6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

инфицированы, их можно осторожно снять и надеть новые, не вынимая рук из шкафа;

•не следует использовать горелки и спиртовки в ШББ II класса. Подготовьте пробирки с питательными средами, предметные

стекла и пробирки с осадком в порядке их регистрационных номеров;

•инокулировать пробирки объемом осадка не более 0,2 мл на каждую питательную среду;

•инокулированные пробирки поместить в наклонном положении, обеспечив равномерное распределение инокулята по поверхности косяка среды (обычно это угол наклона пробирки 15–20°);

•использовать дренированные (с продетым льняным или хлопчатобумажным шнуром) силиконовые пробки соответствующего диаметра;

•через неделю инокулированные пробирки проверяют на контаминацию или ранний рост МБ, одновременно меняют дренированные пробки на сплошные силиконовые.

Особенности культивирования микобактерий:

•микобактерии размножаются чрезвычайно медленно – время деления микробной клетки составляет 18–24 часа;

•оптимальная температура инкубации – 37°С;

•при первичном посеве микроскопически отрицательного материала средняя продолжительность роста МБТ на плотных питательных средах может составить 20–46 дней (отдельные штаммы до 90 дней);

•при отсутствии роста МБТ для выдачи отрицательного результата посевы выдерживают в термостате до 12 недель.

		Интерпретация результатов при оценке результатов
		культурального исследования:
	РЕКОМЕНДАЦИИ	• появление роста КУМ в течение 7–10 дней культивирования на
		норастущих МБ, которые могут относиться к потенциально па-
		плотных средах может свидетельствовать либо о выделении бы-
		строрастущих НТМБ;
		• появление роста КУМ после 3–4 недель культивирования сви-
	МЕТОДИЧЕСКИЕ	детельствует о выделении M.tuberculosis, а также других медлен-
		тогенным НТМБ или к кислотоустойчивым сапрофитам;
		• прежде, чем дать отрицательный ответ после 12 недель культи-
		вирования, необходимо убедиться в отсутствии роста очень
		медленнорастущих МБ, в числе которых могут быть и M.tuber-
		culosis.

468

Во всех случаях получения роста следует контролировать чистоту выросшей культуры с помощью микроскопии препарата по Ziehl-Neelsen.

Учет результатов посева диагностического материала:

При выделении культуры МБ, отвечающих следующим характеристикам:

•появление роста колоний на плотных питательных средах не ранее 3–4 недель инкубации;

•наличие колоний характерной морфологии и окраски;

•микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при окраске по Ziehl-Neelsen следует произвести количественную оценку интенсивности роста, которую обозначают по 3-х балльной системе:

(1–10) – точное число КОЕ– «единичное число КОЕ»; (1+) – 1– 20 КОЕ – “скудное” бактериовыделение;

(2+)	– 21– 100 КОЕ	–“умеренное” бактериовыделение;
(3+)	– > 100 КОЕ – “обильное” бактериовыделение.

Предварительная идентификация комплекса M.tuberculosis от НТМБ проводят с учетом скорости роста, пигментообразования, морфологии колоний, наличия кислотоустойчивости и температура роста. Сочетание описанных признаков с результатами приводимых ниже биохимических тестов позволяет провести идентификацию комплекса M.tuberculosis с точностью до 95%.

Наиболее распространенные культурально-биохимические тесты идентификации M.tuberculosis:

–тест на наличие роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл).

–рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты;

–рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия;

–рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 кар-

боксиловой кислоты (TCH).

Более подробно тесты для дифференциации отдельных видов МБ комплекса M.tuberculosis изложены в Приказе МЗ РФ №109 от 21.03.2003 (Приложение 11).

Кроме того, преподаватель обращает внимание на совокупность

характерных признаков МБ комплекса M.tuberculosis:

–медленная скорость роста (более 3-х недель);

–температура роста в пределах 35–37°С;

–отсутствие пигментообразования (цвет слоновой кости);

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

469

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

–выраженная кислотоустойчивая окраска;

–положительный ниациновый тест;

–положительный нитратредуктазный тест;

–отсутствие термостабильной каталазы (68°С);

–рост в присутствии 1–5 мкг/мл ТСН;

–отсутствие роста на среде Л-Й, содержащей: 1000 мкг/мл натрия салициловокислого, 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, 5% хлорида натрия.

Обратить внимание слушателей на возможность использова-

ния и иммунохроматографических методов идентификации М.tuberculosis на основе выявлению антигенных видоспецифических белков (MPT64), синтезируемых МБТ в процессе роста, которые и секретируется во внешнюю среду, являясь своеобразным индикатором роста клеток МБТ. Интенсивное накопление белка позволяет использовать его в тест-системах видовой идентификации МБТ с достаточно высокой диагностической чувствительностью.

Задание 1.

Разбить слушателей на группы по 2–4 человека. Используя заготовленные заранее

–авирулентные культуры разных видов МБ после их посева на диагностические среды (M.bovis BCG, и/или другие штаммы МБ на выбор преподавателя) и

–расходные материалы, лабораторную посуду, тесты идентификации МБТ и др.

предложить каждой группе коллективно провести дифферен-

циацию нескольких клинических штаммов, доказательно интерпретировав полученные результаты. Предполагается участие всех слушателей в обсуждении результатов дифференциации МБ.

Заключительная часть (10 мин)

Преподаватель подводит итоги практического занятия и отвечает на вопросы

Рекомендуемая литература

1.Вейсфеллер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии. – Изд. Академия Наук Венгрия. Будапешт. – 1975. – 335 с.

2.Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз.– СПб: Медицинская пресса, 2005.–224 с.

470

3.Приказ МЗ РФ от 21.03.2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 11.

4.Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (СП1.3.2322-08).

5.Фтизиатрия. Национальное руководство. Под ред. М.И. Перельмана. – М., 2007.

6.Collins C.H., Grange J.M., Yates M.D. Tuberculosis Bacteriology. 2nd ed. Organization and Practicе. Oxford: Butterworth-Heinemann, 1997.

7.Kantor I.N., Kim S.J., Frieden T. et al. Laboratory Services in Tuberculosis Control. Parts I–II. – 1998. – Switzerland, Geneva, WHO.

8.Kent P.T., Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level III Laboratory. USA, Atlanta, Centers for Disease Control (CDC). – 1985 & 1995.

9.Laboratory services in tuberculosis control. Part III: Culture. – 1998.

– 96 pp.

10.Mykobacterien und mykobacterielle Krankheiten/ G.Meissner. – Veb G.Fischer Verlag Jena. – 1980. – 377s.

11. The Public Health Service National Tuberculosis Reference Laboratory and the National Laboratory Network. IUATLD. – 1998. – 110 pp.

Материально-техническое обеспечение

Культуры разных видов МБ после их посева на диагностические среды, расходные материалы и лабораторная посуда, SDтесты. Инструкции к проведению исследований с помощью тестсистем. Флип-чарт, маркеры, фломастеры, мультимедийное оборудование.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

471

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 4. Лекарственная чувствительность микобактерий и методы ее определения

Тема 4.3. Правила разведения препаратов и приготовление питательных сред

Практическое занятие

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план практического занятия.

Практическое занятие проводится в интерактивной форме. Разбираются примеры приготовления питательных сред для постановки тестов на лекарственную чувствительность выделенных культур МБТ. Даются лабораторные ситуационные задачи.

При планировании практикума необходимо учесть целевую аудиторию, их уровень подготовленности и опыт работы. Учитываются знания курсантов, полученные на семинарских занятиях, а также полученные базовые знания слушателей на этапе самоподготовки: модуль 4. «Лекарственная чувствительность микобактерий и методы ее определения» тема 4.3. «Правила разведения препаратов и приготовление питательных сред».

В ходе практического занятия рекомендуется разобрать сле-

•дующие вопросы:

Правила расчета разведений ПТП для приготовления питатель-

•ных сред; Примеры расчетов разведения и приготовления питательных

сред для постановки тестов на лекарственную чувствительность МБТ.

Цель практического занятия – Дать навыки по приготовлению питательных сред с конкретными противотуберкулезными препаратами.

Вводная часть (10 мин)

В вводной части преподаватель напоминает об основных характеристиках чистых субстанций, важных для расчета разведений и приготовления питательных сред.

Детально правила этого раздела работ изложены в Приказе МЗ РФ №109 от 21.03.2003 г. (Приложение №11).

Основная часть (30 мин)

Далее слушатели разбиваются на 3–4 группы для выполнения практического задания. Каждая группа получает задание рассчитать разведения одного из противотуберкулезных препаратов.

472

После завершения работы в группах полученные расчеты обсуждаются всеми участниками занятия.

Пример расчета разведения одного из противотуберкулезных препаратов приведен в семинарском занятии темы 4.3. «Правила разведения препаратов и приготовление питательных сред».

В заключение занятия преподаватель знакомит слушателей с рабочими местами в технологической цепи приготовления питательных сред с ПТП. На выбор преподавателя и с учетом пожеланий слушателей демонстрируются наиболее важные процедуры методов. Например, взвешивание чистых субстанций, работа в ШББ 1 класса с горизонтальным потоком воздуха (с защитой продукта). Кроме того, преподаватель должен обратить внимание на подготовительные этапы используемого оборудования.

Заключительная часть (5 мин).

В заключении следует обратить внимание слушателей на необходимость качественного и точного выполнения методик разведения препаратов, приготовления навесок, соблюдения последовательности выполнения процедур приготовления питательных сред.

Рекомендуемая литература

1.Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».

2.Guidelines for drug susceptibility testing for second-line anti-tuber- culosis drugs for dots-plus. WHO/CDS/TB/2001.288. – 2001. – 12 pp.

3.Policy guidance on drug-susceptibility testing (DST) of second-line antituberculosis drugs/ WHO/HTM/TB/2008.392. – 2008. – 20 pp.

Материально-техническое обеспечение

Подготовленные рабочие места, демонстрационные чистые субстанции, расходные лабораторные материалы, весы, калькуляторы, флип-чарт, маркеры, фломастеры.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

473

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 5. Методы выявления возбудителя туберкулеза

иопределения лекарственной чувствительности с использованием автоматизированных

иполуавтоматизированных систем

Тема 5.1. Пробоподготовка, особенности культивирования, выделения и идентификации культур на автоматизированных и полуавтоматизированных системах

Практическое занятие

Количество аудиторных часов – 2

Примерный план практического занятия

Практическое занятие проводится в интерактивной форме. Учитывается знания курсантов, полученные на лекциях, семинарских занятиях, а также полученные базовые знания слушателей на этапе самоподготовки модуля 5 «Методы выявления возбудителя туберкулеза и определения лекарственной чувствительности с использованием автоматизированных и полуавтоматизированных систем» тема 5.1. «Пробоподготовка, особенности культивирования, выделения культур и идентификации на автоматизированных и полуавтоматизированных системах», а также модуля 1. «Основные биологические характеристики микроорганизмов рода Mycobacterium» темы 1.4 «Обзор микробиологических методов изучения микроорганизмов рода Mycobacterium и их место в диагностике туберкулеза».

•В ходе практического занятия рекомендуется разобрать: рабочий алгоритм и протокол пробоподготовки различных ди-

•агностических материалов;

•культивирование, выделение и идентификация культур МБ стерильность материалов и причины контаминации;

Цель – дать слушателям практические навыки пробоподготовки, культивирования выделения и идентификации культур при работе на автоматизированных системах.

Вводная часть (10 мин)

Ведущий курса кратко знакомит слушателей с основными требованиями протокола исследований при использовании автоматизированных систем.

Основная часть (70 мин)

Первичная обработка материала. Преподаватель обращает внимание курсантов на рекомендации производителя:

474

–использовать образцы мокроты и диагностических материалов, не содержащих кровь и материалов, не изменяющих кислотность питательной среды;

–приведение полученных образцов в стандартизованный вид в соответствии с протоколом и технологиями исследований;

–для предотвращения кросс-контаминации образцов допускается одновременная обработка не более 10 образцов;

–использование реактивов приготовленных ex temporae (и правила их хранения);

–правила подготовки рабочего места и др.

Преподаватель напоминает правила работы в ШББ, затем демонстрирует слушателям процедуры пробоподготовки и этапность их выполнения.

Демонстрируются правила посева в пробирки MGIT, последующего посева на плотные питательные среды и приготовления мазков. Обращается внимание на особенности выделения МБ из контаминированных образцов. Разбираются причины возникновения контаминации и мероприятия по ее предупреждению.

Ведущий курса демонстрирует правила идентификации при изоляции МБ из первичного материала при различных вариантах наличия роста культуры на кровяном агаре, результатов микроскопии выделенных культур микроорганизмов и другие тесты.

Далее слушатели делятся на группы по 4 человека и, используя заготовленные заранее стерилизованные образцы диагностических материалов, знакомятся с практикой проведения подготовки образцов (деконтаминации, разжижения, центрифугирования и т.д.) и загрузку инокулированных пробирок в прибор.

Предложить каждой группе коллективно провести выгрузку положительных учебных образцов пробирок MGIT, подготовленных заранее для слушателей. Провести оценку результатов роста и считать показания прибора. Обсудить алгоритм первичной идентификации выделенных культур. Предполагается участие всех слушателей в обсуждении результатов дифференциации МБ.

Заключительная часть (10 мин)

Для закрепления необходимо кратко перечислить основные положения пробоподготовки материалов для использовании в системе культивирования BACTEC MGIT 960. Следует помнить об ограничениях используемых технологий и высокого риска контаминации при отступлении от правил пробоподготовки диагностических материалов.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

475

Рекомендуемая литература

1.Попов С.А., Пузанов В.А., Siddiqi S., Rusch-Gerdes S. Руководство. Система BD BACTEC MGIT 960 – новый «золотой» стандарт в диагностике туберкулеза // FIND diagnostics. – 2007. – 23 с.

2.Kent P.T., Kubica G.P. Public health mycobacteriology: guide for the level III laboratory. Atlanta, GA, USA: US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control. – 1985. – P. 57–63.

3.Siddiqi S H. MGIT procedure manual for BACTEC MGIT 960 TB system. Sparks, MD, USA: Becton Dickinson. – 2005. – p 81–84.

4.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S. Руководство по работе с системой BACTEC MGIT 960 // FIND diagnostics. – 2006. – 74с.

5.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S., Alexander H. et al. MGIT Procedure Manual. For BACTEC MGIT 960 TB System (Also applicable for Manual MGIT) Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) Culture and Drug Susceptibility Demonstration Projects – 2007.

Материально-техническое обеспечение

Подготовленные рабочие места в лаборатории. Стерилизованные образцы диагностических материалов, реагенты для деконтаминации и посева, пробирки MGIT, расходные материалы и др. Флип-чарт, маркеры, фломастеры, мультимедийное оборудование.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

476

Тема 5.2. Изучение лекарственной чувствительности на автоматизированных и полуавтоматизированных системах

Практическое занятие

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план практического занятия.

Практическое занятие проводится в интерактивной форме. Учитывается знания курсантов, полученные на лекциях, семинарских занятиях, а также полученные базовые знания слушателей на этапе самоподготовки модуля 5 «Методы выявления возбудителя туберкулеза и определения лекарственной чувствительности с использованием автоматизированных и полуавтоматизированных систем» тема 5.2. «Изучение лекарственной чувствительности на автоматизированных и полуавтоматизированных системах», а также модуля 1. «Основные биологические характеристики микроорганизмов рода Mycobacterium» темы 1.4 «Обзор микробиологических методов изучения микроорганизмов рода Mycobacterium и их место в диагностике туберкулеза».

• В ходе практического занятия рекомендуется разобрать: протокол постановки тестов лекарственной чувствительности Цель – дать слушателям практические навыки постановки те-

стов лекарственной чувствительности при работе на автоматизированных системах.

Вводная часть (10 мин)

Ведущий курса напоминает слушателям основные требования протокола и схему исследований при постановке ТЛЧ при работе с автоматизированными системами:

•Положительный результат на системе MGIT И положительный результат на плотной среде Л-Й:

Культура MGIT ТЛЧ MGIT Культура Л-Й ТЛЧ Л-Й

•Положительный результат на системе MGIT И отрицательный результат на плотной среде Л-Й:

Культура MGIT ТЛЧ MGIT

ТЛЧ Л-Й

•Отрицательный результат на системе MGIT И положительный результат на плотной среде Л-Й:

Культура Л-Й ТЛЧ MGIT

ТЛЧ Л-Й

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

477