7.Осаждение вирусов в изоэлектрической точке.

Осаждение в изоэлектрической точке (ИЭТ). Поскольку в состав наружной оболочки вирусов, как правило, входят слабокислые белки, ИЭТ большинства вирусов лежит в области рН 3,5-6,0. Метод осаждения в изоэлектрической точки можно применять в простом варианте, доводя рН суспензии до нужной величины и отделяя преципитат вируса низкоскоростным центрифугированием. При этом вместе с вирусом будут осаждаться балластные белки, имеющие более высокую ИЭТ, чем вирус. Этот метод позволяет сконцентрировать вирус, т.к. последующее ресуспендирование осуществляется в значительно меньшем объеме. Осаждение в ИЭТ можно применять и в «дробном» варианте. Допустим ИЭТ вируса лежит в области рН 4,0. В этом случае рН суспензии сначала доводят до 5,0 и низкоскоростным центрифугированием удаляют осаждающиеся примеси. Затем подкисляют суспензию до рН 4,0. Вирус при этом агрегирует и осаждается. Недостаток метода: многие вирусы чувствительны даже к незначительным изменениям рН среды, и такая обработка может привести к потери биологической активности или даже к разрушению вирионов.

8. Висалювання сірчанокислим амонієм. Діаліз.

Осаждение сульфатом аммония. Процедура очистки и концентрирования вирусов этим методом принципиально не отличается от аналогичного метода фракционирования белков. Требуемая для осаждения вируса концентрация сульфата аммония может быть выражена двумя способами : объемно-весовыми процентами соли (например, 25 % - 25 г соли в 100 мл раствора) либо процентом от насыщения (например, 25 % насыщения сульфатом аммония – 11 г соли в 100 мл суспензии; насыщенный раствор сульфата аммония содержит 430 г соли в 1 л раствора). Метод весьма эффективен, как и предыдущий метод осаждения в ИЭТ, но имеет ряд недостатков, т. к. некоторые вирусы разрушаются в растворах с высокой ионной силой. При осаждении вируса из очень большого объема (литры и даже десятки литров) требуется большое количества соли (килограммы). После осаждения вируса сульфатом аммония проводят низкоскоростное центрифугирование (6 тыс. об/мин, 20 мин), надосадочную жидкость сливают, а вирусный осадок суспендируют в небольшом количестве буферного раствора, содержащего ЭДТА. Следующая стадия очистки – диализ, при котором происходит удаление ионов соли и частичное освобождение от балластных веществ. Для этого диализный мешочек, помещенный в сосуд с водой (3-5 л), наливают суспензию вируса. Сосуд устанавливают на магнитную мешалку, диализ ведут в течение суток с трехкратной сменой диализирующей жидкости. Суспензию центрифугируем при 15-18 тыс. об/мин для удаления нерастворившегося осадка.

9. Концентрирование фитовирусов за допомогою поліетиленгліколя. Дифференціальне центрифугування.

Концентрирование фитовирусов обычно осуществляют с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) или путем высокоскоростного центрифугирования (метод дифференциального центрифугирования). Типичные условия осаждения ПЭГ следующие: для палочковидных вирусов используют 2,5% (вес на объем) ПЭГ и 0,1 М NaCl, а для изометрических вирусов— 10% (вес на объем) ПЭГ в присутствии 0,1 М NaCl; для эффективного осаждения необходимо поддерживать достаточно высокую концентрацию соли. Обычно ПЭГ и соль добавляют к раствору, содержащему вирус, растворяют их в течение часа при постоянном перемешивании и затем собирают осадок вируса высокоскоростным центрифугированием. Для разных вирусов (в зависимости от их размера, физической и химической структуры, молекулярной массы) диапазон центрифугирования, обеспечивающий выпадения вируса в осадок, варьирует от 25 000 до 200 000 g, время ценрифугирования колеблется от нескольких десятков минут до 4-6 ч. Высокоскоростное центрифугирование большинства типичных изометрических вирусов (80—130 S) проводят при 70000 g в течение 3 ч, а большинства палочковидных вирусов (130—180 S)—при 50000 g в течение 2 ч. Осадок вируса ресуспендируют в небольшом растворе буфера (растворение при 0 - +4 ^оС, 4-8 ч на магнитной мешалке) и центрифугируют при умеренном режиме 15-18 тыс. об/мин, осадок промывают, вновь центрифугируют. Растворы, полученные в результате отделения надосадочной жидкости объеденяют и сохраняют. Для повышения степени очистки проводят 3-4 цикла дифференциального центрифугирования.

Для достижения более высоких степеней очистки применяются дополнительные методы, основанные на поверхностных химических свойствах вирусов.