6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Основная часть (30 мин)

Подготовка к проведению ТЛЧ в системе BACTEC MGIT 960

Преподаватель готовит демонстрационные растворения препаратов из расчета на каждого пациента 7 пробирок: контроль SIRE, контроль PZA, 5 пробирок с препаратами в концентрации, указанной производителем (в мкг/мл): SIRE GC: MGIT пробирка для SIRE-контроля, не содержащая SIRE-препараты; STR 1,0; INH 0,1; RIF 1,0; EMB 5,0; PZA GC: MGIT-PZA пробирка для PZA-контроля, не содержащая препарат; PZA 100. Далее готовит взвесь микобактерий (после культивирования в пробирке MGIT) для ТЛЧ. Ведущий обращает внимание на сроки пригодности культуры для исследования на ТЛЧ.

Демонстрируются технологии приготовления суспензии МБТ, контроля мутности суспензии по стандарту мутности McFarland, выполнения различных разведений, особенности тестирования ЛЧ к PZA и др.

Далее ведущий обращает внимание слушателей на процедуры инокуляции, загрузки штатива с инокулированными пробирками в прибор и инкубации, сроки ожидания результатов, правила учета результатов исследований для использования в клинике, особенности интерпретации случаев расхождения результатов с данными, полученными методом абсолютных концентраций т.д.

Затем слушатели под наблюдением преподавателя разбиваются на группы по 4 человека и используя заготовленные заранее стерилизованные образцы МБТ производят загрузку инокулированных штативов в прибор.

Каждой группе предлагается коллективно провести выгрузку положительных учебных образцов пробирок MGIT, подготовленных заранее. Затем проводят оценку результатов роста и считывают показания прибора. Предполагается участие всех слушателей в обсуждении результатов ТЛЧ.

Заключительная часть (5 мин)

В заключении следует обратить внимание слушателей на строгое соблюдение специалистами, использующими автоматизированные технологии для исследования ЛЧ, протокола работы, рекомендованного производителем. Так же как и условия поверки и эксплуатации оборудования для получения достоверных исследований.

Возможно так же обсудить алгоритм обследования больных туберкулезом бактериологическими методами и место автоматизи-

478

рованных систем в изучении лекарственной чувствительности выделенных штаммов МБ.

Рекомендуемая литература

1.Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.

2.Попов С.А., Пузанов В.А., Siddiqi S.,Rusch-Gerdes S. Руководство. Система BD BACTEC MGIT 960 – новый «золотой» стандарт в диагностике туберкулеза // FIND diagnostics. – 2007. – 23 с.

3.Rusch-Gerdes S., Domehl C., Nardi G. et al. Multicenter evaluation of the mycobacteria growth indicator tube for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to first-line drugs // J Clin Microbiol. – 1999. – № 37. – Р. 45–48.

4.Rusch-Gerdes S., Pfyffer G. E., Casal M. et al. Multicenter laboratory validation of the BACTEC MGIT 960 technique for testing susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis to classical second-line drugs and newer antimicrobials // J. Clin. Microbiol. – 2006. – № 44. – Р. 6886–6892.

5.Siddiqi S H. MGIT procedure manual for BACTEC MGIT 960 TB system. Sparks, MD, USA: Becton Dickinson. – 2005. – p 81–84.

6.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S. Руководство по работе с системой BACTEC MGIT 960 // FIND diagnostics. – 2006. – 74с.

7.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S., Alexander H. et al. MGIT Procedure Manual. For BACTEC MGIT 960 TB System (Also applicable for Manual MGIT) Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) Culture and Drug Susceptibility Demonstration Projects – 2007.

Материально-техническое обеспечение

Стерилизованные образцы штаммов МБТ, реагенты для проведения ТЛЧ, пробирки MGIT, расходные материалы для посева и подготовки суспензии микроорганизмов и др.

Флип-чарт, маркеры, фломастеры, мультимедийное оборудование.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

479

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 8. Молекулярные методы в кластерном анализе микобактерий туберкулеза

Тема 8.5. «Применение методов молекулярной* эпидемиологии для решения клинических задач»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план практического занятия

Цель практического занятия – формирование у слушателей умений и навыков описания сполиготипов и расчета коэффициента трансмиссии на основании типирования штаммов МБТ по ПДРФ IS6110.

В упражнениях отрабатываются навыки:

–описания сполиготипа в виде бинарного кода;

–описания сполиготипа в виде октального (восьмеричного) кода;

–перевода одного варианта кодирования сполиготипов в другой;

–расчета коэффициента трансмиссии штаммов.

Примерная структура практического занятия по теме 8.5. «Применение методов молекулярной эпидемиологии для решения клинических задач» предполагает разделение занятия на 2 части, каждая из которой посвящается решению конкретной задачи.

Первая часть практического занятия

Вводная часть (5–10 мин)

Преподаватель объясняет слушателям, что для получения информации о кластерной принадлежности штамма, информация о полученном сполиготипе должна быть внесена в международную базу данных. Информация о сполигопрофиле вносится в базу данных в цифровой форме. Обычно для этого используют или бинарный или октальный код.

Участникам предлагается информация в виде раздаточного материала, в котором дается информация об описании сполигопрофилей в цифровой форме.

В дальнейшем слушателям предлагаются задачи для обработки практических навыков.

Основная часть (30 мин)

1. Преподаватель раздает образцы сполигопрофилей и предлагает описать каждому слушателю по 3 профиля в виде бинарного

ив виде октального кода.

* Демонстрационный материал к практическому занятию представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

480

2. Преподаватель дает каждому слушателю задание, где дается описание сполигопрофиля в виде:

а) бинарного кода б) октального кода

и просит перевести код из одной системы в другую.

Заключительная часть (5 мин)

Ведущий разбирает со слушателями правильность выполнения заданий.

Краткий информационный материал к первой части практического занятия

При представлении сполиготипа в виде бинарного кода отсутствие спейсора обозначают как "0", а наличие спейсора как "1". Описание идет по порядку, от первого положения до 43-го. В итоге получается набор из 43 цифр.

Например, сполигопрофиль

■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■□□□□■■■■■■■

1…………………………………………………………………43 в виде бинарного кода будет описан как 1111111001111111111111111111000100001111111

Восьмеричная система счисления – это позиционная система счисления с основанием 8. Для записи чисел в восьмеричной системе используется 8 цифр от нуля до семи (0,1,2,3,4,5,6,7).

Перевод кодов в восьмеричную систему из двоичной и обратно осуществляется с помощью простой таблицы, в которой все цифры восьмеричной системы от 0 до 7 представлены в виде двоичных триплетов (троек):

Цифры восьмеричной системы	Двоичные триплеты
0	000
1	001
2	010
3	011
4	100
5	101
6	110
7	111

Для перевода кода из двоичной системы в восьмеричную в двоичной записи сполиготипа применяется следующий алгоритм действий:

1) Бинарный код разбивается на триады:

111 111 100 111 111 111 111 111 111 100 010 000 111 111 1

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

481

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Учитывая, что анализ сполиготипов проводится по 43 спейсорам, в конце всегда будет оставаться неполная триада. По правилам перевода неполная триада должна дополняться нулями. Поскольку неполная последняя триада (43-й спейсор) всегда будет описываться в двоичной системе или 1 (есть спейсор), или 0 (нет спейсора), то он будет выглядеть как 001 или 000.

2) Каждая триада заменяется соответствующей восьмеричной цифрой.

Для 43 спейсора удобно применять следующее правило – т.к. триаде "000" в восьмеричной системе соответствует "0", а триаде 001 – соответствует "1", то на место неполной последней триады можно просто переписывать 0 или 1 из двоичного кода.

7 7 4 7 7 7 7 7 7 4 2 0 7 7 1 В результате получается код из 15 цифр.

Обратный перевод из восьмеричной системы в двоичную также прост. Для этого просто надо заменить цифру восьмеричного числа на соответствующий триплет двоичных чисел, а последнюю, пятнадцатую, цифру, оставить как есть.

Вторая часть практического занятия Цель – формирование у слушателей умений и навыков расчета

коэффициента трансмиссии штаммов.

Вводная часть (5–10 мин)

Преподаватель сообщает слушателям, что для того, чтобы определить интенсивность передачи возбудителя туберкулеза того или иного кластера, Bishai W. с соавторами, 1998, был предложен способ вычисления коэффициента активности трансмиссии (КАТ). Величина КАТ определяет интенсивность заражения людей штаммом M.tuberculosis исследуемого кластера. По мнению авторов, КАТ отражает процент случаев туберкулеза в популяции, возникших вследствие недавнего заражения штаммом определенного кластера (а не за счет эндогенной реактивации). При вычислении КАТ учитывается общее число выделенных штаммов M.tuberculosis, число штаммов исследуемого кластера и число штаммовых вариантов исследуемого кластера.

Участникам предлагается раздаточный материал с формулой вычисления КАТ.

В дальнейшем слушателям предлагаются задачи для отработки практических навыков.

482

Основная часть (30 мин)

Преподаватель представляет слушателям пример вычисления коэффициента трансмиссии. Затем предлагается задача для самостоятельного решения, и слушатели вычисляют коэффициент трансмиссии для каждой группы штаммов. На основании полученных результатов слушателем делается вывод об интенсивности трансмиссии каждой группы.

Заключительная часть (5 мин)

Преподаватель проводит обсуждение результатов, полученных слушателями при решении задач.

Краткий информационный материал ко второй части практического занятия

Коэффициент активности трансмиссии штаммов определяют по формуле:

	КАТ=	общее число штаммов данной группы – число штаммовых вариантов внутри группы	×100
		общее число исследованных штаммов	%

Например, было исследовано 500 штаммов, среди которых были описаны МБТ кластеров А (100 штаммов) и Б (250 штаммов). В кластере А было описано 12 штаммовых вариантов, а в кластере Б – 166 штаммовых вариантов.

Подставляем значения в формулу:

В результате получается, что в исследованной популяции 17,6% новых случаев возникновения туберкулеза произошли вследствие заражения МБТ кластера А, а МБТ кластера Б привели к возникновению лишь 3,2% новых случаев заболевания. Следовательно, МБТ кластера А характеризуются более активной трансмиссией, несмотря на то, что их абсолютное число в выборке было ниже, чем МБТ кластера Б.

Задача для самостоятельного решения.

Было исследовано 780 штаммов, среди которых были описаны МБТ кластеров А (100 штаммов), Б (250 штаммов) и В (50 штаммов). В кластере А было описано 20 штаммовых вариантов, а в кла-

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

483

стере Б – 200 штаммовых вариантов, в классе В – 2 штаммовых варианта. Микобактерии какого кластера наиболее трансмиссивны.

Рекомендуемая литература

1.Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область) // Проблемы туберкулеза и болезни легких. – 2006. – №1. – С. 29–35.

2.Черноусова Л.Н., Карачунский М.А. Молекулярная эпидемиология туберкулеза // Проблемы туберкулеза. – 2007. – № 4. – С. 3–7.

3.Brudey K., Driscoll J., Rigouts L. et al. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology // BMC Microbiol. – 2006. – Vol. 6. – P. 23.

Материально-техническое обеспечение

Флип-чарт маркеры, фломастеры, раздаточный материал, мультимедийное оборудование.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

484

МОДУЛЬ 9. Молекулярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМ

Тема 9.3. «Методология проведения ПЦР анализа»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план практического занятия

Цель практического занятия – знакомство с особенностями постановки ПЦР-анализа для выявления ДНК микобактерий.

Практическое занятие проводится в интерактивной форме. При разработке плана проведения практического занятия необходимо учитывать базовые знания слушателей, закладываемые на этапе самоподготовки.

Входе практического занятия рекомендуется разобрать:

•Особенности выделения ДНК МБТ

•Условия амплификации ДНК МБТ

•Детекция продуктов ПЦР

Вводная часть (5–10 мин)

Слушателям предлагается назвать особенности работы с диагностическими образцами от больных туберкулезом, определяющие трудности в проведении выделения ДНК из материала и вспомнить основные этапы проведения ПЦР-анализа

Основная часть (30 мин)

Решение задач.

Задача 1.

На жидкой питательной среде в системе BACTEC MGIT 960 получена культура бактериальных клеток. Необходимо провести идентификацию культуры методом ПЦР. Какой способ выделения ДНК вы выберете для такого образца? Почему?

Задача 2.

В лабораторию была доставлена мокрота. Каким способом вы будете выделять ДНК? Почему?

Задача 3.

На базе бактериологической противотуберкулезной лаборатории решено развернуть ПЦР-лабораторию для проведения ПЦР с электрофоретической визуализацией результата. Сколько дополнительных помещений потребуется выделить лаборатории и какие виды работ будут осуществляться в каждом помещении?

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

485

Задача 4.

На базе бактериологической противотуберкулезной лаборатории решено развернуть ПЦР-лабораторию для проведения ПЦР в режиме реального времени. Сколько дополнительных помещений потребуется выделить лаборатории и какие виды работ будут осуществляться в каждом помещении?

Заключительная часть (5 мин)

Преподаватель проводит обсуждение результатов, полученных слушателями при решении задач.

Рекомендуемая литература

1. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и соавт. ПЦР «в реальном времени». Под ред. Д.В. Ребрикова, – изд 2-е, испр. и доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2009. – 223 с.

Материально-техническое обеспечение

Флип-чарт маркеры, фломастеры, мультимедийное оборудование.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

486

Тема 9.4. «Разнообразие тест-систем для детекции результатов ПЦР-анализа»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план практического занятия

Цель практического занятия – знакомство с разнообразием ПЦР тест-систем.

Входе практического занятия рекомендуется разобрать:

•Тест-системы с электрофоретическим анализом результатов

•Тест-системы для проведения ПЦР в режиме реального времени

•Особенности основных тест-систем для ПЦР-диагностики туберкулеза Практическое занятие проводится в интерактивной форме.

При разработке плана проведения практического занятия необходимо учитывать базовые знания слушателей, закладываемые на этапе самоподготовки.

Вводная часть (5–10 мин)

Слушателям предлагается к запоминанию материал, который потом обсуждается с ведущим.

Основная часть (30 мин)

Ведущий рассказывает слушателям особенности ПЦР тест-си- стем с различными вариантами визуализации результата, объясняя достоинства и недостатки каждого.

Заключительная часть (5 мин)

Преподаватель отвечает на вопросы слушателей.

Краткий информационный материал к практическому занятию

ПЦР-диагностика

Впоследние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов – полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая быстро нарабатывать в пробирке определенный фрагмент ДНК до концентрации, при которой его легко детектировать.

Вмедицине ПЦР применяют при диагностике инфекционных заболеваний, наследственных заболеваний, различных видах генотипирования, определении отцовства и т.д. Санитарно-эпидемио- логические службы используют ПЦР для контроля за микробио-

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

487