Методичка по иммунологическим препаратам

6.6.2. Иммунофлюоресцирующие сыворотки

Содержат иммуноглобулины, к которым посредством прочной химической связи присоединен флюорохром. При этом флюоресцирующие антитела сохраняют – способность взаимодействовать со специфическим антигеном, а флюорохром способность к свечению. Образовавшийся комплекс обнаруживается в люминесцентном микроскопе.

Этапы приготовления:

–выбор животных-продуцентов;

–выбор антигена;

–гипериммунизация животных по определенной схеме;

–выделение из нативной сыворотки глобулинов;

–освобождение иммуноглобулинов от солей;

–маркирование специфических антител флюорохромом;

–стандартизация готовых сывороток.

Примеры сывороток:

–Антисыворотка для прямого Кунса – содержит флюоресцирующие антитела к антигенам определенного вида бактерий, риккетсий, вирусов, используют для сероидентификации выделенного возбудителя. Сейчас широко используются флюоресцирующие брюшнотифозные, дизентерийная, коли- и сибиреязвенная, чумная, холерная, туляремийная, бруцеллезная, риккетсиозные и некоторые вирусные антисыворотки.

–Антисыворотки для непрямого метода Кунса – АГС

(антиглобулиновые сыворотки), содержащие флюоресцирующие АТ

кдиагностическим сывороткам, применяются для изучения и выявления бактериальных и вирусных антигенов, для обнаружения и титрования антител к ним, в диагностике неинфекционной патологии, для выявления соотношения различных классов иммуноглобулинов при аутоиммунных заболеваниях.

–Антикомплементарная (против глобулинов морской свинки)

меченая сыворотка – содержит флюоресциирующие антитела к комплементу морской свинки.

79

6.6.3. Меченные ферритином сыворотки для постановки иммунной электронной микроскопии (ИЭМ)

Ферритин – белок, содержащий до 23 % железа, хорошо контрастирующий и поэтому применяющийся в качестве метки. После обработки мечеными АТ изучаемых объектов (вирусов, бактерий, срезов инфицированных клеток) они становятся электронноплотными и могут быть выявлены при электронной микроскопии. Чаще всего эта реакция применяется в вирусологии.

6.6.4. Меченые ферментом сыворотки для постановки иммуноферментного анализа (ИФА)

Метод основан на использовании в качестве метки АТ ферментов, способных разлагать субстрат и приводить к образованию окрашенных продуктов.

Наиболее распространенный вариант ИФА – твердофазный, когда антиген либо антитело фиксированы на твердом носителе, например, в лунках планшеток из полистирола. Например, для выявления антигена в прямом методе ИФА на стенках лунок фиксируют антимикробные антитела. Если искомый антиген присоединяется к антителам, то он также оказывается фиксированным. После инкубации и отмывки связавшийся антиген выявляют с помощью меченых антимикробных антител.

Конъюгированные с ферментом АТ сохраняют способность соединяться с гомологичным АГ. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ.

Для проведения твердофазной ИФА необходимы полистироловые планшеты, имеющие лунки с плоским дном и автоматические пипетки. Для количественного учета используют спектрофотометр – регистратор экстинции при длине волны 492 нм. ИФА характеризуется весьма высокой чувствительностью и быстротой получения результатов (в течение 4-6 часов). Каждое разведение ставят параллельно в двух лунках.

Наиболее распространенными ферментами-метками являются

пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Препараты из меченых антител называют конъюгатами. После соединения конъюгата с антигеном в смесь добавляют субстрат (Н2О2 или фосфатид) и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом (Н2О2 пероксидазой с

80

образованием активного кислорода, который окисляет хромоген) и изменяет цвет продукта реакции (например, с прозрачного до желтого, если хромоген ортофенилендиамин, или коричневого – если хромоген аминосалициловая кислота) разной степени интенсивности. Эта интенсивность может учитываться с помощью специальных приборов (фотоэлектроколориметры) или визуально. Применяются также автоматические анализаторы (ридеры).

При определении в ИФА антител (например, серодиагностика ВИЧ-инфекции) на носителе фиксируют известные антигены – непрямой метод ИФА. Затем вносится исследуемая сыворотка. Для выявления образовавшихся комплексов антиген + антитело вносится

антиглобулиновая сыворотка, меченая ферментом. Обязательно несвязанный конъюгат трижды отмывают буфером. Затем в лунку вносят 0,1 мл смеси раствора субстрата и хромогена и выдерживают 30 минут. В процессе инкубации пероксидаза разрушает субстрат (Н2О2) с образованием активного кислорода, который окисляет хромоген. В результате хромоген меняет цвет.

Конъюгаты. Содержат иммуноглобулины, в которых посредством прочной химической связи присоединен фермент (пероксидаза или фосфатаза). При этом антитела сохраняют свою способность взаимодействовать со специфическим антигеном, а фермент – вступать в реакцию с субстратом и окислять хромоген. Для получения АТ, конъюгированных ферментом, необходимы высокоактивные преципитирующие сыворотки против АГ или против глобулинов животных или человека, из которых выделяют гаммаглобулиновую фракцию. Иммуноглобулины конъюгируют с ферментом при помощи глютаральдегида. Несвязанный фермент удаляют диализом или хроматографией на сефадексе. Для предупреждения микробной деградации в конъюгаты вносят мертиолят до 0,01 % и хранят при 4 ºС в замороженном или лиофильно высушенном состоянии.

Примеры:

В настоящее время выпускают препараты пероксидазных конъюгатов антител для выявления антигенов стафилококков, пневмококков, возбудителей чумы, туберкулеза, легионеллеза, гриппа, парагриппа, аденовирусной инфекции и др.

81

6.6.5. Сыворотки, меченные радиоизотопами для постановки радиоиммунного анализа (РИА)

Для этого диагностического метода используются антитела, меченные изотопами, и учет интенсивности излучения производится при помощи специальных счетчиков (β- или γ-излучения). Реакции РИА очень чувствительны, позволяют обнаружить 1–2 нг и менее исследуемого вещества

Этапы приготовления диагностических сывороток те же, что и

для других реакций с меткой, но маркируются антитела изотопами

125I, 51Cr, 14С, 3Н.

6.7. Моноклональные антитела (МКА)

Моноклональные антитела – это особый вид иммунных сывороток, отличающихся высокой специфичностью. Они представляют собой биохимически гомогенные молекулы антител, обладающие паратопом (гипервариабельным участком F(ab) фрагмента антитела) единственной, строго определенной специфичности.

МКА против одного определенного антигенного эпитопа идентичны по физико-химическим свойствам, специфичности, аффинности и относятся к одному классу и типу иммуноглобулинов.

Моноклональные антитела точнее, чем обычные иммунные сыворотки, выявляют мельчайшие антигенные структуры. Их широко применяют в современных иммуноферментных, иммунофлюоресцентных и радиоиммунных методах выявления антигенов и антител.

В условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозможно. Сложность в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту (эпитоп) одновременно реагируют множество различных клонов В-лимфоцитов, что обусловливает большое разнообразие продуцируемых антител.

Получить МКА удалось с помощью уникального метода гибридомной технологии в 1975 г. Д. Келлеру и Ц. Милштейну. Они осуществили гибридизацию антителопродуцирующих клеток животного с клетками злокачественной опухоли – В-клеточной плазмацитомы. Полученные клетки-гибриды, названные гибридомами, соединили в себе свойства обоих «родителей»:

82

способность продуцировать антитела и способность к неограниченному размножению.

Этапы получения гибридомных клеток:

–Иммунизация мышей нужным антигеном.

–Получение культуры В-лимфоцитов из селезенки иммунизированной мыши.

–Слияние иммунных B-лимфоцитов с опухолевыми клетками В-миеломы, способными делиться бесконечно.

–Отбор жизнеспособных гибридов на селективной питательной среде.

Популяция отобранных гибридов способна синтезировать антитела нужной специфичности в неограниченном количестве.

–Гибридомы размножают в искусственных питательных средах или в организме животных в виде асцитных опухолей. При росте опухоли в организме мыши в асцитическую жидкость поступает большое количество антител.

6.8.Иммунотоксины, иммуноадгезины

Искусственно полученные антитела. Практически к любым структурам микробной, животной или человеческой клетки и тканям, обладающим антигенностью, можно получить антитела. Эти специфические антитела (в основном моноклональные) к отдельным структурам клеток нашли применение в исследовательских работах, в частности, для маркировки клеток (например, CD-маркеры В- лимфоцитов), для изучения механизмов взаимодействия клеток в норме и патологии (иммуноадгезины), для адресной доставки лекарственных препаратов и подавления тех или иных биологических процессов (иммунотоксины).

6.9. Абзимы (антитела-ферменты)

Искусственно полученные иммуноглобулины, обладающие специфичностью антител к какому-либо промежуточному продукту биологической реакции, обладающему антигенными свойствами. Абзимы действуют как ферменты-катализаторы. Могут ускорять течение биохимических реакций в 1 000 раз и более.

83

Глава 7. Диагностикумы и антигены

Биологические антигенные препараты, применяемые для обнаружения и титрования антител в сыворотке крови больных (с целью серодиагностики), могут представлять собой как взвесь убитых микроорганизмов, так и растворимые антигенные фракции.

Для приготовления антигенных препаратов подбирают специальные штаммы микробов, обладающих высокой специфичностью и сохраняющих свои антигенные свойства после обработки. Антигенные препараты бывают корпускулярные и растворимые. Если корпускулярный антиген представляет собой взвесь убитых микроорганизмов, то растворимый – антигенные фракции. Растворимые антигены отличаются большей чувствительностью и стабильностью. Корпускулярные антигены готовят из взвеси микроорганизмов, инактивированных нагреванием при 100 в течение 15–20 минут, а также – спиртом или формалином.

Растворимые антигены представляют собой антигенные фракции, полученные путем экстракции из чистой культуры микроорганизмов.

Стандартные антигены, которые используются в иммунологических реакциях для выявления соответствующих им (специфических) антител в исследуемых сыворотках, называются диагностикумами.

Тонкие различия АТ в изучаемой сыворотке обнаруживают при помощи монодиагностикумов, то есть препаратов, содержащих один антиген, например: групповой О- или специфический типовой – Н-, или Viантиген. Такие монодиагностикумы готовят, например, для распознавания заболеваний, вызванных микроорганизмами рода сальмонелл.

В практике широко применяют в настоящее время эритроцитарные диагностикумы. Эритроцитарные диагностикумы содержат эритроциты человеческой или бараньей крови, сенсибилизированные бактериальными, риккетсиозными или вирусными антигенами. Для создания прочной связи антигена с поверхностью эритроцитов последние предварительно обрабатывают таннином, формальдегидом, глютаровым альдегидом, на альдегидные группировки которых прочно «садится» антиген. Применяют для постановки реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Кроме эритроцитов антигены могут адсорбироваться на поверхности

84

активированного угля, латекса, холестерина, каолина и других органических и неорганических адсорбентов.

7.1.Бактериальные антигенные препараты

–Бруцеллезный единый диагностикум – взвесь убитых формалином либо нагреванием бруцелл трех видов в физиологическом растворе хлорида натрия с добавлением метиленового синего. Препарат выпускается в жидком виде и представляет собой гомогенную взвесь бруцелл, окрашенную в синий цвет. Применяют для постановки как развернутой реакции агглютинации с сывороткой больного (реакция Райта), так и на стекле (реакция Хеддельсона) с целью серодиагностики бруцеллеза.

–Брюшнотифозный О-диагностикум – взвесь бактерий брюшного тифа, убитых нагреванием при 100 ºС.

–Брюшнотифозный Н-диагностикум – взвесь бактерий,

инактивированных формалином.

Оба брюшнотифозных диагностикума используют в реакции Видаля для серодиагностики брюшного тифа.

–Эритроцитарный брюшнотифозный диагностикум

представляет собой взвесь эритроцитов, обработанных формалином и сенсибилизированных антигеном брюшнотифозных микробов. Применяется в РПГА с целью серодиагностики бактерионосительства при брюшном тифе.

–Дизентерийные диагностикумы (Зоне, Флекснера и др.)

состоят из дизентерийных микробов, убитых формалином. Используются в реакции агглютинации для серологической диагностики дизентерии.

–Дизентерийные эритроцитарные диагностикумы сухие и жидкие представляют собой взвесь формализированных эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном шигелл. Дизентерийные эритроцитарные диагностикумы используются в РПГА для серологической диагностики дизентерии.

–Растворимый коклюшный антиген для РСК представляет собой выделенный из микробных клеток при помощи химической экстракции и очищенный специфический растворимый антиген коклюшного микроба, обладающий высокой серологической активностью. Используется с целью серодиагностики, а также оценки эффективности вакцинации.

85

–Эритроцитарный коклюшный диагностикум представляет собой растворимый антиген коклюшной палочки, сорбированный на формализированных и обработанных таннином эритроцитах барана. Имеет вид прозрачной бесцветной жидкости с плотным коричневым осадком эритроцитов. Применяется для выявления антител при помощи РПГА.

–Туляремийный диагностикум состоит из культуры туляремийных микробов, убитых формалином. Используется при серологической диагностике туляремии в реакции развернутой агглютинации и в кровяно-капельной реакции на стекле.

–Гонококковый антиген представляет собой стандартизованную взвесь культуры гонококка, убитую с помощью температуры или ультразвука. Применяется для постановки РСК при серологической диагностике хронической гонореи.

–Антигены для серодиагностики сифилиса. Для серологической диагностики сифилиса с помощью РСК (р.

Вассермана) используют два	антигена: специфический и
неспецифический.

–Специфический антиген готовят из тканевых трепонем, полученных при экспериментальном орхите у кроликов и разрушенных ультразвуком. Антигены из трепонем характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.

–Неспецифический кардиолипиновый антиген –

высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липидов и смешанный в определенной пропорции

слецитином и холестерином. Кардиолипиновый антиген используют также и в микрореакции преципитации.

–Лептоспирозный антиген представляет собой живую взвесь 7– 10-дневной культуры лептоспир, выращенной на жидкой питательной среде. Применяется для постановки реакции агглютинации и лизиса.

7.2.Риккетсиозные и вирусные антигенные препараты

–Риккетсиозные корпускулярные антигены – взвесь убитых риккетсий соответствующих видов, выращенных в желточном мешке куриного эмбриона и тщательно очищенных от посторонних тканевых элементов.

–Риккетсиозные антигены растворимые представляют собой антигенные фракции, полученные путем экстракции и последующей

86

обработки эфиром чистой культуры риккетсий. Готовятся производственным путем и выпускаются в виде сухих препаратов в запаянных ампулах. Риккетсиозные антигены используются при серологической диагностике риккетсиозов: эпидемического и эндемического сыпного тифа, марсельской лихорадки, волынской лихорадки и Ку-лихорадки. Эти антигены применяют в РСК и РА.

– Жидкий эритроцитарный сыпнотифозный диагностикум

представляет собой взвесь человеческих или бараньих эритроцитов, сенсибилизированных специфическим гаптеном из риккетсий Провачека. Применяют для постановки РПГА с целью серодиагностики.

–Гриппозные диагностикумы представляют собой очищенную вируссодержащую аллантоисную жидкость куриных эмбрионов, высушенную лиофильным методом. Готовятся диагностикумы раздельно для каждого типа вируса гриппа: А, А1, А2, В, С. Гриппозные диагностикумы применяются для постановки РТГА при серологической диагностике гриппа у больных.

–Аденовирусный антиген представляет собой инактивированную вируссодержащую жидкость, полученную при культивировании аденовируса в культуре перевиваемых клеток. Используется в РСК при серологической диагностике аденовирусной инфекции у людей.

–Парагриппозные гемагглютинирующие диагностикумы – это обработанные эфиром и твином препараты, полученные из тканевых культур, инфицированных парагриппозными вирусами I, II, III типов. Парагриппозные диагностикумы используются в РТГА.

–Диагностикум клещевого энцефалита – это препарат,

приготовленный методом экстрагирования специфического вирусного компонента из мозговой ткани белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита и обезвреженный формалином. Препарат применяют в качестве антигена в РСК при серологической диагностике заболевания у людей.

–Гемагглютинирующий инактивированный диагностикум клещевого энцефалита выпускается в виде суспензии мозга мышей, зараженных вирусом. Препарат применяется в качестве антигена в РТГА для выявления антител в сыворотках переболевших людей, а также у людей и животных в природных очагах.

87

Глава 8. Диагностические бактериофаги

Препараты диагностических бактериофагов готовят из индикаторных монофагов и типовых бактериофагов. Применяют для фагодиагностики, фагоидентификации и фаготипирования.

– Фагодиагностика – осуществляется двумя путями:

•выделение специфических бактериофагов из исследуемого материала больного при подозрении на ту или иную бактериальную инфекцию, что косвенно указывает на наличие соответствующего возбудителя;

•обнаружение в исследуемом материале незначительных количеств бактерий при помощи реакции нарастания титра фага (РНТФ) без выделения чистой культуры возбудителя.

Для фагодиагностики выпускают:

– индикаторные бактериофаги: брюшнотифозный,

дизентерийный Флекснера и Зонне, чумный, холерный – классический и Эль-Тор, бруцеллезный и сибиреязвенный.

Индикаторный бактериофаг – вирулентный фаг,

характеризующийся точно лимитированным спектром действия. Индикаторный фаг обладает высокой адсорбционной способностью, коротким инкубационным периодом и высоким урожаем. Эти свойства обеспечивают значительное увеличение титра фага в исследуемом материале, содержащем соответствующих возбудителей, что выявляется в реакции нарастания титра фага (РНТФ), используемой для обнаружения бактерий в объектах окружающей среды и исследуемом материале больного.

–Фагоидентификация – определение вида бактерий, выделенных в чистой культуре по известному бактериофагу.

Для фагоидентификации бактерий в чистой культуре применяют диагностические препараты вирулентных полифагов и монофагов, в том числе индикаторных. Используются:

–сальмонеллезный бактериофаг АВСДЕ, брюшнотифозный монофаг, монофаги паратифа А и В, дизентерийные поли- и монофаги Зонне, Флекснер и другие, бруцеллезный монофаг, чумной монофаг, холерные монофаги и др.

Фаготипирование – подразделение бактерий внутри вида или серовара с помощью типовых бактериофагов, что необходимо для эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний.

Различают два способа фаготипирования: прямой и непрямой.

88