае двойной фильтрации пробы. Причина состоит в том, что при обильных пробах только двойная фильтрация обеспечивает равномерное распределение отфильтрованных водорослей по площади фильтра. При одноразовой фильтрации происходит сбивание организмов фитопланктона в кучи или даже склеивание их на фильтре.
Изучать организмы в живом состоянии можно и в случае применении метода центрифугирования, который позволяет быстро осадить водоросли. Однако применять его при количественном учете фитопланктона не следует, так как центрифуга не осаждает сине-зеленые водоросли, содержащие газовые вакуоли, и организмы с меньшей плотностью, чем вода.
Важным моментом отбора проб является ее этикетирование. Каждая проба должна быть снабжена этикеткой, на которой указывают название водного объекта, номер станции, глубину, орудие лова, дату сбора. Этикетка пишется на пергаментной бумаге и вкладывается под прокладку крышки. Для этикеток удобно использовать лейкопластырь, кусочки которого наклеивают на банку или крышку, а затем подписывают мягким карандашом или ручкой. Иногда на этикетке ставится просто номер, который соответствует номеру, записанному вжурнале или полевом дневнике. В дневник вносятся дополнительные сведения о погоде, температуре, цветности, прозрачности воды, глубине станции, визуальные наблюдения за качеством воды и т.д.
Методы подсчета водорослей планктона. Для количественной обработки фитопланктона удобны счетные камеры «Учинская» или «Нажотта» объемом 0,01; 0,02 и 0,05 см3. Возможно использование камеры Горяева.
Счетные камеры предназначены для определения количества частиц в единице объема жидкости. Частицы (например, лейкоциты, эритроциты, тромбоциты, бактерии, споры грибов, пыльца, водоросли) подсчитываются визуально под микроскопом. Основная пластина имеет размер предметного стекла для микроскопа и выполнена из специального оптического стекла. Пропиленные бороздки разделяют поверхность на два больших внешних поля и три узких внутренних полосы. Два внешних поля предназначены для нанесения записей, в то время как полосы отшлифованы и отполированы. Центральная полоса (дно камеры) имеет два ряда гравированной сетки для подсчета, отделенные пропилами. Дно камеры в центральной полосе на 0,1 мм ниже двух внешних полос. Таким образом, когда пластина закрывается покровным стеклом, между ним и центральной полосой образуется зазор в 0,1 мм.
Уравнение для определения количества частиц (клеток) универсальное. Количество частиц (клеток) в 1 мкл объема равно количеству подсчитанных частиц (клеток), деленному на площадь проанализированных квадратов (мм2), глубину камеры (мм) и разведение.
Процесс подсчета очень трудоемок и требует большой тщательности. Существенным моментом является наполнение камеры, перед которым проба тщательно перемешивается продуванием воздуха через капилляр с входным отверстием не менее 2 мм. Этим же капилляром вносится одна-две капли фильтрата, и камеру быстро закрывают покровным стеклом. Пробе дают осесть в течение нескольких минут. Размеры клеток водорослей могут быть важным систематическим признаком. Клетки измеряют с помощью окуляра-микрометра.
Методы вычисления биомассы. В основе вычисления биомассы фитопланктона лежит определение объема клеток разных видов водорослей. Форма клеток приравнивается к близкому геометрическому телу и по формулам, известным из стереометрии, вычисляют их объем. Плотность (удельный вес) водорослей при расчете биомассы условно принимают равной единице, поэтому общая биомасса фитопланктона численно равна его общему объему. В литературе
имеются таблицы объемов и весов (масс) разных видов планктона. Эти данные можно использовать как ориентировочные.
Большинство массовых видов водорослей имеет форму шара, цилиндра, эллипсоида или двух конусов. Ниже приведен ряд формул для вычисления объема геометрических тел, которым обычно подобны клетки планктонных водорослей.
В приведенных формулах приняты следующие обозначения: r −радиус; h − высота; a, b, с − полуоси эллипсоида; a', b', c' – стороны клина и параллелепипеда.
всякое приравнивание к геометрическим фигурам условно, отчего возможны ошибки в определении объема клеток и, в конечном счете, биомассы. Поэтому выбранная фигура должна как можно лучше соответствовать форме исследуемой клетки.