Практичні роботи
Завдання 1. Виявлення глюкози в слині методом Фелінга (якісна реакція).
Принцип методу. Реакція грунтується на здатності альдегідної груни глюкози, при нагріванні в лужному середовищі окиснюватись, відновлюючи при цьому блакитний гідроксид міді (II) Cu(ОН)2 в жовтий гідроксид міді (І) Cu(ОН). При подальшому нагріванні утворюється оксид міді (І) Cu 2О цеглянисто-червоного кольору.
Реактив Фелінга, який використовують в реакції, отримують при змішуванні рівних кількостей розчину сульфату міді (розчин Фелінга 1) та лужного розчину сегнетової солі (розчин Фелінга 2). В результаті взаємодії сульфату міді з лугом утворюється гідроксид міді (II), який тут же вступає в реакцію з сегнетовою сіллю з утворенням темно-синього розчину мідно-винного комплексу (реактиву Фелінга).
Весь гідроксид міді (II) в реактиві Фелінга комплексно зв’язаний з сегнетовою сіллю, що перешкоджає утворенню з нього чорного осаду оксиду міді (II) при нагріванні.
Хід роботи. В пробірку вносять 1 мл слини, додають 10 крапель розчину Фелінга і нагрівають до кипіння. За наявності глюкози в слині випадає жовтий осад Cu(ОН) або цеглянисто-червоний Cu2О. Інтенсивність забарвлення та кількість осаду залежать від вмісту глюкози в досліджуваній пробі слини.
Завдання 2. Виявити патологічні компоненти у шлунковому соку.
1. Виявлення молочної кислоти в шлунковому соку (якісна реакція) за методом Уффельмана.
Принцип методу. Метод ґрунтується на взаємодії комплексної сполуки феноляту заліза фіолетового кольору з молочною кислотою з утворенням лактату заліза жотувато-зеленого кольору.
Хід роботи 1. Приготування феноляту заліза: в колбу, що містить Юмл 1 % розчину фенолу, по краплях додають 1 % розчин хлориду заліза (III) до появи інтенсивного фіолетового забарвлення.
2. Виявлення молочної кислоти. У три пробірки, вносять по 2 MJ приготованого розчину феноляту заліза і додають: в першу пробірку - 1 мл 0,5 °/ розчину молочної кислоти; в другу пробірку - 1 мл шлункового соку; в треті пробірку - 1 мл води. Вміст пробірок добре перемішують і спостерігають з зміною забарвлення.
3. Експрес метод. В пробірку вносять 1 мл реактиву Уффельмана (комплексна сполука феноляту заліза) і додають 10 крапель слини. Розвивається жовто-зелене забарвлення (лактат заліза).
Клініко-діагностичне значення. Молочна кислота у вмісті цілую здорової людини не виявляється, але при ахлоргідрії, коли має місце бродіння, можна визначити звичайними якісними пробами. Наявність молочної кислоти збільшення органічних кислот у вмісті шлунка свідчить про бродіння вуглеводів у ньому.
2. Виявлення наявності крові у шлунковому соку бензидиново пробою.
Принцип методу. Кров виявляється за допомогою бензидинової проби, яка ґрунтується на здатності гемоглобіну каталізувати окислення бензидину пероксидом водню з утворенням продуктів окислення синього або зеленої кольору.
Хід роботи.
До 1 мл досліджуваного (патологічного) шлункового соку додають 5 крапель 10%-го розчину бензидину в оцтовій кислоті та 3 краплі 3%-го розчину пероксиду водню. За присутності крові розвивається синє або зелене забарвлені внаслідок окислення бензидину.
За результатами проведених експериментів зробити висновки.
Завдання 3. Дослідження активності ліпази підшлункової залози.
Принцип методу: Про активність панкреатичної ліпази судять кількості звільнених під дією ферментів жирних кислот, які відтитровують лугом.
Хід роботи: Три пробірки заповнюють за схемою, вміст пробірок інкубують на водяній бані при 37°С протягом 15 хв. Після інкубації проводять титрування ОД М розчином гідроксиду натрію в присутності фенолфталеїну Кількість лугу в мл, що пішла на титрування (нейтралізацію) звільнених жирних кислот, є показником активності ліпази.
|
Компоненти суміші |
№ пробірки | ||
|
|
1 |
2 |
3 |
|
Рослинна олія |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Витяжка з підшлункової залози |
1 |
1 |
- |
|
Жовч |
- |
2 |
2 |
|
Буфер рН 7,8 |
3 |
1 |
2 |
|
Кількість NaOH, що пішла на титрування |
|
|
|
Завдання 4. Кількісне визначення активності амілази слини методом Вольгемута.
Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість фермента, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1%-го розчину крохмалю. Цю кількість фермента приймають за одиницю амілазної активності.
Амілазна активність виражається в кількості 0,1 %-го розчину крохмалю в мілілітрах, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл слини при температурі 37°С протягом 30 хв. В нормі амілазна активність слини А = 160 - 320.
Хід роботи: У сім пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл води. У 1-у пробірку додають 1 мл розведеної у 10 разів слини. Вміст добре перемішують і 1 мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї - до третьої і т.д. Таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту буде у два рази меншим, ніж у попередній. Потім в усі пробірки наливають по 2 мл 0,1% розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки на водяну баню (чи у термостат) при 37°С на 30 хв. Після цього пробірки виймають та охолоджують для завершення дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду, добре перемішують та спостерігають за змінами кольору. Рідина у пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначають синє, червоне та жовте забарвлення буквами "С", "Ч", "Ж". Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та розраховують активність амілази слини:
|
Показник |
Пробірки | ||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 | |
|
Розведення (слини чи сечі) |
1/20 |
1/40 |
1/80 |
1/160 |
1/320 |
1/640 |
1/1280 |
|
Кількість 0.1% розчину крохмалю, мл |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
Забарвлення з йодом |
|
|
|
|
|
|
|
|
Висновки: | |||||||
Розрахунок. Для обчислення активності амілази необхідно знати розведення слини в останній пробірці, де відбувся повний гідроліз крохмалю.
Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою) в якій слина розведена у 160 разів. Складають пропорцію та обчисляють активність амілази:
X=
1/160 мл слини розщеплює 2мл 0,1 %-го розчину крохмалю;
1 мл слини розщеплює х мл 0,1 %-го розчину крохмалю,
звідки
Х=
Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності крові та сечі. Зростання активності амілази (внаслідок збільшення кількості) в сироватці крові буде мати діагностичне значення для підтвердження наявності запалення підшлункової залози - панкреатиту. Внаслідок розвитку панкреатиту, при пошкодженні панкреацитів підвищується секреція панкреатичного соку, передчасне виділення та активація ферментів безпосередньо в протоках і клітинах залози. Внаслідок цього в кров попадають ферменти підшлункової залози, такі як трипсин і амілаза, активність якої в сироватці крові значно зростає.
Тема заняття № 9. Дослідження функціональної ролі водорозчинних (коферментних) та жиророзчинних вітамінів у метаболізмі та реалізації клітинних функцій