10.10. Cинтез рнк.
В клетках организмов синтез рибосомной, матричной и транспортной РНК представляет собой первый этап внутриклеточной реализации генетической информации, закодированной в молекулах ДНК, он получил название транскрипции. В ходе транскрипции под действием ферментов РНК-полимераз осуществляется копирование определённых участков нуклеотидных последовательностей ДНК в виде синтезируемых рибонуклеотидных цепей РНК, которые комплементарны ДНК-матрице. При синтезе РНК принцип комплементарности оснований реализуется путём спаривания аденина с урацилом (А У) и гуанина с цитозином (Г Ц). В качестве матрицы для синтеза РНК служит одна из цепей двуспиральной ДНК, которую называют значащей цепью.
Построение полинуклеотидной цепи РНК происходит в результате присоединения к свободным 3'-концам синтезирующейся молекулы РНК 5'-фосфатных групп комплементарных ДНК-матрице остатков рибонуклеотидов, источниками которых в процессе синтеза служат соответствующие рибонуклеозидтрифосфаты. В ходе реакции происходит гидролиз макроэргической связи рибонуклеозидтрифосфата, присоединение рибонуклеотидного остатка 3'-ОН синтезируемой молекулы РНК и высвобождение свободного пироофосфата – Н4Р2О7. При этом у первого нуклеотидного остатка синтезированной цепи РНК на 5'-конце остаётся трифосфатная группировка. Чаще всего инициаторными рибонуклеозидтрифосфатами при синтезе РНК служат АТФ или ГТФ, с 3'-ОН которых далее взаимодействует следующий рибонуклеозидтрифосфат. Образование фосфодиэфирных связей в ходе синтеза РНК можно представить в виде следующей схемы:
Бактериальные РНК-полимеразы построены из двух белковых компонентов: основного фермента, включающего каталитические центры для синтеза РНК, и σ-субъединицы, обеспечивающей правильное присоединение РНК-полимеразы к промотору и отделяющейся от основного фермента после начала синтеза РНК.
Размер σ-субъединицы варьирует у разных бактерий. Синтез генов рибосомных, транспортных и большинства матричных РНК катализируют РНК-полимеразы, включающие главную σ-субъединицу (молекулярная масса у Е.coli»70 тыс.). Однако для транскрипции некоторых генов используются так называемые минорные σ-субъединицы, которые по сравнению с главной σ-субъединицей имеют меньшие размеры и содержатся в клетках в значительно меньшем количестве.
В ядрах клеток высших организмов найдены три вида РНК-полимераз. РНК-полимераза Iкатализирует синтез в ядрышке 18Sи 23Sрибосомной РНК, РНК-полимеразаII– синтезmРНК, РНК-полимеразаIII– синтез тРНК и других низкомолекулярных форм РНК. В каждой молекуле ядерных РНК-полимераз содержатся две большие субъединицы с молекулярными массами 120-220 тыс. и 5-13 малых субъединиц с молекулярными массами 10-100 тыс. Кроме того, в клетках высших организмов синтезируются хлоропластные и митохондриальные РНК-полимеразы. По строению хлоропластные РНК-полимеразы сходны с аналогичными ферментами бактерий. Митохондриальные РНК-полимеразы отличаются по строению и от ядерных, и от бактериальных РНК-полимераз, но они имеют значительное сходство с РНК-полимеразами некоторых бактериофагов.
Минорные σ-субъединицы РНК-полимераз инициируют синтез РНК не с основных промоторов, узнавание которых ферментом происходит в результате присоединения главной σ-субъединицы, а с дополнительных промоторов, дающих начало транскрипции определённых генов, активируемых, как правило, под воздействием факторов окружающей среды. Так, например, у бактерий Е.coliдополнительная σ-субъединица РНК-полимеразы с молекулярной массой 32 тыс. включает транскрипцию генов, активируемых тепловым шоком. У бактерий-азотфиксаторов транскрипция генов, кодирующих глутаминсинтетазу и ферментов азотфиксации, инициируется с участием специальной σ-субъединицы с молекулярной массой 60 тыс. Промоторы для начала транскрипции генов с участием минорных σ-субъединиц отличаются по нуклеотидной последовательности от участков ДНК, занимаемых главными промоторами.
Процесс транскрипции начинается с присоединения фермента РНК-полимеразы к промотору, который представляет собой участок двуспиральной ДНК в самом начале транскриптона. Размер промотора определяется размером молекулы РНК-полимеразы и у бактерий обычно составляет по длине 70-75 нуклеотидных остатков. Присоединяясь к промотору, РНК-полимераза образует комплекс с ДНК, в котором под действием ферментного белка происходит расплетание одного витка двойной спирали ДНК в той части промотора, где находится инициаторный нуклеотидный остаток, дающий начало синтезу рибонуклеотидной цепи РНК. К инициаторному нуклеотидному остатку ДНК комплементарно присоединяется молекула АТФ или ГТФ и далее уже к их 3'-ОН присоединяется следующий нуклеотидный остаток синтезируемой цепи РНК.
Инициаторный нуклеотидный остаток ДНК, дающий начало транскрипции, находится в составе промотора на расстоянии примерно 20-25 нуклеотидных остатков от его внешней границы, направленной по ходу транскрипции. В каждом промоторе содержится определённый набор участков со специфическими последовательностями нуклеотидных остатков, который «узнают» ферменты РНК-полимеразы и только тогда они образуют с промоторами достаточно прочные комплексы, способные к инициации транскрипции.
Стадия инициации транскрипции заканчивается при образовании зачатка нуклеотидной цепи РНК длиной до 3-6 нуклеотидных остатков (в зависимости от типа промотора), который образует со значащей цепью ДНК гибридную спираль и таким образом достаточно прочно удерживается в комплексе фермента с ДНК. Как только заканчивается стадия инициации транскрипции, у бактерий от фермента РНК-полимеразы отделяется σ-субъединица и процесс транскрипции переходит в следующую стадию – стадию элонгации синтезирующейся цепи РНК.
В ходе синтеза РНК РНК-полимераза движется по матрице в направлении от 3'-конца к 5'-концу значащей цепи ДНК, расплетая двойную спираль. В активном центре фермента осуществляется присоединение нуклеотидов к растущей цепи РНК и удерживается гибридный участок двойной спирали ДНК-РНК длиной примерно 12 нуклеотидных остатков. Позади фермента восстанавливается двойная спираль ДНК и одновременно из каталитического центра фермента высвобождается участок синтезируемой цепи РНК (рис. 47).
На скорость движения по ДНК-матрице РНК-полимеразы оказывает влияние степень спирализации ДНК. При увеличении отрицательной сверхспирализации ДНК скорость движения РНК-полимеразы по матрице и, следовательно, скорость синтеза РНК возрастает, так как в этом случае облегчается процесс расплетания ДНК.
У бактерий синтез РНК заканчивается при достижении РНК-полимеразой участка ДНК, называемого терминатором. В нём содержится ГЦ-богатая последовательность, вслед за которой в значащей нити ДНК по ходу транскрипции следует последовательность из 4-8 повторяющихся остатков адениловой кислоты (поли-А). Транскрипция прекращается на конце участка поли-А или сразу же за ним. В результате транскрибирования участка ДНК с повторяющимися ГЦ-парами нуклеотидов синтезируется последовательность нуклеотидов РНК, обладающая способностью к формированию двойной спирали в форме «шпильки», которая разрушает большую часть гибридной двойной спирали ДНК-РНК, что ослабляет связь синтезированной цепи РНК с ДНК-матрицей и приводит к высвобождению РНК из ферментного комплекса РНК-полимеразы (рис. 48). После этого происходит отделение от ДНК-матрицы и самого фермента РНК-полимеразы. После соединения с σ-субъединицей ферментная молекула может снова взаимодействовать с промотором и катализировать синтез новой молекулы РНК.
Изучение процесса терминации транскрипции генов у высших организмов с участием РНК-полимеразы IIпоказало, что на 3'-концах синтезируемых полинуклеотидных цепейmРНК имеется специфическая последовательность ААУААА, которая предшествует 3'-концевой последовательности поли-А и во время синтеза является специфическим сигналом к полиаденилированию 3'-концаmРНК.
Синтез РНК является первым этапом реализации в организме генетической информации, который далее инициирует синтез белков и прежде всего белков-ферментов, катализирующих ту или иную жизненно важную биохимическую реакцию. Если в конкретных физиологических условиях потребности в данном ферменте нет, то и нет необходимости организму осуществлять синтез соответствующей mРНК. Поэтому синтез многихmРНК в клетках организмов подвержен регуляции, которая осуществляется как на стадии инициации транскрипции, так и в процессе транскрипции.
На стадии инициации транскрипции регуляторное воздействие оказывают специфические белки, которые, присоединяясь к определённым участкам ДНК, останавливают или, наоборот, активируют действие фермента РНК-полимеразы. Белки-регуляторы, подавляющие действие РНК-полимеразы, называют репрессорами, а усиливающие действие этого ферментаактиваторами транскрипции. Участок ДНК, с которым связывается белок-регулятор, у бактерий называют оператором, у высших организмов – регуляторным элементом гена. Способность регуляторных белков связываться с ДНК зависит от низкомолекулярных веществ –эффекторов. Эффекторы, соединяясь с регуляторными белками, вызывают аллостерическое изменение их структуры, вследствие чего изменяется сродство белка-регулятора к регуляторному участку ДНК.
Различают два вида белков-репрессоров транскрипции. Одни из них оказывают репрессирующее действие на промоторы в отсутствии эффектора, а при взаимодействии с эффектором теряют сродство к своему регуляторному участку и таким образом инициируют процесс транскрипции. Белки-репрессоры второго типа способны присоединяться к ДНК и ингибировать транскрипцию только в комплексе с эффектором. В отсутствии эффектора белок-репрессор неактивен и в таких условиях РНК-полимераза может взаимодействовать с промотором и осуществлять синтез mРНК.
Наиболее эффективный механизм репрессии транскрипции реализуется в том случае, когда участок связывания белка-репрессора находится на промоторе. Присоединившись к определённому участку промотора, репрессорный белок препятствует присоединению к промотору РНК-полимеразы. Действие белков-активаторов транскрипции очень часто заключается в том, что такой белок присоединяется к регуляторному участку ДНК, непосредственно прилегающему к промотору, и, взаимодействуя с РНК-полимеразой, переводит этот фермент в активное состояние.
Впервые принципы регуляции транскрипции бактериальных генов были сформулированы в 1961 г. Ф. Жакобом и Ж. Моно на основе изучения системы регуляции в клетках Е.coliсинтеза ферментаb-галактозидазы, катализирующего гидролитическое расщепление лактозы до глюкозы и галактозы. Синтез этого фермента происходит, когда в питательной среде нет глюкозы, но присутствует лактоза. Кроме гена, кодирующегоb-галактозидазу, в состав лактозного оперона, также входят ген пермеазы, обеспечивающий транспорт лактозы в бактериальную клетку, и ген тиогалактозидтрансацетилазы, не участвующей в усвоении клеткой лактозы. Все три гена копируются в виде одногоmРНК-транскрипта.
В отсутствии лактозы транскрипция лактозного оперона подавлена белком-репрессором, который связывается с оператором, находящимся рядом с промотором,и препятствует РНК-полимеразе начать синтез mРНКb-галактозидазы и других ферментных белков. Структура белка-репрессора кодируется специальным геном. Репрессор образует с операторным участком (длиной 24 нуклеотидных остатка) достаточно прочный комплекс и для поддержания его в устойчивом состоянии достаточно 10 молекул репрессорного белка в расчёте на одну клетку.
При появлении в питательной среде лактозы оно частично превращается в свой изомер аллолактозу, которая служит эффектором, образующим комплекс с белком-репрессором, переводя его в неактивное состояние по отношению к оператору. В таком состоянии он уже не препятствует РНК-полимеразе связываться с промотором и начинать транскрипцию, образуя mРНКb-галактозидазы и пермеазы. Далее уже с участиемmРНК осуществляется синтез указанных ферментных белков. Под действием эффектора синтез ферментов возрастает примерно в 1000 раз и поддерживается на таком уровне, пока в питательной среде содержится лактоза.
При снижении концентрации лактозы в питательной среде белок-репрессор снова присоединяется к оператору и останавливает транскрипцию лактозного оперона. А все синтезированные молекулы mРНК быстро расщепляются под действием рибонуклеазы до нуклеотидов. Как было указано ранее, время полужизниmРНК у прокариот составляет несколько минут.
Лактозный оперон Е. coliтакже контролируется другим регуляторным белком – белком-активатором катаболитных оперонов (БАК), который функционирует совместно с циклическим АМФ (цАМФ) и его действие зависит от концентрации в питательной среде оптимального источника углерода для бактерий – глюкозы. В присутствии глюкозы концентрация цАМФ понижается, а в её отсутствие – повышается.
Комплекс БАК с цАМФ присоединяется к своему оператору, который непосредственно прилегает к промоторному участку. Под воздействием БАК инициируется связывание с промотором РНК-полимеразы, катализирующей далее синтез mРНКb-галактозидазы и пермеазы. Однако такой синтез возможен только в том случае, когда под действием лактозы инактивирован белок-репрессор. Таким образом, активная транскрипция лактозного оперона бактерий происходит при снижении в питательной среде концентрации глюкозы, повышающей концентрацию цАМФ, и при наличии достаточного количества лактозы. Образующийся цАМФ активирует БАК, который связывается со своим опероном и инициирует действие фермента РНК-полимеразы, а лактоза, превращаясь в аллолактозу, инактивирует белок-репрессор, подавляющий транскрипцию генов лактозного оперона. Схематически функционирование лактозного опреона Еcoliпредставлено на рисунке 49 .
Как мы видим, в регуляции транскрипции лактозного оперона бактерий участвуют регуляторные белки – белок репрессор и БАК, которые кодируются генами, образующими свои опероны. И транскрипция этих оперонов управляется системой регуляции, включающей определённые белки.
К системе регуляции транскрипции относятся также терминаторы, находящиеся не в конце оперонов, а в их начале между промотором и нуклеотидным остатком, с которого начинается транскрипция структурных генов, или даже внутри структурных генов, кодирующих белковые полипептиды. После прохождения нуклеотидной последовательности такого терминатора РНК-полимеразой в синтезирующейся цепи РНК может образовываться терминаторная или антитерминаторная шпилька. Если возникает терминаторная шпилька, синтез РНК прекращается, если антитерминаторная – терминация транскрипции не происходит и синтез РНК продолжается.
У высших организмов регуляция транскрипции генов включает дополнительные регуляторные последовательности, которые локализованы в промоторах, в составе нуклеотидных последовательностей между промотором и структурным геном, а также внутри структурных генов в составе интронов–участков ДНК, не кодирующих полипептиды. К указанным регуляторным последовательностям присоединяются специфические белки, которые, взаимодействуя с РНК-полимеразой, активируют действие этого фермента или, наоборот, прекращают транскрипцию.
В транскриптонах высших организмов значительно сложнее структурная организация промоторов. Транскрипция генов, катализируемая РНК-полимеразой II, начинается на ДНК с инициаторной последовательности нуклеотидных остатков ТЦ (А,G)А. Этому участку на расстоянии 40-120 н.о. предшествует ТАТА-последовательность. Кроме того, в промоторной зоне обычно находятся повторяющиеся элементы так называемых активирующих последовательностей (АП), к которым присоединяются регуляторные белки, инициирующие действие фермента РНК-полимеразыII. При этом общая длина промоторной зоны может составлять 200-300 нуклеотидных остатков.
Синтезированные в ходе транскрипции молекулы всех видов РНК подвергаются направленному воздействию ряда ферментов, которые осуществляют превращение РНК-предшественников в функционально активные молекулы РНК, способные выполнять свойственные им биологические функции. Превращение РНК-транскриптов в функционально активные молекулы РНК получило название процессинга. В клетках высших организмов процессинг РНК происходит в ядре.
Образующиеся в ходе транскрипции ядерные предшественники mРНК связываются с ядерными белками, формируя рибонуклеопротеидные комплексы, которые далее включаются в процессинг. Особенность процессинга у эукариот заключается в том, что ихmРНК-транскрипты состоят из участков, которые входят в состав функционально активных (зрелых)mРНК, и участков, подлежащих удалению в результате процессинга. Участки mРНК-транскрипта, входящие в состав зрелыхmРНК, называютэкзонами, а удаляемые в ходе процессинга фрагментыmРНК-транскрипта –интронами. Таким образом, гены высших организмов представляют собой определённую последовательность чередующихся экзонов и интронов (рис. 50).
Экзоны включают участки mРНК- транскриптов, кодирующие первичную структуру полипептидов, участки на 5'-конце, содержащие нуклеотидные последовательности промоторов и прилегающие к промоторам регуляторные последовательности, с которыми связываются регуляторные белки. Кроме того, в состав экзонов входят участки на 3'-концеmРНК-транскрипта между терминатором и поли-А последовательностью.
Интроны представляют собой участки mРНК-транскрипта, не кодирующие структуру белков, но они могут включать важные регуляторные последовательности, участвующие в регуляции транскрипции. Число интронов в составе эукариотических генов варьирует от одного до нескольких десятков и их общая длина может во много раз превышать длину экзонов.
Каждый экзон в структуре гена кодирует определённый участок в белковой молекуле длиной 40-50 аминокислотных остатков, который представляет собой отдельный функциональный элемент третичной структуры полипептида (относительно автономный участок белковой молекулы). Из таких элементов в целом и состоит белковая молекула. Если в двух разных белках содержится одинаковая структура, то она кодируется одним и тем же экзоном. Путём повторения и перекомбинации экзонов обеспечивается генетический механизм построения простран-ственной структуры белков из небольших автономных единиц, представляющих собой отдельные самостоятельные элементы вторичной и третичной структуры составляющих белки полипептидов.
В ходе процессинга происходит удаление из структуры mРНК-транскрипта с помощью ферментов интронов, а экзоны соединяются в определённой последовательности, образуя функционально активнуюmРНК. Процесс соединения экзонов в функционально активнуюmРНК получил названиесплайсинга. Процессинг и сплайсингmРНК представляют собой единый процесс образования зрелыхmРНК, способных участвовать в синтезе белков. Активную роль в процессе сплайсинга выполняют специфические ядерные белки, а также малые ядерные РНК, синтез которых, как иmРНК, катализируют РНК-полимеразыII. Эти РНК содержат много остатков уридиловой кислоты и имеют длину от 90 до 140 нуклеотидных остатков.
В бактериальных клетках большая часть mРНК, синтезируемой в ходе транскрипции, не подвергается процессингу. Однако синтез функционально активных молекул рРНК и тРНК включает пост-транскрипционные изменения, то есть транскрипты рРНК и тРНК бактерий проходят через механизм процессинга.
В клетках высших организмов 28S, 18S- и 5S-РНК синтезируются в виде одного высокомолекулярного транскрипта, из которого они выщепляются в ходе процессинга. Образуемые в ядрах клеток высших организмов предшественники тРНК содержат интрон, включающий последовательность из 14-16 нуклеотидных остатков, которые следуют через один нуклеотидный остаток за 3'-концом антикодона. Молекула предшественника расщепляется эндонуклеазой, а образующиеся полинуклеотидные фрагменты экзонов фосфорилируются и соединяются фосфодиэфирной связью под действием специфической лигазы.