6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

логическим загрязнением окружающей среды и продуктов питания, а также для выявления генетически модифицированных источников пищи (ГМИ). Наиболее важные параметры любых методов, используемых в диагностических лабораториях можно сформулировать следующим образом: надежность (в том числе чувствительность и специфичность), простота выполнения, время анализа и цена. Переход любого метода из научно-исследователь- ской лаборатории в лабораторию диагностическую сопряжен с рядом возникающих на этом пути проблем. Несмотря на высокую технологичность ПЦР и относительную простоту выполнения анализа, можно назвать ряд моментов, требующих специальной адаптации для практического использования метода в медицинской диагностике. Во первых, уровень специальной подготовки сотрудников диагностической лаборатории принципиально отличается от подготовки сотрудников научно-исследовательского института. Поэтому выполнение всех процедур должно быть максимально стандартизовано и упрощено, а трактовка результатов должна быть однозначной и по возможности не требовать субъективной оценки лаборантом. Во вторых, в отличие от НИИ, где олигонуклеотидные затравки (праймеры) для ПЦР чаще всего используют один или небольшое число раз для получения результатов в конкретном эксперименте, при проведении ПЦР-диагностики относительно небольшой набор ПЦР-тест-систем используют постоянно на протяжении многих лет. Такая работа с чрезвычайно чувствительной методикой, какой является ПЦР, при использовании методов детекции, требующих извлечения амплифицированного материала из пробирки, неизбежно ведет к загрязнению лаборатории продуктами реакции и, как следствие, получению ложных результатов исследования. Поэтому правильная организация диагностической ПЦР-лаборатории имеет принципиальное значение для получения достоверных результатов при проведении тестирования.

Вэтой связи можно сформулировать основные направления развития ПЦР-диагностики в ближайшем будущем:

а) повышение общей надежности метода; б) дальнейшее упрощение процедуры анализа; в) сокращение времени исследования; г) широкое внедрение количественной ПЦР.

Всвою очередь, эти тенденции будут реализованы за счет использования флюоресцентных методов детекции продуктов амплификации, автоматизации и применения компьютерных методов регистрации и трактовки результатов исследования.

488

Уже сейчас техника выполнения процедур при проведении ПЦР-диагностики довольно проста. Весь анализ можно подразделить на три этапа: пробоподготовка (очистка ДНК или РНК исследуемого объекта от примесей), амплификация определенного фрагмента ДНК и регистрация результатов амплификации.

Пробоподготовка

Внастоящее время на отечественном рынке представлено большое разнообразие наборов реактивов для пробоподготовки (очистки нуклеиновых кислот).

Всреднем, упрощенный вариант пробоподготовки занимает 30 минут на обработку 20–30 образцов. Развитие методик пробоподготовки можно прогнозировать в направлении повышения эффективности удаления ингибиторов и удобства автоматизации процесса. Некоторые образцы биоматериала содержат агенты, существенно снижающие эффективность реакции. При проведении количественного ПЦР-анализа такое отличие в эффективности амплификации может внести существенную ошибку, поэтому

сраспространением количественного анализа требования к чистоте получаемой ДНК повышаются.

Амплификация

Поскольку амплификационная часть большинства диагностических ПЦР-тест-систем предлагается пользователю в виде предварительно смешанных и разнесенных по реакционным пробиркам реактивов, подготовка реакций на этапе амплификации состоит из добавления в пробирку очищенной ДНК и полимеразы (или только ДНК, если полимераза уже присутствует. Стоит отметить только существующую тенденцию к переходу от использования отдельных реакционных пробирок к стандартным форматам скрепленных пробирок (8 или 12-луночные стрипы и 96 или 384луночные планшеты). При этом возможность использования многоканальных пипеток и дозаторов ускоряет процедуру приготовления реакционной смеси. Крупные диагностические центры при использовании планшетных форматов, могут использовать роботизированные дозирующие станции, снижающие вероятность ошибки лаборанта.

Регистрация результатов амплификации

Достоверность исследования в значительной мере связана со способом детекции и интерпретации результатов ПЦР. В настоящее время можно выделить четыре системы детекции результатов ПЦР, наиболее часто применяемых в диагностических лаборато-

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

489

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

риях: гель-электрофорез, флюоресцентная детекция результатов после ПЦР (FLASH) и флюоресцентная детекция во время ПЦР (Real-Time PCR). Последние два метода отличаются тем, что продукт амплификации для определения не извлекается из пробирки, а регистрация результатов (измерение флюоресценции) идет в закрытой пробирке через прозрачный пластик.

Одной из основных проблем, возникающих в ходе проведения ПЦР-диагностики, является загрязнение (контаминация) ампликонами, накапливающимися в лаборатории при проведении электрофореза в агарозном геле или гибридизации в планшетах. Исключение стадии электрофореза за счет применения систем регистрации результатов в закрытой пробирке позволяет полностью решить проблему контаминации ампликонами.

Очевидно, что методики FLASH и Real-Time PCR обладают целым рядом преимуществ в сравнении с электрофоретическими методами анализа и будут стремительно занимать все большее место на рынке диагностических услуг.

Повышение надежности тест-систем за счет использования внутреннего контрольного образца

Для повышения надежности результатов исследования и их однозначной трактовки, в лабораторной диагностике, так же, как и

внаучных экспериментах, используют ряд контрольных экспериментов (реакций). Помимо стандартных положительной и отрицательной контрольных реакций, в ПЦР-диагностике используют внутренний контрольный образец (ВКО). Использование ВКО основано на возможности проведения в одной реакционной пробирке нескольких практически независимых реакций амплификации для разных фрагментов ДНК. В частности, для контроля за эффективностью ПЦР можно использовать одновременное протекание двух реакций амплификации в одной пробирке. В одной из таких реакций происходит накопление целевого фрагмента ДНК (участок генома инфекционного агента, трансгенного растения и т.д.), а в другой амплифицируется специально добавленная

вреакцию ДНК (обычно это фрагмент плазмидной ДНК). С помощью ВКО, добавляемого в образец перед этапом пробоподготовки (очистки ДНК от примесей), можно проконтролировать эффективность всех этапов анализа.

Повышение надежности документирования, интерпретации и хранения результатов анализа:

Использование электрофореза для детекции результатов ПЦР, как правило, связано с визуальным анализом полученных данных

490

и фиксированием результатов в лабораторном журнале вручную, что может вызывать целый ряд ошибок при документировании и интерпретации результатов исследования. Современные компьютерные программы в комбинации с применением гибридизационных олигонуклеотидных зондов для проявки результатов ПЦР (методы FLASH или Real-Time PCR) позволяют практически полностью исключить неверную трактовку результатов.

Автоматизированная система фиксирования данных с детектирующего амплификатора или специализированного флюориметра в памяти персонального компьютера позволяет вести эффективную документацию и хранение информации с возможностью выведения отчета о проведенном анализе на принтер.

Обучение лаборантов, повышение квалификации врачей

Одним из направлений, требующих существенного развития, остается система обучения сотрудников диагностических ПЦР-ла- бораторий основам метода ПЦР, возможным ошибкам, выявлению ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования. Незнание лаборантами основ нового метода приводит зачастую к грубейшим ошибкам и неправильной трактовке результатов исследования.

Не менее, а возможно и более важной задачей является повышение уровня подготовки врачей, использующих результаты ПЦР для постановки диагноза и выбора курса лечения.

Возможность быстрого и чрезвычайно точного обнаружения широкого спектра инфекционных агентов методом ПЦР является мощнейшим инструментом, неумелое использование которого может более навредить пациенту, чем помочь. Исключительная чувствительность ПЦР позволяет обнаружить в исследуемом образце единичные копии ДНК, и далеко не всегда присутствие условно-патогенных микроорганизмов должно трактоваться врачом как причина наблюдаемого заболевания. Повышение подготовки лечащих врачей в области трактовки результатов ПЦР-ис- следования позволит правильно поставить диагноз и выбрать оптимальный курс лечения.

Рекомендуемая литература

1.Aslanidis C., Nauck M., Schmitz G. High-speed prothrombin GA 20210 and methylenetetrahydrofolate reductase C-T 677 mutation detection using real-time fluorescence PCR and melting curves // BioTechniques. – 1999. – Vol. 27. – P. 234–238.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

491

2.Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J Mol Endocrinol.

–2000. – Vol. 25(2). – P. 169–193.

3.Feinberg M., Fernandez S., Cassard S., Bertheau Y. Quantitation of 35S promoter in maize DNA extracts from genetically modified organisms using real-time polymerase chain reaction, part 2: interlaboratory study. JAOAC Int. – 2005. – Vol. 88(2). – P. 558–573.

4.Giulietti A., Overbergh L., Valckx D., Decallonne B., Bouillon R., Mathieu C. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression // Methods. – 2001. – Vol. 25(4). – P. 386–401.

5.Lay M.J. Wittwer C.T., Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR // Clin Chem. – 1997. – Vol. 43(12). – P. 2262–2267.

6.Schmittgen T.D. Real-time quantitative PCR. Methods. – 2001. – Vol. 25(4). – P. 383–385.

7.Walker N.J. A Technique whose time has come // J. Science. – 2002.

–Vol. 296. – P. 557–559.

Материально-техническое обеспечение

Флип-чарт маркеры, фломастеры, мультимедийное оборудование.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

492

МОДУЛЬ 10. Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий

Тема 10.2. «Методы, позволяющие дифференцировать виды* микобактерий внутри туберкулезного комплекса»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план практического занятия

Цель практического занятия – знакомство с методами идентификации микобактерий внутри туберкулезного комплекса, формирование у слушателей базовых навыков проведения кластерного анализа сполиготипов штаммов M.tuberculosis и M.bovis.

Входе практического занятия рекомендуется разобрать:

•анализ результатов сполиготипирования штаммов M.tuberculosis

иM.bovis

•ДНК-стриповая технология идентификации M.tuberculosis complex.

•ПЦР-тест-системы для идентификации микобактерий внутри туберкулезного комплекса Практическое занятие проводится в интерактивной форме. Ре-

комендуется использовать следующие методы: решение задач идентификации штаммов микобактерий внутри туберкулезного комплекса, разбор профилей сполиготипирования клинических изолятов M.tuberculosis.

При разработке плана проведения практического занятия необходимо учитывать базовые знания слушателей, закладываемые на этапе самоподготовки.

Вводная часть (5–10 мин)

Участникам предлагается информация на слайдах для того, чтобы они могли запомнить основное содержание, которое понадобится для отработки практических навыков.

Основная часть (30 мин)

1. Знакомство с анализом профилей сполиготипов для дифференцировки M.tuberculosis – M.bovis

Слушателям раздаются фотографии сполиготипов. Слушатели должны выбрать сполиготипы M.bovis и объяснить, по каким критериям делался выбор.

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

493

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2. Решение задач.

Задача 1.

От пациента противотуберкулезного учреждения был передан диагностический материал (мокрота) в лабораторию для подтверждения диагноза туберкулез. Материал был посеян на жидкую питательную среду в системе BACTEC MGIT 960. Через 3 недели культивирования получена культура. Перечислить действия, которые необходимо произвести с положительной пробиркой до постановки теста на лекарственную чувствительность.

Задача 2.

В противотуберкулезную лабораторию направили диагностический материал от пациента (возраст – 3 года). Был произведен посев на жидкую питательную среду в системе BACTEC MGIT 960. Положительный сигнал получен через 2 недели культивирования. Идентификационные тесты показали, что культура принадлежит к M.tuberculosis complex, неспецифической микрофлоры не обнаружено. Постановка теста на ЛЧ к ПТП 1-го ряда дала следующие результаты:

S – чувствительные

I – чувствительные

R – чувствительные

E – чувствительные

PZA – устойчивые

Что необходимо сделать при получении таких результатов и почему?

Заключительная часть (5 мин)

Ведущий фиксирует внимание слушателей на основных методах дифференцировки штаммов M.tuberculosis от M.bovis.

Краткий информационный материал к практическому занятию

Mycobacterium tuberculosis complex включает в себя близкородственные виды микобактерий, способных вызвать у человека и животных заболевание ТУБЕРКУЛЕЗ

•M.tuberculosis

•M.bovis (включает M.bovis BCG)

•M.africanum

•M.canettii

•M.caprae

•M.microti

•M.pinnipedii

494

Методы идентификации внутри туберкулезного комплекса

• Микробиологические

oПосев на селективные среды

oПроведение биохимических тестов

•Молекулярно-генетические

oГенотипирование по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, содержащих различные вставочные последовательности, ПДРФ IS6110, ПДРФ IS1081

•o Методы, основанные на ПЦР

•ДНК-стриповая технология ПЦР в режиме реального времени с праймерами, специфичными для M.bovis и M.tuberculosis

Чаще всего в условиях отечественных противотуберкулезных

лабораторий необходимо выполнять дифференциацию между M.tuberculosis и M.bovis BCG для выявления случаев поствакцинальных осложнений у детей.

Минимальный набор тестов, необходимых для микробиологической дифференциации M.tuberculosis – M.bovis/M.bovis BCG

1.Рост на среде с салициловокислым натрием

2.Рост на среде, содержащей гидразид тиофен-2карбоксиловой кислоты (TCH)

3.Рост на среде, содержащей пиразинамид

Молекулярно-генетические методы

•ПДРФ из-за трудоемкости методики можно использовать только для решения задач молекулярной эпидемиологии.

•Для решения клинических задач эффективнее всего использовать методы, основанные на ПЦР Сполиготипирование

Вклассическом формате (проведение гибридизации на мембране) больше подходит для решения задач молекулярной эпидемиологии. В формате микрочипов подходит для решения клинических задач – дифференцировки М.tuberculosis от M.bovis.

Анализ сполиготипов для дифференцировки M.tuberculosis- M.bovis основан на количестве уникальных спейсеров в DR-ре- гионе (присутствии-отсутствии спейсеров). У всех штаммов M.bovis обязательно отсутствуют 3, 9, 16 и последние 5 спейсеров.

ПЦР

•ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на ДНК-стриповых полосках (GenoType® MTBC, Hain life-

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

495

science, Германия). Достоинства: возможно одновременное определение 5 видов микобактерий туберкулезного комплекса (M.tuberculosis, M.africanum, M.microti, M.bovis, M.caprae) и дифференциация между M.bovis и M.bovis BCG.

•Предпочтительнее всего для дифференциации M.tuberculosis- M.bovis использовать ПЦР в режиме реального времени с праймерами, специфичными для данных видов, которые имеются на отечественном рынке. Позволяют в одной пробирке произвести идентификацию M.tuberculosis/M.bovis/M.bovis BCG.

	Рекомендуемая литература
	1.	Литвинов В.И., Макарова Н.В., Краснова М.А. Нетуберкулез-
		ные микобактерии. – М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с
	2.	Мороз А.М., Макарова М.В., Краснова М.А. Идентификация
		микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хро-
		матографии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и им-
		мунобиологии. – 2009. – № 3. – С. 64–66.
	3.	Мороз А.М., Макарова М.В., Краснова М.А. Сравнительные
		данные применения высокоэффективной жидкостной хрома-
		тографии для идентификации микобактерий, выделенных на
		жидкой и плотной питательных средах // Туберкулез и болезни
		легких. – 2009. – № 8. – С. 49–51.
	4.	Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз. – СПб: Медицин-
		ская пресса. – 2005. – 224 с.
	5.	Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003. «О совершенствовании про-
		тивотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»
	6.	Хоулт Дж., Криг Н. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Том
		2. Изд. Мир, 1997. – 368 с.
	7.	Cook V.J., Turenne C.Y., Wolfe J., Pauls R., KabaniA. Conventional
		methods versus 16S ribosomal DNA sequencing for identification of
РЕКОМЕНДАЦИИ		Nontuberculous Mycobacteria: Cost Analysis // J. Clin. Microbiol. –
		2003. – Vol. 41. – P. 1010–1015.
	8.	Kox L.F., van Leeuwen J., Knijper S., Jansen H.M., Kolk A.H. PCR
		assay based on DNA coding for 16S rRNA for detection and identi-
		fication of mycobacteria in clinical samples // J. Clin. Microbiol. –
		1995. – Vol. 33 (12) – P. 3225–3233.
МЕТОДИЧЕСКИЕ	9.	Lee A.S., Jelfs P., Sintchenko V., Gilbert G.L. Identification of non-
		tuberculous mycobacteria: utility of the GenoType Mycobacterium
		CM/AS assay compared with HPLC and 16S rRNA gene sequencing.
		//J. Med. Microbiol. – 2009. – Vol. 58. – P. 900–904.

496

10.Mahillon J., Chandler M. Insertion Sequences // Microbiology and Molecular Biology Reviews. – 1998. – P. 725–774.

11.Park H., Jang H., Kim Ch., Chung B., Chang Ch.L., Park S.K., Song S. Detection and identification of Mycobacteria by amplification of the internal transcribed spacer regions with genusand species-spe- cific PCR primers // J. Clin. Microbiol. – 2000. – Vol. 38. – P. 4080– 4085.

12.Russo C., Tortoli E., MenichellaD. Evaluation of the New GenoType Mycobacterium Assay for Identification of Mycobacterial Species // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol. 44. – P. 334–339.

13.Said H.M., Ismail N., Osman A., Velsman C., Hoosen A.A. Evaluation of TBc identification immunochromatographic assay for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex in samples from broth cultures // J. Clin. Microbiol. – 2011. – Vol. 49 (5). – P. 1939– 1942.

14.Shitikov E., Ilina E., Chernousova L., Borovskaya A., Rukin I., Afanas’ev M., Smirnova T., Vorobyeva A., Larionova E., Andreevskaya S., Kostrzewa M., Govorun V. Mass spectrometry based methods for the discrimination and typing of mycobacteria // J. Infection, Genetics and Evolution. – 2012. – Vol. 12. – P. 838–845.

15.Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae and other aerobic Actinomycetes; Approved Standards. – M 24–A. – Vol. 23. – №18.

16.Thibault V.C., Grayon M., Boschiroli M.L., Hubbans C., Overduin P., Stevenson K., Gutierrez M.C., Supply Ph., Biet F. New VariableNumber Tandem-Repeat markers for typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M.avium Strains: Comparison with IS900 and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism typing. Published ahead of print 30 May 2007, doi: 10.1128/JCM.00476-07.

17.Zolg J.W., Philippi-Schulz S. The superoxide dismutase gene, a target for detection and identification of mycobacteria by PCR // J.Clin. Microbiol. – 1994. – Vol. 32. – P. 2801–2812.

Материально-техническое обеспечение

Флип-чарт маркеры, фломастеры, раздаточный материал, мультимедийное оборудование.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

497