Методичка по иммунологическим препаратам

противоопухолевую, противовирусную активность и продукцию антител. Применяют для лечения тяжелых вирусных инфекций, первичных и вторичных иммунодефицитных состояний, при нарушении Т-звена иммунитета.

4.2.Миелопид (В-активин) – низкомолекулярный пептид, выделенный из костномозговых клеток. Активирует В-лимфоциты, увеличивает их число, стимулирует синтез антител. Обладает анальгетическим эффектом. Применяется для лечения вторичных иммунодефицитных состояний при нарушении В-звена иммунитета.

4.3.БЦЖ вакцина (торговое название в РФ – Вакцина БЦЖ [Имурон]). Показания к применению – туберкулез.

4.4.Пидотимод (торговое название в РФ – Имунорикс). Показания к применению – респираторные инфекции.

4.5.Глатирамер ацетат (торговое название в РФ – Копаксон Тева). Показания к применению – рассеянный склероз.

4.6.Гистамина дигидрохлорид (торговое название в РФ – Гистамин). Показаниями к применению являются различные онкологические заболевания; миелолейкоз.

4.7.Арбидол – проявляет интерферониндуцирующую и иммуномодулирующую активность, стимулирует гуморальные и клеточные реакции иммунитета, фагоцитарную активность макрофагов. Применяют для профилактики и лечения гриппа и других ОРВИ, рецидивирующей герпетической инфекции; для профилактики инфекционных осложнений и нормализации иммунного статуса в послеоперационном периоде.

Характеристика интерферонов:

Природные интерфероны – низкомолекулярные белки, синтезируемые различными клетками организма. Важнейшие функции интерферонов: противоопухолевая, антивирусная, иммуномодулирующая. Препараты интерферонов получают путем индукции их синтеза клетками иммунной системы, лейкоцитами крови или фибробластами. Индукторами синтеза (интерфероногенами) служат слабопатогенные вирусы, двуспиральные РНК, ЛПС бактерий, природные и синтетические соединения.

Интерфероны обладают видотканевой специфичностью, то есть активны только в организме того биологического вида, в котором синтезированы. По отношению к вирусам интерфероны не

69

специфичны и поэтому обладают широким диапазоном антивирусной активности. Основной механизм антивирусного действия заключается в индукции синтеза ферментов, нарушающих репликацию вирусов и подавляющих синтез вирусных белков.

Типы природных интерферонов:

I тип:

–ИФНα – синтезируемый лейкоцитами периферической крови под действием вируса-интерфероногена. Содержит – интерферон, интерлейкин-1, фактор некроза опухолей. Активирует CD4 клетки. Применяют для лечения вирусных инфекций (ОРВИ, герпес, корь, гепатиты). Антивирусную активность интерферона определяют в Международных единицах (МЕ). Количество интерферона, которое ингибирует репродукцию вируса на 50 % – 1 МЕ.

–ИФНβ – синтезируется фибробластами; применяют для лечения вирусных инфекций и аутоиммунных заболеваний.

II тип:

–ИФНγ – продукт стимулированных Т-лимфоцитов (CD4) и NK-клеток (иммунный интерферон). Активирует NK-клетки, Т- лимфоциты-киллеры, макрофаги, проявляющие АТ-зависимую цитотоксичность, усиливает экспрессию АГ I и II классов гистосовместимости. Применяют как иммуномодулятор у онкобольных и больных некоторыми формами иммунодефицитных состояний.

Рекомбинантные интерфероны получают путем введения функционирующего ИФН-гена клеток человека в геном бактерий (E. coli) или геном дрожжевой клетки. После экспрессии ИФН-гена и синтеза интерферона препарат подвергается сложной очистке, иногда

–лиофильному высушиванию. Выпускают рекомбинантные α- интерферон(ы) – (роферон, реферон А, виферон, КИП-ферон и др.); β- интерферон – бетафероны и γ-интерферон – гаммафероны. Гаммафероны имеют активный иммунотропный эффект, стимулируют NK-клетки, фагоцитоз, ингибируют синтез IgE, аутоантител, гиперчувствительность замедленного типа.

Рекомбинантные интерфероны выпускают в ампулах для парентерального применения. Используют для лечения тяжелых вирусных инфекций – гепатитов В, С, Д; ВИЧ-инфекции, генерализованной герпетической инфекции, ОРВИ, онкозаболеваний и иммунодефицитных состояний.

70

5.3. Индукторы интерферона

Интерфероногены (ИФГ) – вещества, различные по происхождению и химической структуре, способные вызывать синтез интерферонов I типа. Важнейшим свойством ИФГ является широкий диапазон противовирусной активности. Интерфероногены обладают также противоопухолевым, иммуномодулирующим и противовоспалительным действием.

Классификация (Ершов Ф. И., 1998): А. Синтетические соединения

1.Низкомолекулярные (ароматические углеводороды): Флуореноны – препарат Амиксин.

Акриданоны – препарат Циклоферон.

2.Полимеры (дсРНК):

Препарат Полудан. Препарат Полигуацил. Препарат Амплиген.

Б. Природные соединения

1.Низкомолекулярные:

Полифенолы (производные госсипола) – препараты Мегасин, Кагоцел, Саврац, Зогасин, Гозалидон.

2. Двуспиральные РНК – препараты Ларифан, Ридостин.

71

ЧАСТЬ 4. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ

И НЕИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Глава 6. Диагностические иммунные сыворотки и иммуноглобулины

Диагностические сыворотки – это иммунные сыворотки, которые применяют в различных серологических реакциях для идентификации инфекционных (определение родовой, видовой, типовой принадлежности) и неинфекционных антигенов. Применяются данные сыворотки исключительно для диагностических целей. Приготовление диагностических сывороток в принципе не отличается от приготовления лечебно-диагностических сывороток – их также получают путем гипериммунизации, но только животных.

В зависимости от характера антигена, послужившего для иммунизации, в сыворотках накапливаются агглютинирующие, преципитирующие,лизирующие,нейтрализующиеидругиевидыантител.

6.1. Агглютинирующие сыворотки для постановки реакции агглютинации (РА)

Агглютинирующие сыворотки содержат антитела-агглютинины, используются в реакциях агглютинации с целью сероидентификации возбудителя. Готовят сыворотки из крови кроликов, баранов, ослов, лошадей, иммунизируя их корпускулярными антигенами. Наиболее свободными от неспецифических антител являются сыворотки кроликов. Лучшие результаты получаются при применении для иммунизации взвесей из живых или убитых микробов.

Иммунизацию проводят путем введения антигена в краевую ушную вену кролика, начиная с 500 млн микробных тел в 1 мл и увеличивая дозу вдвое при последующих введениях. Для получения полноценных сывороток обычно бывает достаточно 3–4 инъекций с интервалами в 5 дней. На 5–7 день после 3-й иммунизации берется проба крови и проверяется титр сыворотки.

Титром агглютинирующей сыворотки считается наибольшее её разведение, способное вызвать видимую агглютинацию (склеивание) бактерий.

72

Институтами вакцин и сывороток в зависимости от степени очистки выпускаются адсорбированные и неадсорбированные

сыворотки. При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции антител по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки групповые антитела при сохранении в ней типоспецифических или видовых антител.

Адсорбированные сыворотки содержат антитела, соответствующие определенным типовым или видовым антигенам. Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки, кроме антител к видовым или типовым антигенам, содержат еще и групповые антитела, дающие агглютинацию родственных видов бактерий, в клетках которых находится часть идентичных антигенов.

Адсорбированные агглютинирующие сыворотки выпускаются как поливалентными (могут давать реакцию агглютинации с 2–3 родственными бактериями, имеющими общий антиген), так и монорецепторными, которые содержат антитела только к одному антигену.

Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применяются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae (сальмонеллами, шигеллами, патогенными эшерихиями, протеями, цитробактерами и другими родами).

Так, при дифференциации сальмонелл используется набор сывороток:

–агглютинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная сыворотка групп А, В, С, D, Е для определения принадлежности к роду Salmonella;

–монорецепторная О-сыворотка для определения серологической группы;

–монорецепторная Н-сыворотка для определения серологического типа (варианта).

В настоящее время для окончательной серологической идентификации эшерихий выпускаются диагностические эшерихиозные ОК сухие иммуноглобулины, полученные при осаждении риванолом фракции иммуноглобулинов из нативной сыворотки кроликов, гипериммунизированных корпускулярными антигенами. Используются

вреакции агглютинациина стеклебез разведения.

73

Примеры агглютинирующих сывороток:
– Адсорбированная	поливалентная	агглютинирующая
сальмонеллезная сыворотка групп АВСДЕ.
– Адсорбированная	агглютинирующая	сальмонеллезная
сыворотка О, рецептор 4.
– Адсорбированная	агглютинирующая	ОК-сыворотка –
к соответствующим антигенам E. coli и др.
6.2. Антиглобулиновая сыворотка для пробы Кумбса
АГС для реакции	Кумбса содержит бивалентные антитела

(полные, с двумя активными центрами) против так называемых неполных антител, неполные антитела являются моновалентными, то есть содержат один активный центр. При соединении с эпитопами антигена не образуются крупные комплексы, способные выпадать в осадок, то есть давать определенный визуальный эффект.

АГС, получаемая путем иммунизации кролика гаммаглобулинами сыворотки человека, содержит бивалентные антитела, способные связывать моновалентные антитела. Таким образом, будет визуально наблюдаться реакция агглютинации или гемагглютинации. Например, АГС используется для выявления в сыворотке неполных антител к резус-фактору.

6.3. Преципитирующие сыворотки для постановки реакции преципитации (РП)

Преципитирующие сыворотки содержат антитела (преципитины) к мелкодисперсным антигенам и широко используются для идентификации антигена при диагностике инфекционных заболеваний (сибирской язвы, чумы), при определении типовой принадлежности стрептококковый инфекций, эпидемического цереброспинального менингита, в судебно-медицинской практике для определения видовой принадлежности белка крови, в санитарной практике для обнаружения соответствующих белковых веществ, фальсификации пищевых продуктов.

Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов мелкодисперсными молекулярными антигенами (очищенные белковые антигенные фракции, токсины и т. д.).

74

Титром преципитирующей сыворотки называется то максимальное разведение антигена, которое преципитируется цельной сывороткой. Выпускают диагностические преципитирующие сыворотки с титром не меньше 1 : 100 000. Это связано с тем, что антиген, определяемый в реакции преципитации, имеет молекулярную дисперсность и из-за этого громадную суммарную поверхность, для покрытия которой нужно очень много антител.

Реакция преципитации может быть поставлена в виде кольцеили термопреципитации, преципитации в геле, реакции флоккуляции, иммуноэлектрофореза.

6.4. Гемолитическая сыворотка и комплемент для постановки реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (РСК)

Гемолитическая сыворотка содержит антитела (гемолизины), которые, соединяясь с антигеном (эритроцитом), активируют комплемент по классическому пути, что приводит к лизису эритроцитов. Эта сыворотка является составной частью гемолитической (индикаторной) системы, применяемой в РСК.

Гемолитическую сыворотку получают путем 3–4-кратной иммунизации кроликов взвесью эритроцитов барана с интервалом в

2–3 дня.

Титром гемолитической сыворотки называется то ее максимальное разведение, которое в объеме 0,5 мл в присутствии комплемента вызывает гемолиз 0,5 мл 3 %-ной взвеси эритроцитов барана в течение часа при 37 °С. Титр должен быть не ниже 1 : 1200 – 1 : 1500.

Комплемент – это совокупность нескольких нормальных компонентов свежей сыворотки с различными физико-химическими свойствами. Он содержится в большинстве сывороток теплокровных и холоднокровных животных. Комплементарная функция выражена наиболее интенсивно в сыворотке морских свинок, поэтому они и служат донорами комплемента в лабораториях.

Основным свойством комплемента является его способность вызывать лизис сенсибилизированных соответствующими иммунными сыворотками клеток, а также адсорбироваться системами антиген + антитело.

Комплемент широко применяется для серологической диагностики ряда инфекционных заболеваний в реакции связывания

75

комплемента (сифилис, гонорея, бруцеллез, туляремия, риккетсиозы, грипп, клещевой энцефалит и др.).

Учитывая чрезвычайную лабильность некоторых компонентов комплемента, для постановки РСК выбирают оптимальную дозу комплемента. Для этого производят его титрование в присутствии гемолитической системы. Титр комплемента – минимальная его концентрация, обеспечивающая полный лизис 3 %-ной взвеси бараньих эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочая доза комплемента увеличивается по сравнению с титром на 25–30 %. Избыток или недостаток комплемента могут значительно исказить результаты РСК.

В настоящее время производят сухой консервированный комплемент.

6.5. Иммунные антивирусные сыворотки

Иммунные антивирусные сыворотки получают из крови гипериммунизированных животных. Они предназначены для идентификации и типирования вирусов в реакциях: нейтрализации вирусов, торможения гемагглютинации, РСК, преципитации в геле, иммуноэлектрофореза, иммунофлюоресценции.

Животных для иммунизации выбирают с учетом свойств вирусов. При этом животные должны быть свободны от каких-либо патогенных вирусов, так как их присутствие может повлиять на результат серологических реакций. Наилучшими продуцентами противогриппозных сывороток являются куры, морские свинки, хорьки; аденовирусных – кролики; энтеровирусных – кролики, морские свинки, обезьяны; противоэнцефалитных – белые мыши.

Антигенами для иммунизации животных могут быть как вирусные вакцины, так и свежевыделенные штаммы вирусов.

Антивирусные диагностические сыворотки выпускаются двух видов:

–поливалентные, позволяющие установить к какой группе (семейству) относятся идентифицируемые вирусы;

–типоспецифические, содержащиеантитела к одному типувируса. Выпускаются антивирусные сыворотки в сухом виде и перед

употреблением растворяются дистиллированной водой соответственно высушенному объёму. Сыворотки, разведенные стерильно, можно сохранять в замороженном виде несколько месяцев.

76

Выбор серологической реакции для типирования вируса или его антигенов производят с учетом биологических свойств вируса.

6.6. Диагностические сыворотки, содержащие меченые антитела

Серологические реакции с использованием метки позволяют быстро получить результаты, как правило, отличаются высокой чувствительностью и находят широкое применение для экспрессдиагностики вирусных и бактериальных инфекций.

Данные сыворотки широко применяются для постановки реакций ИФА (иммуноферментного анализа); РИФ (реакции иммунофлюоресценции); РИА (радиоиммунного анализа).

В качестве метки для антител соответственно используются:

ферменты для ИФА; флюорохромы и металлы лантаноидной

группы – для РИФ; изотопы – для РИА; ферритин – для иммунноэлектронной микроскопии.

Меченые сыворотки выпускаются 2 разновидностей:

–антимикробные меченые сыворотки, содержащие антитела против определенных видов бактерий, вирусов, риккетсий, хламидий;

–антиглобулиновые меченые сыворотки, содержащие антитела против гамма-глобулинов крови человека или животных.

6.6.1. Меченые флюорохромом сыворотки для постановки рекции иммунофлюоресценции (РИФ)

РИФ основана на использовании флюоресцеинизотиоцианата – ФИТЦ или других флюорохромов, химически связанных, конъюгированных с АТ. При этом меченые АТ сохраняют иммунологическую специфичность и вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными АГ. Комплексы АГ с мечеными АТ можно легко определить по интенсивному желтозеленому свечению при изучении препарата в люминесцентном микроскопе.

Разновидности РИФ:

–прямой метод Кунса;

–непрямой метод Кунса;

–антикомплементарный метод.

77

Впрямом методе Кунса используются флюоресцирующие антисыворотки против определенных видов бактерий, вирусов, риккетсий и хламидий. В этом методе на предметном стекле с антигеном (мазок из исследуемой культуры, фиксированный чаще ацетоном) соединяется меченая антимикробная сыворотка, выдерживается во влажной камере 30 минут при 25 ºС градусах по Цельсию, после чего препарат 10 минут при 25 ºС промывают солевым буферным раствором. Образовавшийся комплекс антиген + антитело выявляется в люминесцентном микроскопе по яркому свечению.

Внепрямом методе Кунса сначала на предметном стекле с антигеном соединяется немеченая диагностическая сыворотка во влажной камере 30 минут, а затем с ней соединяется антиглобулиновая против гамма-глобулинов того вида животного, на котором была получена немеченая сыворотка (АГС), меченая флюорохромом в таких же условиях. Результат наблюдается как и при прямом методе в люминесцентном микроскопе.

Непрямой вариант РИФ можно использовать не только для изучения АГ, но и для определения количества АТ в иммунной сыворотке.

Антикомплементарная РИФ предполагает применение меченых антител против комплемента морской свинки. Используется

втех случаях, когда комплекс АГ-АТ способен фиксировать комплемент. Добавление к такой системе антикомплементарной меченой сыворотки позволяет выявлять АГ по специфическому свечению в люминесцентном микроскопе.

Приготовленные препараты высушивают с помощью фильтровальной бумаги и изучают в люминесцентном микроскопе сначала при помощи объектива с увеличением в 40 раз (×40), а затем, поместив на препарат каплю нефлюоресцирующего масла, с помощью иммерсионного объектива ×90.

Достоинством непрямой и антикомплементарной РИФ является использование лишь одной светящейся сыворотки (антивидовой или антикомплементарной) при изучении различных АГ, что значительно упрощает и удешевляет реакцию.

78