1 Етап. Виділення мікросомальної фракції печінки (демонстрація).

2 Етап. Визначення анілін-n-гідроксилазної активності мікросом печінки.

Принцип методу. Швидкість реакцій гідроксилювання в мембранах ендоплазматичного ретикулума печінки значно посилюється при інтоксикації ксенобіотиками, ендогенними токсинами, при вживанні лікарських засобів, під впливом фізіологічно активних сполук (гормонів, вітамінів, тощо).

Метод визначення активності ґрунтується на визначенні вмісту 4-амінофенолу, який утворюється при гідроксилюванні аніліну в монооксигеназному ланцюгу мікросом при участі цитохрому Р-450. При взаємодії 4-амінофенолу з фенолом в присутності карбонату натрію утворюється індофенольний комплекс синього кольору.

Хід роботи. У три пробірки (контрольну, дослідну №1 та дослідну №2) вносять по 0,4 мл трис-НСІ буферу (рН = 7,4), 0,4 мл 0,16 М розчину хлориду магнію, 0,1 мл суспензії мікросом (в контрольну та дослідну №1 вносять мікросоми нормального щура, в дослідну №2 - мікросоми щура, якому попередньо було введено індуктор мікросомального окислення - фенобарбітал), 0,2 мл 0,03 М розчину НАДФН і 0,11 мл свіжоперегнаного 0,03 М розчину аніліну. В контрольну пробу додають 0,5 мл 15% розчину трихлороцтової кислоти (ТХО). Пробірки поміщають на 20 хв в термостат при 37°C.

По закінченні інкубації до дослідної проби додають 0,5 мл 15% розчину ТХО для зупинки реакції. Пробірки центрифугують протягом 10 хв при 700g.

Відбирають з кожної пробірки по 1,0 мл надосадової рідини, додають по 0,5 мл 10% розчину карбонату натрію і по 1,5 мл 2% розчину фенолу, розчиненого в 0,2 М розчині гідроксиду натрію. Вміст пробірок перемішують. Для розвитку забарвлення пробірки поміщають на 30 хв в термостат при 37°С. Екстинкцію дослідних проб вимірюють проти контрольної на фотоелекгроколориметрі при 630 нм (червоний світлофільтр) в кюветі з товщиною шару 10 мм.

Розрахунок анілін-n-гідроксилазної активності. Для розрахунку активності будують калібрувальний графік. Для цього беруть декілька пробірок з різними стандартними розчинами 4-амінофенолу. У всі пробірки додають по 0,5 мл 10% розчину карбонату натрію та по 1,5 мл 2% розчину фенолу в 0,2 М розчині гідроксиду натрію. Вимірюють екстинкцію проб проти контролю і будують калібрувальний графік.

Розрахунок проводять за формулою:

,

де X - гідроксилазна активність в нмоль на 1 мг білка за хвилину; А - вміст 4-амінофенолу в пробі, знайдений по калібрувальному графіку в нмоль; V - об'єм проби, рівний 1,71 мл; m - вміст білка в пробі, в мг.

За результатами проведеного експерименту зробити висновок щодо впливу фенобарбіталу на гідроксилазну активність мікросомальної фракції печінки.

Клініко-діагностичне значення. Порушення детоксикаційної функції печінки проявляється зниженням перетворення (гідроксилювання) та кон'югації ендогенних (білірубін, індол, скатол) та екзогенних (бензойна кислота, спирти, фармакологічні препарати) сполук.

Порушення метаболічних процесів достовірно відображають функціональні тести:

• за змінами активності ферменту - анілін-л-гідроксилази та за антипіриновим тестомоцінюють потужність монооксигеназних реакцій мікросомального окислення (перша стадія детоксикації);

• за тестом з бензойною кислотою оцінюють активність процесів кон'югації (друга стадія детоксикації).

Клінічно важливим прикладом оцінки інтенсивності реакції кон'югації з гліцином є утворення гіпурової кислоти при взаємодії ендогенного гліцину з введеною в оргашзм бензойною кислотою. Визначення кількості екскретованої з сечею гіпурової кислоти після введення per os стандартної дози бензоату натрію, лежить в основі дослідження антитоксичної функції печінки. Цей тест носить назву - проба Квіка.

Тема заняття 18. Дослідження нормальних та патологічних компонентів сечі