Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

энергетического баланса клетки, от уровня в ней обмена веществ, в часmости

от уровня реакций окислительного фосфорилирования, при посредстве кото­ рых высвобождающаяся в процессе окисления органических веществ энергия

запасается в макроэргических связях АТФ.

Двусторонний контроль деятельности первого в цепи реакций биосинтеза

фермента представляет очень четкий механизм регуляции обмена веществ и используется во многих системах биосинтеза в организме. Именно на

примере биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов он исследован наиболее

детально.

В заключение отметим, что одно из производных ПИРИМИДИновых нукле­

отидов, а именно 3'-азидо-2', 3'-дидезокситимидин, подавляет развитие ретро­

вирусов, в том числе вызывающих синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД):

Предложены и другие производные нуклеотидов для борьбы с этим гроз­

ным заболеванием.

Перейдем теперь к рассмотрению механизма биосинтеза пуриновых основа­ ний. Формирование пуринового кольца сразу идет на рибозо-5-фосфате. Поэ­ тому первой реакцией является взаимодействие глутамина с 5-фосфорибозил­ l-пирофосфатом при каталитическом воздействии гликозилтрансферазы, уско­ ряющей перенос остатка 5-фосфорибозы на амидогруппу глутамина. Видимо,

одновременно протекает гидролиз возникающего 5-фосфорибозишлутамина, вследствие чего вьщеляется 5-фосфорибозиламин:

он

I

но-Р-

~

Глутамии

н

5-Фос:ФориБОЗИЛ-l-пирофос:фат lАIIIIIДОФОС:ФО­

рнС!ознnтрзвс­

феР8З8

ун

HO-fl-О2-СоfНNH2			HO~-CH2-CH2-<::H-COOH + но-р-о-р-он
	Н		~	Cj>H	ун
О	Н Н	+	. 1	11	11
	Н	Н	NH2	о	о
	он	н	r лутаминовая кислота	Пирофосфат

5-Фосфорибоэиламии

240

Вприсутствии АТФ при участии специфической лигазы (аминосинтетаза)

к5-фосфорибозиламину присоединяется глицин, причем возникает пептидная

связь:

ФосфориБОЗRJI­

~

rnицннаМIIД­ сивтетаза

s-Фосфорибозиnамии ГЛИЦИИ

+ АДФ + НзРО..

ОН

Б-ФосфорибозиnгnицииамиJJ.

Молекула 5-фосфорибозилглицинамида удлиняется на один углеродный

атом при посредстве фосфорибозилглицинамид-формилтрансферазы. Ее ко­ ферментом служит тетрагидрофолиевая кислота, присоединяющая форми­

льную группировку по атому азота, занимающему 5-е положение в молекуле кофермента.

С N-формилтетрагидрофолиевой кислоты осуществляется перенос форми­ льного остатка на Н2N-группу 5-фосфорибозилглицинамида. Получившийся в результате этой реакции 5-фосфорибозилформилглицивамид взаимодействует с глутамином в присутствии сопряжещю распадающейся АТФ и соответству­ ющей лигазы (см. два первых уравнения на схеме 3 (с. 242».

Продуктом реакции является производное, где карбонильный кисло­ род пептидной связи замещен на иминогруппу. Затем в результате ряда

преобразований возникшего при этом соединения замыкается имидазоль­

вый цикл. Данный процесс также идет сопряженно с распадом АТФ и

ускоряется специфическим ферментом, который, будучи выделен и очи­

щен, характеризуется относительно невысокой устойчивостью к денату­

рации.

Весьма существенно, что реакция, в результате которой образуется имида­ зольная часть будущего пуринового остатка, практически необратима в от­ личие от подавляющего большинства остальных стадий рассматриваемого

процесса.

Вслед за этим на имидазольном цикле путем ряда ферментаmвных реак­

ций отмеченного выше mпа из аспарагиновой кислоты, СО2 И формиата

строится пиримидиновое кольцо, т. е. в конце концов создается пуриновый

нуклеотид. Схема, включающая главные этапы этого синтеза, такова:

•

241

Н		~NH2	Н	"	CH~NH
	О1, ФОС:ФОРИбози.r.НILНН-?			,-	1	t~
?				~"		.......H
O=f-O-C~H2NH 8I11НД-ФОРIIIН.ТР8ВС:- O=f-crc~Н2NH
ОН	Н Н	ФеР8Э8.. ОН		Н	Н
Н		Н {-c~)..-#"		н	н
	НО	Н		НО	ОН

5-Фосфорибоэиn-

~OOH

СООН

- ,

~O

Н-

JJ

~H2

2"

I

.... -

(H~~,

{H-NH-C,

АТФ+Н~-{~

.... ",

~-~

СООН

~-~

COO~

он

H N-C /СН

он

H2N-C СН

I

2

"

Т

~/

o-~~~ -.-....----О=Р-О-СfRJ2N

АДФ+НЗР04

~H

Н

~~OHOH

6н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

ОН

О

~OOH

11

АО

("_

NH-C

/~

~_~,

HN

C--N

I~IC-N

?Н

H~

11

~H

ОН

I

I d

Ilи

~N~""'N/

IH2Nt-с.... ,С

-,,_.~ 0=~-0- ~

~-'"

O==P-O-ОC~2

CH2

I

N

6н

н

Н

Н2О

ОН

Н

Н

Н

Н

Н

Н

НО

ОН

НО

он

Инозин-5'-фосфат

(ИМФ)

Схема з. Механизм биосинтеза пуриновых нуклеотидов

Если ПОДЫТОЖИТЬ, из каких соединений строится пуриновый цикл, то

окажется, что он возникает из очень простых веществ:

242	•

		г----	,
		I И3 оксида I
		I уrлерода I
г	--------,		(IV) , --------- ,
I Из IспараrииовоА		'"с"		Из rлицнна	I
I ..	кислот	N.........	У'<c-N		I
L------	г---		!~JxQ	---Т---	J

"N .., N.... I

1"		'1	I
:	[уз~~~~~~J		:
L___		~з-ф~рМ~~---.J

Из приведенной схемы ясно, что l-й атом азота пуринового цикла ведет свое происхождение от аспарагиновой кислоты, З-й и 9-й-от глутамина,

а 7-й-от гnицина. Что касается происхождения атомов углерода пуринового кольца, то видно, что источниками их явились формиат (2-й и 8-й атомы

углерода), глицин (4,:,Й и 5-й) и СО2 (6-й атом). Химические уравнения,

приведенные на схеме З. показывают детали вюпочения тех или иных атомов N и С из состава перечисленных соединений в пуриновую часть нуклеотида

в процессе его биосинтеза.

Пиримидиновое кольцо nиримидиновых нуклеотидов синтезируется в ор­

ганизме из аналогичных соединений: NH 3' СО2 И аспарагиновой кислоты.

Таким образом, исходные вещества для биосинтеза пурННОВLIх и пнрнмндиновых

осиований в организме ИСКJПOчнтельио доступны, всегда присутствуют в ием, так

как аммиак, формильная группа и оксид углерода (IV) образуются в процессе

деструкции разнообразных органических соединений или поступают в' ор­

ганизм извне, а глутаминовая и аспарагиновая кислоты и их амиды представ­

ляют первичные в большом объеме синтезируемые аминокислоты, что имеет большое значение для обеспечения беспрепятственного синтеза этих важней­

ших для организма соединений.

Как следует из схемы 3, пуриновые нуклеотиды в результате последова­

тельных реакций наращивания пуринового цикла на рибозо-5-фосфате воз­ никают в виде инозин-5'-фосфата. Последний способен окисляться в хсан­ тозин-5'-фосфат. В результате аминирования первого синтезируется аденозин- 5'-фосфат, а второго-гуанозин-5'-фосфат. И тот и другой процессы ускоря­ ются специфическими ферментами (см. уравнение реакции на с. 244). _

Всвою очередь, пуриновые нуклеозидмонофосфаты превращаются далее

внуклеОзидтрифосфаты. При этом гуанозин-5'-фосфат переходит в гуанозин-

	5'-трифосфат 'по двойной обменной реакции с АТФ:				'	.
	ГМФ+АТФ				ГДФ+АДФ
			НухлеОЭИД-МOIIофосфатпmaэа
	ГДФ+ АТФ				ПФ+ АДФ
			Ну.:лемиддифосфаПlПI83а

При взаимодействии аденозип-S'-фосфата с АТФ вознm:ает адепозипдифос­

форная кислота; эта реакция открыта А. В. Котельниковой в начале 60-х годов

нашего века:

	АдеШIЛ8n:ННаза
АМФ+АТФ		2АДФ

243

			?"
		N~C-N
"A~ ~o		1	11	11
	~" "O~/c....N/C"
'" •	О=Р-О-"2
НАДН+Н+	6н	"

ИМф-дегидрогенззз

Ииозни-5'- фосфат

Аспарагнновая

Фумаровая .Iкислота + ГТФ

+.#" АдеНlI1IОСУlCцинат-

+сmrrетаЗ2l;

ГДФ НаРО. АденИJlОСУКЦИНВ'l'-кислота

NH2 nиаза

NAC- N

J._ J1 Л

"~"

"

Ксантозин-5'- фосфат

		I	Глутамин +
r лутаминован			АТФ + "20
		1"		.,.
		1
кислота +		~ l.сантозин - ,,-qюс-
		фат:L-глутзмин
АМФ + ".Р207		аМtlДолигаS8 (обра-
		?Н	ЗУЮЩ3Я AMIiI)
	NAc-N
	I	11	11
?" "2N'~/C'N""C"
о=р-	Н	о
6н	2

АnеНОЗИR-5'- фосфат

ГуанОЗИН- 5'-фосфат

Она служит субстратом при окислителЬНОм фосфорилировании, в результате

которого запасы АТФ в организме непрерывно пополняются, что обеспечивает

достаточное ее количество для превращения всех остальных нуклеозпдмоно­

фосфатов в-нуклеозидтрифосфаты.

Синтез дезоксиаденозин-S'-трифосфата (дАТФ) и дезоксигуанозин-S'-три­

фосфата (дПФ) осуществляется посредством реакции восстановления рибозы

по гидроксильной группе при втором углеродном атоме. В случае дГТФ

реакция восстановления идет на уровне ГДФ с последующим превращением

~B~~:	-
		lIoccrавовлевие
ГДФ				дГДФ;
		ДезоксигуавилаП1Пlзза
дГДФ+АТФ				АДФ+дГТФ

Механизм реакции восстановления остатка рибозы в остаток дезоксирибо­

зы в случае пуриновых рибонуклеозиддифосфатов идентичен рассмотренному ранее для пиримидиновых нуклеотидов. Сам же процесс восстановления сти­

мулируется дГТФ и дТТФ, но ингибируется дАТФ.

Как и-в случае пиримидиновых нуклеотидов, конечные продукты биосин­

теза пуриновых нуклеотидов (ИМФ, АМФ, АДФ, АТФ, ГМФ, ГДФ и ГТФ) угнетают действие амидофосфорибозвлтрансферазы -фермеита, ускоряющего l-ю реакцию в цепи процессов, прнводящих к новообразованию пурннового

244

кольца. Таким образом, осуществляется саморегуляция образования пурино­

вых нуклеотидов. Кроме того, при помощи специфического перекрестного

участия АТФ и ГТФ в реакциях, ведущих к превращению ИМФ в гмФ и АМФ

соответственно, последние синтезируются в организме всегда в строго опреде- 1leHHoM соотношении:

ГТФ

1Активирование t

АМф-------

иМф

.. ГМФ

~Активированиеt

АТф----------------

~-

Схема эта весьма показательна: она дает представление о принципах саморегуляции, используемых в организме, когда обеспечивается синтез ряда

веществ в определенной пропорции по отношению друг К другу. Обеспечение строго определенного соотношения нуи;леозидтрифосфатов В организме имеет исключительное значение, так как из них образуются нуклеиновые кислоты.

Сходные регуляторные процессы отмечены также в синтезе пиримидиновых

нуклеотидов.

Существует еще один путь синтеза пуриновых и ПИl'имидиновых нукле­

отидов в организмах-из свободных пуриновых и пиримидиновых основа­ ний и 5-фосфорибозил-l-пирофосфата. Он не являеТСЯt Конечно, способом

синтеза данных нуклеотидов заново, так как при этом используются гото­

вые пуриновые и пиримидиновые циклы, освободившиеся при распаде нуклеиновых кислот; он лишь сберегает пуриновые и пиримидиновые ос­

нования от их распада до соответствующих конечных продуктов. Эта

реакция ускоряется специфическими ферментами - фосфорибозилтрансфе­

разами:

9	Н		?Н	?Н
о=р-о-сн			о-Р-о-р-он
I		2	11	11	+
он		Н	о	о

АдеНИН-фОСфорибознn­

трансфераза

S-Фосфорибозил-I- пирофосфат Аденин

?н ~H

+НО-Р-О-Р-ОН

11 11

о о

Пирофосфат

он он

Аденознн-S'- фосфат

Этот путь, в часmости, ярко представлен в злокачественных опухолях.

1t45

БИОСИНТЕЗ ДИК И РИК

Выше бьmо показано, что в живой природе осуществляются реакции, обеспечивающие беспрепятственный синтез дезоксирибо- и рибонуклеозид-5'­ трифосфатов всех видов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, а также АТФ, ГТФ,

ЦТФ и УТФ. Характерно, что новообразование этих соединений регулируется таким образом, что они возникают зависимо друг. от друга в строго опреде­

ленной пропорции. Следовательно, в организме всегда обеспечено существова­

ние всех их одновременно в необходимых концентрациях. ·Именно из нукле­ озидтрифосфатов и осуществляется биосинтез нуклеиновых кислот.

Первой характерной чертой специфического биосинтеза нуклеиновых кис­

лот является то, что он протекает только при наличии всех четырех видов

дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ) в случае синтеза·ДНК или же в присутствии всех четырех видов рибонуклеозидтрифос­

фатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ) в случае синтеза рнк. Вторая-состоит в том,

что биосинтез идет при каталитическом воздействии ферментов-ДНК- или РНК-полнмераз. Третья весьма своеобразная черта-необходимость для его

осуществления затравки в виде уже готового полинуклеотида, который играет

роль матрицы. Последнее имеет принципиальное значение, так как именно

благодаря этому обеспечивается специфический биосинтез нуклеиновых кислот

со строго заданной последовательностью нуклеотидных остатков в молекуле.

Общая схема биосинтеза дезоксирибонуклеиновых кислот может быть

представлена в следующем виде:

nдAТФ		..	дАМф
+
nдгrф	М[+; ДHK-1IIIJIIIМep83II		дГМф	+ 4n~P:zo,
+	(Днк-нyxneontJIII1I-		."""
nдцтф	трансфеpua);		дЦМф	Пнрофосфат
+			""
	Днк-матрица			n
nдтгф
			дТМф

Она была впервые предложена А. Корнбергом (1958) на основании опытов,

проведенных с ДНК-полимеразой, вьщеленной из кишечной палочки. В том же годуС. Шпигельмантоже из:кшпечнойпалочкиполучилРНК-пол:имеразу (см_ рис.

46). Позже она была изолирована из тканей млекопитающихидругих животных_

РНК-полимераза in vitro обеспечивает синтез РНК по· аналогичной схеме:

nAТФ		АМф
+		/
nгrФ		ГМф	+
+	(PHK-НУllJleaJ1l.QllllТPllНС­	. /
nЦТФ.		ЦМф
+	фера38); ДНК-эатpuu	. /
nУТф		УМФ	n

4n~P:z07

Пмроффт

Химизм реакции образования нуклеииовых кислот. Механизм происходящей при биосинтезе нуклеиновых кислот химической реакции заключается в пере­

носе остатка нуклеозндмоиофосфата от нуклеозидтрифосфата на концевой

нуклеотидный остат{)к растущей в процессе синтеза полинуклеотидной цепи.

Перенос идет на место атома Н гидроксильнои группы, стоящей при 3-м

углеродном атоме рибозы или дезоксирибозы концевого нуклеотида, и сопро-

246

вождается выделением пирофосфата; поэтому фермент, осуществляющий

ускорение реакции переноса нуклеотидного остатка, называют нуклеотидил­

трансферазой:

к lIOJDIR)'lUlecm!.IIIIOA цemr

/

но-р= О'

I 0C:Н0Ia_

0-~H20

					Н		Н
				Н			Н
					НО		он
ОН	он			/~
I	I			~/	/			H)'JUICO'IНIIIII
О=Р-О-Р,			/'	I		+		..
								трансфеРВ:JI
I	#	о		/
он	о	но'-р-о

I

()~VнО~ОсИОIВ-

kHk

ОН он

к пOllllll)'КJleOТ аеlDl

/

НО-Р=О

I

o-p:o~-

!H~

оОН

/	I	I
	ОН	он
----·~HO-P	+ 0= р-о- Р=- о
I~O	I	I
	он	он

O-~O~-

н н

н н

ОН ОН

На свободную гидро'Ксильную группу при 3-м углеродном атоме рибозы или дезоксирибозы вновь присоединеиного вуклеотидного остатка может поступить следующий нуклеотидный остаток, и, таким образом, будет осу­

Ществляться ступенчатый (градуальный) биосинтез ПОJlИВуклеотвда путем нара­

щивания его с одного конца. Энергия для синтеза поступает за счет распада

макроэргической связи в трифосфатной группировке при освобождении пиiю­

фосфата.

Механизм воспроизведения первичной cTpyктypы при биосинтезе нуклеи­ новых кислот. Процесс ступенчатого синтеза полинуклеотидной цепочки

247

А	.		Jj
	•
	~	~-::.~			~}
	[е	~".~		,
		~Jf	~

-®-® р

Расхо.дение биспнральиой молекулы ДИК на одноцепочечиые ПОЛИДе30lсирибонумеотиды

--®-@. р

~Jo

%

Де30l:сирибонуклеозидтрифосфаты

1--' ~

o Адении	[!] Гуанин	EJI и О		Аэorистые OCIIовaниR
Ш ТИМИН	1]] ЦИТ03ин	•	И("')	ДезоICСИРибоэа
() или () Остаткиде30КСИРибоэы			е R о	Фосфат
o Остато.: фосфориой кислоты			- --	Водородные свиэи

== Водородные си]и

1 Направлеиие наращиванИИ

,полиде30lCCирибонуклeDТИДНОЙ цепи

Рис. 83. Схема матричного биосинтеза нуклеиновых кислот (А) и удвоения молекул ДИК (Б) при их репликации (пояснение в тексте)

осуществляется на матрице, вдоль которой располагаются один за другим те или

иные дезоксирибоили рибонуклеозИДтрифосфаты, вступаюшие затем в реак­ цию конденсации с выделением IШрофосфата (рис. 83, А). ПQРЯДОК расположения

нуклеозидтрифосфатов вдоль полинуклеотидной матрицы задается чередовани­

ем нуклеотидных звеньев, ПРИСуШИм дик или иногда РИК, выполняющим матричную функцию. При этом к определенному пуриновому или пиримидино­

вому основанию полинуклеотида (матрица) присоединяется комплементарное

пуриновое или пиримидиновое основание соответствующего нуклеозидтрифос­ фата. В результате вновь синтезируемая полинуклеотидная цепь в целом будет комплементарна полинуклеотидной цепи матрицы (рис. 83, А).

Так как формирование нового полинуклеотида идет на полинуклеотидной

матрице при непрерывном замыкании водородных связей между комплемен­

тарными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями матрицы и нуклеозид­

трифосфатов, то условием функционирования этого механизма является одно­

цеnочеЧ1ЮЯ структура матрицы. Поэтому в случае биосинтеза молщсул ДИК, характеризующихся биспиральной структурой, существенным моментом

248

в биосинтезе следует признать расхождение биспирального полидезоксирибо­

нуклеотида на одиночные полинуклеотидные цепи, на которых, собственно,

и осуществляется сборка комплементарных им полинуклеотидов. В итоге из

одной биспиральной молекулы ДИК образуются две биспиральные молекулы

ДИК, совершенно идентичные друг другу и исходной молекуле ДИК

(рис. 83, Б). Как качественный состав, так и количественное содержание нукле­

отидных остатков в матричной и вновь синтезированной на ней нуклеиновой

кислоте совпадают (табл. 21).

Таблица 21

Молярные соотношения оснований в составе ДИК, синтезнрованной

в присутсmнн разllЫX матриц

	Происхождение ДНК	Характер образца	Аденив	Тимив	IYанив	Цитозии	А+Т	А+Г
							Г+Ц	Т+Ц
	Кишечная палочка	Затравка	1,00	0,97	0,98	1,05	0,97	0,98
		Продукт	1,04	1,00	0,97	0,98	1,02	1,01
	Зобная железа	Затравка	1,14	1,05	0,90	0,85	1,25	1,05
		Продукт	1,19	1,19	0,81	0,83	1,46	0,99
	Бактериофаг Т2	Затравка	1,31	1,32	0,67	0,70	1,92	0,98
		Продукт	1,33	1,29	0,69	0,70	1,90	1,01

Это дает основание рассматривать изложенный выше механизм биосинтеза

нуклеиновых КИСЛот как гомологическую репликацию, т. е. бесконечное повто­

рение процесса удвоения числа. молекул путем прямого, непосредственного

копирования их структуры.

. Описанный выше (см. рис. 83, Б) механизм удвоения молекул ДИК был

доказан в опытах, где исходную ДИК родительских клеток метили тритием

или 15N. В дочерних клетках после l-го деления метку обнаруживали во всех

молекулах ДИК, но в меньшем количестве, так как она содержалась здесь

лишь в одной из полидезоксирибонуклеотидных спиралей ДИК Такой способ

удвоения молекул ДИК назьmается полуконсервативНLIМ. После 2-го деления

половина молекул ДИК во вновь образованных «внучатых» клетках оказьmа­ ется немеченой, так как гомологическая репликация в процессе 2-го деления идет как на меченых, так и на немеченых одноцепочечных полидезоксирибону­

клеотидах, возникающих при расхождении биспиральных молекул ДИК, ме­

ченных только по одной из цепей.

Ферменты биосинтеза дик. В биосинтезе ДИК участвуют не только ДИК­

полимеразы, но и РИК-полимераза, эндонуклеаза, ДИК-лигаза и другие фер­

менты.

Впервые ДИК-полимераза была выделена из кишечной палочки А. Корн­ бергом и сотр. (1958). Поскольку в последующие годы из этой же бактерии были выделеныI еще две полимеразы, она получила название полимеразы 1.

В клетке кишечной палочки содержится около 400 молекул ДИК-полимера­

зы I-белка (М= 109000), содержащего один атом Zn и представленного

одной полипептидной цепью. ДИК-полимераза 1 хорошо связывается с одно­

цепочечной ДИК или с зонами разрыва фосфодиэфирных связей в биспираль­

ной ДИК Она обладает ясно выраженной ДИК-полимеразной активностью, т. е. способна ускорять реакцию переноса дезоксирибонуклеотидильных оста­ тков с дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов на растущий конец полидезок­ сирибонуклеотида-3'-гидроксилъную группу дезоксирибозы его концевого

нуклеозида.

249