10.6. Биохимические процессы симбиотической азотфиксации.

Известны группы растений, способные за счёт симбиоза с клетками микроорганизмов использовать для синтеза своих азотистых веществ молекулярный азот, который содержится в большом количестве в земной атмосфере. Этот процесс в биологии называют симбиотической азотфиксацией. У данных растений в специальных структурных образованиях на корнях или в листьях осуществляют жизнедеятельность микроорганизмы- симбионты: клубеньковые бактерии, актиномицеты, цианобактерии (синезелёные водоросли).

Большинство растений, способных к симбиотической азотфиксации, образуют на корнях или листьях утолщённые выросты, называемые клубеньками, в которых находятся видоизменённые клетки микроорганизмов- симбионтов. Симбиотические микроорганизмы, находящиеся в клубеньках, питаются растительными метаболитами, которые образуются из поступающих в клубеньки фотоассимилятов, а продукты их жизнедеятельности, синтезируемые за счёт связывания молекулярного азота атмосферы, используются растениями для новообразования своих азотистых веществ.

На корнях многих древесных и кустарниковых растений (ольха, облепиха, восковница и др.) вырастают клубеньки, образуемые актиномицетами. Экспериментально определено, что древесные насаждения ольхи за счёт симбиотической азотфиксации способны связывать в течение одной вегетации до 100 кг/га атмосферного азота. На корнях некоторых австралийских цикадовых растений в качестве симбионтов развиваются цианобактерии, фиксирующие молекулярный азот. У некоторых растений семейств RubiaceaeиHaloragaceaeцианобактерии образуют клубеньки на листьях. На рисовых полях в южных странах разводят водяной папоротникAzolla, в листьях которого осуществляют жизнедеятельность симбиотические азотфиксирующие цианобактерии. За счёт его культивирования рисовые поля обогащаются азотом.

У бобовых растений в клубеньках живут бактерии рода Rhizobium. С их участием бобовые культуры могут фиксировать в год от 50 до 600 кг/га молекулярного азота, практически полностью обеспечивая свои потребности в азотном питании. Кроме того, в результате минерализации пожнивных остатков этих культур происходит существенное обогащение почвы доступным для усвоения последующими культурами азотом. Особенно много азота могут накапливать за счёт симбиотической азотфиксации люцерна (300-500кг/га), клевер (200-300 кг/га), люпин (100-200) кг/га).

Восстановление молекулярного азота в аммиачный катализирует ферментный комплекс нитрогеназы(1.18.2.1), состоящий из двух белков. Один из них, высокомолекулярный, осуществляет непосредственно восстановление молекул азота. Он представляет собой тетрамер, состоящий из двух типов субъединиц, входящих поровну в состав тетрамерного белка (a₂b₂). В каждой молекуле тетрамера содержится два атомаMo, с каждым из которых взаимодействуют три 4Fe4S-кластера, образуя каталитический центр. С ним связываются молекулы азота и подвергаются восстановлению. Белковый компонент нитрогеназы, катализирующий восстановление молекулярного азота, называютMo,Fe-белком.

В составе нитрогеназы содержится также низкомолекулярный белок, состоящий из двух одинаковых полипептидных субъединиц. Он включает в качестве активной группировки 4Fe4S-кластер и выполняет функцию восстановленияMo,Fe-белка посредством переноса электронов от восстановленного ферредоксина. В связи с тем, что низкомолекулярный компонент нитрогеназы содержит железо-серную группировку, его называютFe,S-белком. Следует отметить, что перенос электронов отFe,S-белка наMo,Fe-белок сопряжён с гидролизом АТФ. С помощью молекулярных расчётов определено, что на перенос каждой пары электронов в ферментном комплексе нитрогеназы затрачивается 4-5 молекул АТФ.

Молекулярная масса Fe,S-белка клубеньков бобовых растений составляет~65 тыс.,Mo,Fe-белка – порядка 200 тыс. По-видимому восстановление азота происходит в три стадии. Вначале молекула азота, акцептируя два электрона и два протона, превращается в диимид. Затем к атомам азота диимида в составе ферментного комплекса ещё присоединяются два электрона и два протона с образованием гидразина. На конечной стадии в результате присоединения двух электронов и двух протонов гидразин восстанавливается в аммиачную форму азота, которая высвобождается из ферментного комплекса и далее используется для синтеза аминокислот.

Ключевую роль в восстановлении молекул азота в активном центре нитрогеназы выполняют атомы молибдена. Последовательность восстановительных реакций в активном центре нитрогеназы может быть представлена в виде следующей схемы:

Mo®NºN¬Mo 2ē,2H⁺ 2ē,2H⁺ 2ē,2H⁺

¾® HN⁺= N⁺H ¾® H₂N⁺– N⁺H₂ ¾® Mo Mo + 2NH₃

R | | | | \ /

Mo Mo Mo Mo R

\ / \ /

RR

молекула азота последовательные стадии восстановления

в активном центре молекулярного азота

нитрогеназы

Нитрогеназа, катализирующая симбиотическую азотфиксацию, локализо-вана в клетках клубеньков на корнях или листьях растения-хозяина.

Наиболее хорошо изучен процесс азотфиксации в клубеньках бобовых растений. Бактерии рода Rhizobiumпроникают в ткани коры корней бобового растения и инициируют в них интенсивное деление клеток, что приводит к образованию на корнях утолщений в виде клубеньков. Возникновение клубеньков – результат довольно сложного взаимодействия растения с клубеньковыми бактериями на генетическом и молекулярном уровнях.

Инициаторами такого взаимодействия являются бобовые растения, которые выделяют в ризосферу корней вещества фенольной природы – специфические флавоноиды. Под действием флавоноидов в клетках бактерий инициируется синтез так называемых Nod-факторов, представляющих собою олигосахариды из 3-6 остатков N-ацетилглюкозамина, соединённые через атом азота с радикалом ненасыщенной жирной кислоты (специфичной для каждого вида растений). В свою очередь бактериальные Nod-факторы оказывают воздействие на клетки корневых волосков бобового растения, вызывая деформацию клеточной стенки и плазмалеммы.

В результате взаимодействия мембранных структур растительной и бактериальной клеток формируется особая структура – инфекционная нить, которая проникает в кортикальные клетки коры корня и инициирует там образование мембран, отделяющих бактериальные клетки от цитоплазмы клеток растения, формирующих ткани клубеньков.

Бактериальные клетки в клубеньках увеличиваются в размерах и превращаются в особые структуры, предназначенные для азотфиксации – бактероиды. В бактероидах синтезируются ферментные системы нитрогеназы, электронтранспортной цепи синтеза АТФ, ферменты, катализирующие реакции цикла Кребса, а также осуществляющие транспорт в бактероид растительных метаболитов и выводящие из бактероида в растительную клетку продукты восстановления молекулярного азота. Общая схема функционирования ферментных систем бактероида в клубеньках бобовых растений показана на рисунке .

В бактероидах основной источник электронов и энергии для восстановления молекулярного азота – реакции цикла Кребса, субстратами для которых служат главным образом дикарбоновые кислоты (янтарная и яблочная), поступающие в бактероид из цитоплазмы растительной клетки. Указанные субстраты, питающие бактероид, образуются в клетках клубеньков из фотоассимилятов растения по известным нам механизмам в соответствии со следующей схемой:

Сахароза, поступающая по флоэмной системе

®

Моноса-хариды

®

Глико- лиз

®

Фосфоенолпирови- ноградная кислота

Далее фосфоенолпировиноградная кислота под действием фосфо-енолпируваткарбоксилазыпревращается в щавелевоуксусную кислоту, которая с участиеммалатдегидрогеназывосстанавливается затем в яблочную кислоту:

CH₂CH₂-СООН СН₂-СООН

| | |

CO~(P) + CO₂ + H₂O ¾® CO-COOH ¾¾¾® CHOH-COOH

| ↓щавелевоук-НАД×Н + Н⁺ яблочная кислота

COOHH₃РO₄сусная кислота↘

фосфоенол- НАД⁺

пировиноградная кислота

В мембране, окружающей бактероид, локализованы также ферменты, катализирующие превращение яблочной кислоты в янтарную.

В ходе реакций цикла Кребса, происходящих в бактероиде, синтезируются восстановленные динуклеотиды НАД×Н и ФАД×Н₂, которые служат донорами электронов для электронтранспортной цепи системы окислительного фосфорилирования, обеспечивающей синтез АТФ по такому же механизму, как и в митохондриях. Одновременно из электронтранспортной цепи системы окислительного фосфорилирования через ферредоксин осуществляется вывод электронов наFe,S-белки нитрогеназы, которые сопряжённо с гидролизом АТФ переносят их на активные группировкиMo,Fe-белков.

Часть метаболитов растения, поступающих в бактероиды, превращается в полиэфир b-оксимасляной кислоты, который служит запасным веществом в клетках бактерий и бактероидах клубеньков. Поли-b-оксимасляная кислота откладывается в специальных гранулах и её содержание изменяется в зависимости от процесса азотфиксации. При усилении азотфиксации содержание полиэфираb-оксимасляной кислоты в клубеньках уменьшается, а при ослаблении указанного процесса происходит его накопление.

В связи с тем, что нитрогеназа инактивируется кислородом, клетка бактероида защищена от его проникновения внешней мембраной. Однако в системе окислительного фосфорилирования конечным акцептором электронов служит кислород, который вводится в бактероид в связанном состоянии специальным белком легоглобином. Легоглобины представляют собой гемопротеиды с молекулярной массой 15-16 тыс., которые синтезируются клетками растения-хозяина. Как и гемоглобин крови человека и животных, легоглобин содержит активную группировку в виде протогема, с которой связывается молекулярный кислород, образуя оксилегоглобин. В таком виде обеспечивается транспорт кислорода через мембрану бактероида и передача его на активный центр терминальной оксидазы электронтранспортной цепи бактероида, где кислород акцептирует электроны.

Кроме молекул азота, ферментный комплекс нитрогеназы одновременно восстанавливает также катионы водорода в молекулярный водород в соответствии с реакцией: 2Н⁺+ 2ē¾®Н₂. Поэтому наряду с аммиаком продуктом действия нитрогеназы является также молекулярный водород, при окислении которого у некоторых штаммов клубеньковых бактерий осуществляется дополнительный синтез АТФ, необходимого для азотфиксации. Окисление водорода катализирует ферментгидрогеназа. В опытах показано, что штаммы клубеньковых бактерий, способные к синтезу гидрогеназы, обеспечивают более интенсивную фиксацию молекулярного азота, вследствие чего повышается продуктивность бобовых растений, инфицированных этими видами клубеньковых бактерий.

Для питания бактероида субстратами цикла Кребса используется не только СО₂, фиксированный в процессе фотосинтеза, но и диоксид углерода, поступающий в клубеньки из почвы или выделяющийся как продукт дыхания в клетках клубеньков. Нефотосинтетическую фиксацию СО₂в растительных клетках клубеньков катализирует фермент фосфопируваткарбоксилаза с образованием щавелевоуксусной кислоты. Затем щавелевоуксусная кислота по уже известным нам механизмам превращается в яблочную и янтарную кислоты. За счёт гетеротрофной фиксации СО₂в бактероиды поступает до 25 % углерода, находящегося в составе субстратов цикла Кребса.

Продукт восстановления в бактероидах молекулярного азота – аммиак – транспортируется из бактероида в цитоплазму растительных клеток клубеньков в виде катионов аммония или аланина, который синтезируется аланиндегидрогеназой бактероидов из поступающей в бактероиды пировиноградной кислоты растительного происхождения. В цитоплазме растительных клеток клубеньков локализован фермент глутаминсинтетаза, катализирующий синтез глутамина, а в пластидах – глутаматсинтаза, с участием которой синтезируются молекулы глутаминовой кислоты. Под действием указанных ферментов, а также аминотрансфераз в клубеньках осуществляется синтез транспортных форм азотистых веществ – глутамина и аспарагина, которые далее по транспортной системе растения переносятся в другие органы. У некоторых бобовых (соя, фасоль, вигна) транспортными формами азота служат аллантоин и аллантоиновая кислота, являющиеся продуктами нуклеотидного обмена (см. стр…). Таким образом, бобовые растения, имеющие активные клубеньки, за счёт симбиотической азотфиксации практически полностью обеспечивают свои потребности в восстановленных формах азота. Общая схема биохимических процессов, происходящих в бактероидах, показана на рисунке 40.

Эффективность азотфиксации в клубеньках бобовых растений тесно связана с интенсивностью фотосинтеза. Факторы, влияющие на процессы фотоассимиляции, соответствующим образом влияют и на скорость усвоения растениями молекулярного азота. Особенно заметно снижается симбиотическая азотфиксация у бобовых при недостаточном их питании молибденом и кобальтом. Как мы уже знаем, молибден входит в состав активной группировки Mo,Fe-белка нитрогеназы, а кобальт активирует ферменты в составе клубеньков, имеющие в качестве коферментов коферментные формы витамина В₁₂.

У цианобактерий наблюдаются разные формы симбиоза в зависимости от растения-хозяина. Так, например, цианобактерии из рода Nostocпри симбиозе с водным папоротникомAzollaпроникают в полости листа, увеличиваются в размерах и покрываются плотной оболочкой, превращаясь в способные к азотфиксации структуры – гетероцисты. Восстановленный азот в виде аммонийной формы транспортируется в окружающие гетероцисты клетки листа и включается в обмен азотистых веществ растения.

Цианобактерии этого же вида способны также к симбиозу с цветковыми растениями из рода Gunnera. Они через специальные железы у основания черешков листьев проникают во внутреннюю полость листьев и инфицируют растительные клетки. Внутри растительных клеток цианобактерии превращаются в гетероцисты, способные фиксировать молекулярный азот атмосферы, превращая его в аммонийную форму, которая транспортируется в цитоплазму инфицированных растительных клеток и включается в состав аминокислот и амидов, обеспечивая таким образом растение восстановленными формами азота.

Кроме симбиотических азотфиксаторов, молекулярный азот атмосферы усваивают также некоторые свободноживущие микроорганизмы. К ним относятся аэробные бактерии родов AzotobacterиBeiyerinckia, анаэробные бактерии из родаClostridium, отдельные виды цианобактерий и фотосинтезирующих бактерий. Их вклад в обогащение почвы биологически связанным азотом менее значителен по сравнению с симбиотическими микроорганизмами, при благоприятных условиях ежегодная фиксация ими азота может достигать 30-40 кг/га.

У анаэробных азотфиксаторов источником энергии и электронов для восстановления молекулярного азота служат процессы брожения, у аэробных форм – процесс аэробного дыхания, у фотосинтезирующих бактерий - продукты фотосинтеза. Все они способны синтезировать ферментный комплекс нитрогеназы, катализирующий в их клетках восстановление молекул азота до аммиачной формы. Донором электронов для нитрогеназы служит бактериальный ферредоксин и его молекулярные аналоги. Некоторые виды несимбиотических азотфиксаторов (Azotobacter,Beiyerinckia,Azospirillium,Flavobacterium) обитают на поверхности корней растений, так как в качестве энергетических продуктов используют их корневые выделения. Значительный вклад в обогащение рисовых полей азотом за счёт азотфиксации вносят цианобактерии из родаTolypothrix.

Наряду с выяснением биохимических механизмов процесса азотфиксации у свободноживущих и симбиотических микроорганизмов проводятся также молекулярно-генетические исследования, связанные с направленным воздействием на регуляторную систему синтеза ферментов азотфиксации. Цель таких работ – добиться усиления синтеза нитрогеназы и других ферментов, участвующих в восстановлении и связывании молекулярного азота, и таким образом повысить эффективность биологической фиксации азота атмосферы и его использования сельскохозяйственными растениями. Кроме того, разрабатываются молекулярные подходы переноса генов азотфиксации из клеток микроорганизмов в генотипы растений. Особенно это актуально для злаковых растений, занимающих большой удельный вес среди возделываемых сельскохозяйственных культур. С использованием методов генетической инженерии в различных лабораториях предпринимаются попытки создания таких генотипов злаковых растений, которые подобно бобовым были бы способны усваивать молекулярный азот, содержащийся в земной атмосфере.

Вопросы для повторения:

1. В чём состоит механизм восстановительного аминирования кетокислот, образующихся в реакциях дыхания? 2. Какие реакции катализируют ферменты глутаматсинтаза и аспартатаммиаклиаза? 3. Какое значение в синтезе и превращениях аминокислот имеют реакции переаминирования? 4. Какие продукты образуются в реакциях орнитинового цикла? 5. Каким путём происходит распад аминокислот и превращения продуктов их распада? 6. В ходе каких биохимических реакций осуществляется связывание избыточного аммиака в растительных тканях? 7. Каковы механизмы ассимиляции растениями азота мочевины при некорневых подкормках? 8. Как восстанавливается в растениях нитратная форма азота? 9. При каких условиях происходит накопление нитратов в растительных тканях? 10. Как осуществляется синтез аминокислот при симбиотической азотфиксации? 11. Какие биохимические процессы происходят в бактероидах клубеньков бобовых растений?

Тестовые задания к лекции. Тесты № 193-252.

Лекция 8. Нуклеиновые кислоты, синтез и распад белков.

Аннотация. Рассматривается состав, строение и генетическая роль нуклеиновых кислот. Излагаются принципы передачи генетической информации в ходе репликации ДНК, процессов транскрипции и трансляции. Изучаются механизмы синтеза и распада белков и нуклеотидов, а также ферменты, катализирующие эти процессы.

Ключевые слова: дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), рибонуклиновые кислоты (РНК), рибосомная РНК, матричная РНК, транспортная РНК, правила Чаргаффа, комплементарное строение ДНК, двойная спираль ДНК, нуклеосомы, генетический код, кодоны, репликация ДНК, ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, ДНК-праймазы, ДНК-лигазы, репликативная вилка, промоторы, транскрипция, терминаторы, репрессоры транскрипции, интроны, экзоны, процессинг, сплайсинг, трансляция, инициаторный кодон, терминирующие кодоны, полирибосомы, рибонуклетидредуктазы, рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, нуклеотидазы, ксантиноксидазы, уратоксидазы, протеиназы, пептидазы.

Рассматриваемые вопросы:

7. Строение и функции нуклеиновых кислот.

8. Генетический код.

9. Синтез ДНК.

10. Синтез РНК.

11. Синтез белков и нуклеотидов.

12. Процессы распада нуклеиновых кислот, нуклеотидов и белков.