Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

Рис. 79. Доказательство сущест­			ИМn/МUН
вования быстрометящейся РНК			800
	(мРНК):
сплошнаR черная ЛИННЯ-ПОГJlощение при
260 IIМ в пробах после разделе..и. 23S. 16S
и 4S	РНК ультрацентрифугированием
в rpaдиенте rulOТНОСТИ сахарозы: пуНl'ТИр~
ная	линия-включение	14С_урацила
в рнк. Ход пунктирной "ривой показыва­
ет, ЧТО максимальное включение предшес'l"­
веНllика осуществ..lяется в РНК с коэффици­
ентом	седиментацпи ОКОЛО	8S. которая

и представляет собой мРНК

~~--~~~~~O

Верх nро6uркu

Плоскостные биспирализованные и линейные участки молекул 5S и 16S i рРНК, в свою очередь, укладываются в более компактные структуры высшего

порядка, т. е. образуют пространственную, третичную структуру этих моле­

кул. Она детально охарактеризована у 5S рРНК (рис. 78, Б) и пока еще далека от окончательного выяснения у 16-18S ррнк. Тем не менее и у последних нет

уже сомнения в том, что осуществляется мощная компактизация постоянных

и вариабельных доменов.

Функциональная роль всех видов рРНК постепенно проясняется: 16-18S и 23-29S рРНК являются структурной основой для формирования рибонуклео­ протеинового тяжа, который, складываясь в пространстве, дает начало 3040S и 50-60S субчастицам рибосомы. Однако этим, конечно, не исчерпывается

роль высокополимерных рибосомальных РНК: они могут взаимодействовать с мРНК и аминоацил-тРНК; их участки, видимо, распознаются белковыми

факторами (см. гл. VII), принимающими участие в сборке полипептидной цепи

в рибосоме; не исключено непосредственное взаимодействие друг с другом или

контакт через посредство специфических белков 16-18S рРНК и 23-29S

рРНК, локализованных в разньiх субчастицах, в процессе образования 70-80S

рибосом при ассоциации субчастиц или в транслирующей рибосоме. Что

касается 5S и 5,8S рРНК, то их функции в должной мере пока еще не изучены.

Определенно установлено лишь, что 5S рРНК в рибосомах бактерий связана с тремя белками-L5, L18 и L-25 (о рибосомных белках см. ниже, гл. VII),

у археобактерий-с одним-двумя, у эукариот-только с одним (L8); эти

комплексы рассматривают как третью субчастицу рибосомы, в составе кото­

рой 5S рРНК выполняет роль посредника между пептидилтрансферазным центром и ЕF-G-связывающими доменами (об этом тоже см. гл. VH).

Структура и функции информационных РНК Существование информацион­ ных рибонуклеиновых кислот (иРНК), или РНК-посредников, в передаче

информации оТ ДНК в белоксинтезирующий аппарат клетки (мессенджер­

РНК, оТ англ. mеssеngег-посыльный, курьер, мРНК) было предсказано А. Н. Белозерским и А. С. Спириным В 1958 г., исходя из наличия корреляции между нуклеотидным составом ДНК и рнк.

Двумя годами позже образование мРНК у бактерий было доказано Ф. Гро

и сотр. В прямых опытах с включением импульсной метки в различные виды

РНК (рис. 79). Это позволило в новом свете истолковать более ранние экспери­ менты Е. Волкина иЛ. Астрахана (1956), наблюдавших появление быстроме­

тящейся фракции ДНК-подобной РНК у бактерий после заражения их фагом. Прямое выделение мРНК было осуществлено в 1962 Г.- Е. Баутц

и Б. Холл для этого применили остроумный метод сорбции мРНК, возника­

ющей при заражении кишечной палочки фагом Т4, на ДНК, выделенной из

этого фага и ковалентно связанной с фосфоцеллюлозоЙ. В дальнейшем метод

220

аффинной хроматографии стал ведущим при выделении и очистке мРНК,

особенно после того, как в составе большинства мРНК эукариот был об­ наружен полиадениловый фрагмент значительной протяженности, а в качестве

носителя в колонках применена сефароза, ковалентно связанная с полиуриди­

ловой кислотой цианбромидпым методом. Взаимодействие полиадениловых

последовательностей мРНК с полиуридиловыми фрагментами носителя в си­

лу комплементарности первых и вторых приводит К связыванию на такой

колонке только мРНК.

Благодаря применению разнообразных методов и приемов многие мРНК получены в высокоочищенном состоянии. К их числу принадлежат мРНК, обеспечивающие матричный биосинтез субъединиц гемоглобина, яичного аль­

бумина, легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, гистонов, кристаллинов

(белки хрусталика глаза), миозина, фиброина шелка, авидина, протаминов, (l-казеина и др. Суммарное содержание мРНК в клетках составляет 2-3% от

тотальной клеточной РНК.

Молекулярные массы мРНК варьируют в широких пределах: ОТ несколь­ ких сотен тысяч до нескольких МИЛЛИОНОВ дальтон. Так, молекулярная масса

моноцистронной глобиновой мРНК, служащей матрицей для биосинтеза субъ­

единиц гемоглобина, составляет 150000 (константа ее седиментации равна 9S).

Молекулярные массы многих моноцистронных, т. е. кодирующих биосинтез одного белка, мРНК близки к этой величине. Однако у полицистронных

мРНК, кодирующих биосинтез не одного, а нескольких функционально вза­

имосвязанных белков, молекулярные массы гораздо выше и достигают не­ скольких миллионов дальтон. Примером может служить полицистронная

мРНК гистидинового оперона, выделенная из салмонеллы. Ее молекулярная

масса равна 4·106. Впрочем, некоторые моноцистронные мРНК могут об­

ладатъ молекулярной массой такого же порядка, что характерно, например,

для мРНК фиброина шелка (М=5 ·106).

Нуклеотидный состав мРНК крайне разнообразен. для бактериальных

мРНК характерно ДНК-подобие нуклеотидного состава, тогда как у мРНК эукариот этого не наблюдается. В ряде случаев содержание нуклеотиДОВ

в мРНК крайне специфично. Так бывает, в часmости, при кодировании ими биосинтеза резко асимметричных по аминокислотному составу белков. ЯРICим

примером может служить фиброиновая мрнк. В ее составе содержится 40 мол. % гуанипа и 19 мол. % цитозина, что вполне соответствует наличmo в фиброине шелка 42% глицина. . -

Первичная структура ряда мРНК выяснена. Так, в составе глобиновой мРНК человека установлено чередование 576 н. о. (не считая полиаденилового фрагмента), овальбумина цыпленка-1859, mmопротеина внешней мембраны

кишечной палочки-332; известны первичные структуры глобиновых мРНК

кролика и африканской шпорцевой лягушки, ряда вителлогениновых (кодиру­

ют биосинтез запасного белка яиц) мРНК, нескольких десятков мРНК, коди­ рующих биосинтез белков хориона яиц насекомых, и т. п.

Строение мРНК специфично: в их составе есть ннформативны,' т. е. работаю­

щиекакматрицы в процессе биосинтеза белка, зоны и неннформативныe участки.

Из неинформативных участков изучены уже упоминавшиеся ранее полиадени­

ловые фрагменты, находящиеся на 3'-конце молекулы мРНК. Длина полиадени­

ловых фрагментов у разных МРНК колеблется от 50 до 400 н. о. Эти фрагменты

отсутствуют в молекулах гистоновых мРНК. Неподалеку от р:олиаденилового

фрагмента в молекулах мРНК располагаются небольшие повторяющиеся

последовательности длиной примерно по 30 н. О., тоже не несущие кодирующей

функции, но, возможно, являющиеся акцепторными участками при взаимодей­ ствии мРНК с рибосомой или отдельными белковыми факторами. Кроме того,

221

на 5'-КОlЩе мРНК присутствует нуклеотидная последовательность, азотистые

основания в которой метилированы, а один из нуклеозидных остатков-7- метилгуанозин, присоединен через трифосфатную группировку Эта часть молекулы мРНК также неинформативна и называется шапочка или кэп (от ашл. сар-кепка, шапка):

н s'	f-!~			S'	н
CHz		А	зСН2			_	х
кэп
							у
		НО		........0			СНз
		В цепь-О	)p~
				~O

Отмеченное своеобразие в строении РНК выражается в виде такой обо­ бщенной структуры:

S'I	IAyr			13'
кэп НеИНформативный		Информативны й	Неинформативный	Поли А
	фрагмент	(транслируемый)	фрагмент	(5(}---400
	(30-100 нуклеотид­	фрагмент	(100-1000 иуклеотидных	нуклео-
	ных остатков)		остатков)	тидных
				остатков)

Полагают, что полиадениловая часть молекулы мРНК участвует в про­ цессе созревания мРНК (см. ниже), предопределяет время жизни мРНК,

способствует переносу мРНК из ядра в цитоплазму и принимает участие

в трансляции (см. гл. VH) мрнк. Кэп нужен для защиты мРНК от эк­

зонуклеаз, для связывания белковых факторов при взаимодействии с рРНК в рибосоме, он играет сигнальную роль при присоединении мРНК к рибосоме

и участвует в трансляции.

Вопрос о вторичной структуре мРНК находится в стадии разработки. Как и у других видов РНК, полинуклеотидная цепь в молекуле мРНК спирализована сама иа себя. Данные о возможных спариваниях в молекуле мРНК комплемен­

тарных оснований (А-У и г-ц), заложенные в компьютер, послужили

основанием для разработки модели глобиновой мРНК кролика (рис. 80). Что касается третичной структуры мРНК, то о ней пока ничего не известно и можно лишь констатировать, что она упакована менее компактно, чем рРНК.

На заре изучения мРНК, когда исследовали преимущественно бактериаль­

ные мРНК, характерным для этого вида РНК считали быструю обменива-

222

Рис. 80. Компьютерная модель вторичной структуры \}-шобиновой мРНК кролика.

Информативный фрагмент (см. рис.) включает 441 н. о.; неивфОРМ8ТИВНШI :юиа со стороны JCэпа-56 Н. о. (от

юпа рр инициируюшего kодоиа, с "оторого начинает<:я

сборка ПOJшпепгидной цепи ~-rлобнна), со стороны по­ лиадеВИJ10ВОГО фр;tгмента. не считан его,-94 Н. о. (от

терминирующего кодонз, при посредстве которого за-

1Ieршаетси сборка полнпептидной цепи ~-ГJlоБина. до

начала полиадениловой части мРНК). Примерно 40%

комплементарных НyI<JIеотидов в соста1le Р'ГJlобиновой МРНК кролика, ка" н в других мРНК. спарено, что

показаuо точками; в этих 30JШХ мРНК Сllирадизоваlf3

сама на сеБя

Тc/lMaHJ1Pg. .щад \,

K0f10H

IШШW информаmаОный ФРl1снснm

- flеl1НФОРl1аml10ныiJ гррагненm

емость, т. е. короткое время жизни, исчисляемое секундами или минутами,

ДНК-подобие нуклеотидного состава, а также значения молекулярных масс, которым соответствуют константы седиментации в промежуточной зоне меж­

ду константами седиментации транспортных (4S) и малой рибосомальной (16S) рнк. Исследования мРНК эукариот решительно изменили эти критерии отнесения РНК к классу информационных. Дело в том, что мРНК эукариот оказались достаточно долгоживущими молекулами (от нескольких часов до

нескольких дней и даже недель), их нуклеотидный состав был далек от

соотношения нуклеотидных остатков в валовой ДНК, а коэффициентыI седи­

ментации варьировали от 9S дО 65S. Поэтому в настоящее время перечислен­

ные крит.ерии отпали ввиду их неадекватности свойствам всех мРНК и остался

единствеиный критерий, сводящийся к следующему: информационной следует

считать ту РНК, которая в последовательности нуклеотидных остатков в мо­ лекуле несет информацию, обесщ;чивающую синтез специфического белка непосредственно на ней самой. Таким образом, матричные свойства данной

РНК оказались единственным признаком, который имеет всеобщее значение.

ОБМЕН НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Изучение обмена нуклеиновых кислот представляется принципиально важ­

ным в системе подготовки учителей на химико-биологических и биолого­

химических факультетах пединститутов, так как круг вопросов, которые при

этом рассматриваются, далеко выходит за рамки биохимии нуклеиновых

кислот и позволяет дать современную трактовку проблемам наследствен­

ности, изменчивости, естественного и искусственного мутагенеза, систематики

и эволюции.

Изучение обмена нуклеиновых кислот имеет огромное значение и в другом аспекте. Оно исключительно важно ДЛЯ глубокого понимания процессов жиз­

недеятельности организмов. Исследование молекулярных механизмов биосин­ теза пуриновых и ПИРИМИДиновых оснований позволило открыть р'яд важней­ ших закономерностей в регуляции новообразования этих соединений и сфор­

мулировать некоторые общие принципы регуляции обмена веществ.

Раскрытие механизма специфического биосинтеза огромных молекул полинук­

JIеотидов, при осуществлении которого с изумительной точностью обеспечи­

вается порядок чередования мононуклеотидных звеньев, их составляющих,

привело к признанию ведущей роли в этом процессе взаимодействия ком­

плементарных пуриновых и пиримидиновых оснований. Это, в свою очередь,

223

дало возможность впеРВi?Iе понять интимный механизм обеспечения специфи­

ческого воспроизведения первичной структуры макромолекул при их биосин­

тезе. Данные о регуляции новообразования нуклеиновых кислот привели

к фундаментальным открытиям, позволяющим сделать первые шаги к объяс­ нению закономерностей не только воспроизведения специфических макромо­ лекул, но также и морфогенеза.

Пути рашада иyt\:леиновых кислот. Распад нуклеиновых кислот в организме идет достаточно энергично. Так, период полужизни молекул ДНК в тканях мыши составляет от 1 до 5 суток; период полужизни большинства мРНК

у эукариот-несколько суток, а у прокариот-всего несколько секунд. '

Нуклеиновые кислотыI (РНК и ДНК) распадаются в организме при по­ средстве особых ферментов-иуклеаз. Они ускоряют реакцию разрыва меж­ нуклеотидных фосфодиэфирных связей в молекулах нуклеиновых кислот

и принадлежат, следовательно, к более широкой категории ферментов­

фосфодиэстераз.

Нуклеазы, действующие на внутренние межнуклеотидные связи в молеку­

лах ДНК и РНК. называются эндоиуклеазами. При их участии осуществляется

деполимеризация нуклеиновых кислот в основном до олигонуклеотидов. Нук­

леазы, ускоряющие реакции последовательного отщепления нуклеотидов от

РНК, ДНК или их фрагментов, начиная с конца полинуклеотидной цепи,

называют экзоиуклеазамн. Они обеспечивают распад нуклеиновых кислот до свободных нуклеотидов.

В зависимости от специфичности действия среди нуклеаз различают рибо­ нуклеазы и дезоксирибоиуклеазы. Первые ускоряют реакции распада как внут­ ренних, так и внешних (концевых) межнуклеотидных связей в молекулах РНК. Вторые выполняют такую же функцию по отношению к ДИК. Вместе с тем существует большая группа неспецифических эндо- и экзонуклеаз, действую­ щих одновременно и на РНК, и на ДНК.

ПО характеру действия на фосфодиэфирные связи в молекулах нукле­

иновых кислот нуклеазы делят на две категории. Одни из них ускоряют

реакцию гидролиза сложноэфирной связи межнуклеозидного фосфата с 3'- углеродным атомом остатка рибозы или дезоксирибозы, а другие-с 5'- углеродным атомом. Поэтому в названиях указанных ферментов всегда под­ черкивается, гидролиз какой из связей ускоряет данная нуклеаза. Однако ведущим признаком является локализация фосфата в составе олигоили мононуклеотидов, возникающих в результате гидролиза нуклеиновой кисло­

ты. Поэтому нуклеазы, расщепляющие связь Р-5'С, называются 3'-иукле­

азами, а расщепляющие связь Р-3'С именуют 5'-иуклеазами:

в цепь....JV\r-О--"СН2				В цепь-'V\r-ОСН"		2			СН" 2ОН
		снование			~основание				~снование
4'Н		Н ['			__	н	н	+	н	н
Н	3' 2'	Н		".~,~........,		З"			3'	Н
		Н(он)	~.-\\~~-				Н(ОН)			(ОН)
				_-
~. /			.........		О-Р........			B - rv'
О=Р,Он...... ...					-1 'он			цещ.""''''' ~H
I	__				оН			О=Р...... _
b~				~-lil'~	()--Л/\г-В цепь				~H
S'				4~ч	I
!Н2					сн			основание	Н2 О
						Н	Н	+
					Н	3'		Н
	о·				~ОН Н(оЮ
В цепь~								В цепь

224

Важнейшими группами нуклеаз являются следующие.

_

Дезокснрибонуклеазы 1 (дезоксирибонук:леинат-5'-олигонуклеотидгидрола­

зы) ускоряют гидролиз фосфодиэфирных связей в ДНК между остатком

фосфата	и	3'-углеродным	атомом	остатка	дезоксирибозы:
ДНК+(n -1) Н2О-n олигодезоксирибонуклеотидов.
Представителями ДНКаз			1 являются	панкреатические ДНКазы

(М-31 000). Первичная структура панкреатической ДНКазы быка расшиф­

рована: она представлена одной полнпептндной цепью из 257 аминокислотных

остатков. Оптимум рН лежит между 6,8 и 8,0. Фермент активируется ионами

Мп2 + и Mg2 + и ингибируется анионами, связывающими указанные катионы,

а также олигонуклеотидами. Механизм действия панкреатических ДНКаз на

ДНК таков, что вначале осуществляются в основном разрывы фосфодиэфир­

ных связей в одной из цепей ДНК. Парные разрывы очень редки, поэтому деполимеризация идет не сразу. Конечный продукт переваривания ДНК пан­

креатической ДНКазой содержит следы дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатов,

немного динуклеотидов и большое количество олигодезоксирибонуклеотид-5'­

фосфатов, составленных в среднем из 4 мономерных звеньев. Панкреатическая

ДНКаза быка существует в виде четырех множественных форм. Дезокснрибонуклеазы П (дезоксирибонуклеинат-3'-олигонуклеотидгидро­

лазы) в качестве конечного продукта действия образуют олигодезоксирибону­

клеотид-3'-фосфаты со средней длиной молекул в 6 звеньев инебольшие

количества дезоксирибонуклеозид-3'-фосфатов. Молекулярная масса ДНКазы

П селезенки 38000, оптимум рН 4,5-5,5. Ее молекула состоит из 343 амино­

кислотных остатков и содержит углеводную компоненту, структурной едини­

цей которой является глюкозамин. Фермент активируется ионами Mg2 + , ингибируется ионами SOi-, РО:-, AsO:-, АУ-кополимером, трнк. Деполи­

меризация ДНК осyiцествляется путем парных разрывов фосфодиэфирных

связей в молекуле ДНК, в результате чего быстро накапливаются ее большие фрагменты; особенно хорошо' атакуются связи, составленные из парных соче­

таний ГГ и АЦ. Предполагают, что ДНКазы П являются днмерамн.

Кроме ДНКазы 1 и П существует большая группа эндонуклеаз, атакующих

как дву-, так и одноцепочечную ДНК_ Так, например, у кишечной палочки их

7, среди них-4 низкомолекулярные (12-33 тыс. Да) и 3 высокомолекуляр-

ные (68-114 тыс. Да).	.
ЭКЗQдезокснрнбонуклеазы ускоряют реакцию	mдролиза молекул ДНК

с образованием дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатов. Из кишечной палочки вы­

делено и очищено в разной степени 8 экзодезоксирибонуклеаз (I-VIII), от­

личающихся друг от друга по определенным показателям. В частности, эк­

зодезоксирибонуклеаза ПI (М= 30 000) обладает способностью отщеплять 3'-

фосфат, если он есть, от концевого нуклеотида фрагментов молекулы ДНК. Рестриктазы-ДНКазы бактериального происхождения, расщепляющие

чужеродные (фаговую) ДНК в строго определенных зонах, которые «узнают­

ся» ферментом. Эти зоны имеют палиндромную структуру. Ниже приведены

два примера, где стрелками указаны точки гидролиза фосфодиэфирных связей:

t

5'- ГААТТЦ- 3'	рестриктаза кишечной палочки 1 (EcoRI);
3'-ЦТТААГ- 5'	М=116000, тетрамер (29000 х 4)
t
t
5'-НЦЦАГrn - 3'	рестриктаза кишечной палочки 11 (EcoRI/);
3'-НГГТЦЦН-5'	М=80000, димер (40{)ООх2)
t
8-3502	225

в зависимости от взаимного расположения места узнавания и точки рас­

щепления ДНК рестриктазами, их относят к 1 типу (сайт узнавания далеко,

на раССТОЯIJИИ сотен н. о. от точки расщепления), 11 типу (расщепление внутри

сайта узнавания) или 111 типу (расщепление вблизи сайта узнавания). К 1993 го­ ду выделено и охарактеризовано 2393 рестриктазы 1 типа, 188 рестриктаз

11 типа и только 4 рестриктазы 111 т~па. Всего следовательно изучено 2585 ре­

стриктаз.

Так жак рестриктазы расщепляют ДНК на ограниченное число фрагментов,

они нашли применение для определения первичной структуры ДНк. Однако

еще более важная область их практического использования-генетическая

инженерия, так как именно благодаря действию рестриктаз из ДИК выщепля­

ются фрагменты, которые далее встраиваются в бактериальную ДИК, стано­

вятся интегральной частью бактериального генома и приносят бактерии но­

вые, не свойственные ей ранее биохимические признаки, такие, например, как способность синтезировать интерферон, инсулин и другие белки, находящие

широкое применение в медицине (рис. 81). В принципе, такие процессы воз­ можны и в геноме BЫC~X организмов. Легкое встраивание рестрикционных

фрагментов ДНК в реципиентную ДНК (т. е. ДИК, включающую эти фрагме­ нть! в свой состав) объясняется тем, что при действии рестриктаз в точке

разрыва молекулы ДИК получаются «JIнпкие», комплемеmарные концы. Ввиду

огромной теоретической ценности и большого практического значения этих работ в нашей стране начиная с 1975 г. осуществляются комплексные ис­

следования по проекту «Рестриктаза», который планируют на последующих этапах работы превратить в более широкий проект «Нуклеазю) и привлечь

к его разработке различные научно-исследовательские институты. В 1980 г. большая группа советских ученых была удостоена Государственной премии за разработку регламентов получения 30 рестриктаз и внедрение их в практику работ по генетической инженерии.

Рибонуклеазы 1 (рибонуклеинат-3'-пиримидино-олигонуклеотидгидрола­

зы)-эндонуклеазы, ускоряющие реакцию гидролиза РИК по пиримидино­

вым нуклеотидным остаткам. Ранее их относили к рибонуклеат-нуклеотидо-2'­ трансферазам циклизующим, но, поскольку 2', 3'-циклофосфаты в процессе их действия образуются как промеЖУТОЧflые продукты, mдролиз которых до 3'-фосфатов ускоряется тем же ферментом, в настоящее время рибонуклеазы

(РНКазы) 1 включены в класс гидролаз.

Представителями РНКаз 1 являются панкреатнческне РИКазы, выделенные

из многих объектов. Установлена первичная структура панкреатической РНКа­

зы быка, свиньи, овцы, жирафа, марала, косули, северного оленя, лани,

шиншиллы, мыши, крысы, морскойсвинки, одногорбого верблюда и нутрии. Во всех случаях, за исключением двух последних, фермент состоит из 124 аминокис:­

лотных остатков. Выяснена третичная структура некоторых панкреатических

РНКаз. Панкреатические РНКазы могут быть однокомпонентными (рибонукле­ аза А) и дьухкомпонентными (рибонуклеаза В, содержащая углеводный остаток

с М= 1350). Механизм действия их на РНК детально исследован и является ярким дополнением к материалам гл. 111, касающимся механизма действия ферментов.

Полипептидная цепь РИКазы, замкнутая четыIьмяя дисульфидными мо­ стиками (рис. 82, А), принимает вследствие этого пространственную конфи­ гурацию (рис. 82, Б), в определенной мере предопределяющую третичную

структуру (рис. 82, В) этого фермента. Понять механизм действия панкре­

атической РНКазы помогли данные о структуре ее активного центра (рис. 82, Г). В нем связываются участки молекулы РИК, содержащие в своем составе пиримидиновые (цитидиловые и уридиловые) нуклеотидные остатки,

причем парные сочетания ЦА, ЦГ, ЦЦ и ЦУ атакуются в пропорции

226

Ч~ДНХ

1~11''\!1\.41'~~411~1\.411~~411~~(11~,\,,1~~,'1~1~.,,~

Расщемение pcc:тpllКТllзоR

~

Вxmoчение фpancеlП'1l

.у_родиоl ДИК •

lIIJII3NIWIYIO ДНК

1bI....'W". ДНlC

~оже_ бахтеpнll

Рис. 81. Принципиалънаа схема проведения работ по гене-

тической инженерии

в В"ОСТ8С ФРагмсllТО8 '!Y*cPOдвLIX дик ИСЛОJlЬЗУЮТ гены, OТJleТCТ8CНUЫC за

биосинтез 6йолоI1f'lCCXJI эка.........

белков; их экслpeccu может быть ос··

IJОnЬЗОвапа дл, боосинте3& этох бe.rn<ОВ lJосле IIDТСГp&ЦIIIIllЛВЗМllД1l011 ДНК

•бптервanьвwll геоо" или длМ кпОDllРОВIIIIIUI геоов И их lJосле.цующеil

эксцресспв • ИНЫХ, ..см бптериllJ1ьны,' белОКСIIIIТCЭИpУЮЩIIX системах

227

		10	,0-',			20
	салв-ала-лиэ-фен-глу-аРГ-гли*~_~9,мет-асп-сер-сер_тре_сер_алв-алВ1
	~-~)	Га1~-глн -цис-тир-глн-сер..тир-сер-тре-мет_с"iр1					Щ
(Н2N)Лиэ-глу							c~p
	1	тре					I
		I	-			иле	сер
		гли				I	I
		'-- всн-лиз-цис_ала				тре	аси
			I		124	I	I
			вал)		(НООС)вал -сер	всп	тир
		60			I	I	I
г--гли -алв -вал -цис -сер-глн -лиз_всн					ала	цис •	цис
I		_			I	I	I
вал					ВСП	врг	аси
вJп	иле-вал-ала-цис-глу-гли-ВСН-ПРО-тир-вал-про-вал(':~\Фl~')					г~y	гАн
I	I	110			'000' '1200'	I	I
~	иоо					Щ	M~
I	I				90	I	I
лей	ГИС					тре	мет за
I	1]00				.	I	I
50 сер	лиз-глн -ала -	асн -тре -тре-лиэ-тир_цис -ала-асн-про-тир-лиз_сер_гли					лиз
I		,_--'\	,.--.....	-			I
глу							сер
L-гис - вал-фен "tTpe tach-вал-про.J-J!ИЗ';"ЦИС -					арг-асп-лиз-тре -лей -всн-врf---.J
		...-.......	........../	40

А

Б в

Рис. 82. Структура бычьей панкреатической рибонуклеазы и ее активноrо центра:

А-первичная структура; черными прямоугольнихами обозначеиы-S-S-свJf.IИ. арабскими цифрами-номера аминокислотных остэпов, пуmcтиром обведены аминокислотные остатки, входящие 8 состав активного центра; Б-расположение в пространстве полипептидной цепи; В-трехмерная модель молекулы при разрешении в 0.5 им; зачернена впадина, на дне которой располarаетс.

Вlпивиыll пентр; r -структура активноr" центра. в ,,'!Тором ради..алы zuc, лиз, фен, сер и mре (их ПОРllдКOвые номера

3000:500:240:27. В активном центре фермента остаток пиримидинового нукле­

отида РНК размещается таким образом, что пиримидиновое основание закреп­

ляется в субстратном центре за счет водородных связей с радикалами mре и сер, занимающими 45-е и 12З-е положения в полипептидной цепи и за счет

гидрофобного взаимодействия с радикалом фен (120-й аминокислотный оста­

ток). Вследствие этого остаток фосфата, расположенный между 3'-углеродным

атомом рибозы пиримидинового нуклеотида и 5'-ytлеродным атомом сосед­

него в цепи РНК нуклеотида, фиксируется между 12-м и 119-м остатками гис

каталитического центра. Фиксации межнуклеозидного фосфата в этом положе­

Нии способствует также радикал лиз, занимающий в молекуле РНКазы 41-e

положение, но расположенный в ее активном центре на расстоянии 0,5 им от

вышеупомянутых остатков гис. Вслед за этим наступает непосредственно

каталитический акт, осуществляемый в результате согласованной передачи

протонов и сводящийся К разрьшу межнуклеотидной фосфатной связи, об­

разованию 2', 3'-циклофосфата рибозы nиримидинового нуклеотида и по-

228

	". J\t			N-хоиец
	f! ~7/f-CO,NH-CH-CO
				'"
	ГИС1l9 <Ё>ТСНу	;>с(

Nh... 2

НlQJфен I2о

г

д

Рис. 82. Продолжение

в полипептидноli цепи указаны цифровыми индексами) сближеиы на расстояние в НecJ(олько десятых долей нанометра; д­

пространственная структура активного центра

•

следующего гидролиза 2', 3'-циклофосфатной связи с восстановлением ис­ ходной структуры активного центра (см. схему реакции).

Существенно, что именно остатки гис, находящиеся в 12-м и 119-M положе­ ниях в полипептидной цепи и сближенные в каталитическом центре фермента,

обеспечивают перенос протонов.

в цепь			ГИСl2	h'..
				N?''NH	в цепь
			/~ I
							лиримидин			HOC~H2О. основание
н	н		// ~Рибонуклеаза
										+
О	Н	'" Н		ГИСJlg							Н Н
	ой--'"		!,-+-\								Н
'\.	......ОН		~,"....'		0--......						Н
О=Рх'			HN		\~			)iN~NH			)
. ' О			"
	/~--				~		'-o~',		Е~:'..,'		""1 в цепь
СН2		снование
							~			ГИС l2
	Н Н						... НОН
							{" Н,
			Н
!WО он								jРИОНУlUJеаза
у-							\	N
в цепь							\ ...._(			I
				в цепь			~			ГИСll9

~

Hz

o_p....-оН

'он