2009.-Byelorussian Pharmacopoeia_Volume 3
.pdfСодержание |
11 |
|
Михайловская О.Н. |
Холина Н.А. |
|
Мороз О.Е. |
Чернецкая Ю.В. |
|
Мороз Т.В. |
Чернявская А.А., к.х.н. |
|
Новик О.А. |
Чигирь С.Н. |
|
Новик Т.Г. |
Шахницкий Д.М. |
|
Парахневич О.Г. |
Шеряков А.А., к.ф.н. |
|
Покачайло Л.И., к.ф.н. |
Яковлев И.В. |
|
Попкова Е.В. |
Частные статьи на лекарственное |
|
Попова Н.А. |
растительное сырье |
|
Протасевич Л.И. |
Бузук Г.Н., д.ф.н. |
|
Ридевская Н.В. |
||
Гурина Н.С., д.б.н. |
||
Рогович Т.Е. |
||
Рядинская А.В. |
Дергачева Ж.М. |
|
Свердлова Н.В. |
Коноплева М.М., к.ф.н. |
|
Селицкий В.Е. |
Кузьмичева Н.А., к.ф.н. |
|
Скворцова И.А. |
Кухарева Л.В., к.б.н. |
|
Солодкова Г.С. |
Моисеев Д.В., к.ф.н. |
|
Стреха И.С. |
Родионова Р.А., к.ф.н. |
|
Тихонович С.Н. |
Хишова О.М., д.ф.н. |
|
Трембач А.С. |
Цаприлова С.В. |
|
Трухачева Т.В., к.т.н. |
Шимко О.М. |
|
|
|
|
Список авторов |
Агафонова И.В. |
Залесская С.В. |
Арсенова Н.И. |
Захарова Т.В. |
Артемьева О.И. |
Зейдина Т.В. |
Алексеев Н.А. |
Иванова Н.А. |
Багнюк Е.Ф. |
Иванова Т.Д. |
Батуро Т.В. |
Кенькова Н.Н. |
Бернович Л.С. |
Кердоль И.В. |
Богатырева С.Ю. |
Кобзева Н.М. |
Бойша А.Э. |
Ковалевская Ж.И. |
Бондаренко Е.В. |
Ковальчук Н.В. |
Бремза О.А. |
Коноплева М.М. |
Будай А.И. |
Коцур О.М. |
Бузук Г.Н. |
Ковшик А.В. |
Валенто Ю.М. |
Кравец М.М. |
Валюкевич Я.М. |
Кугач В.В. |
Власик Е.Л. |
Кудрявцева С.И. |
Войтюль Е.И. |
Кузьмичева Н.А. |
Волконская Л.Н. |
Кухарева Л.В. |
Воробьев А.Н. |
Ларченко Е.И. |
Воробьева Т.И. |
Лежава Т.И. |
Галаганова Т.Г. |
Либерова С.Е. |
Галейша Е.А. |
Линкевич В.Г. |
Геводова Л.Б. |
Майсак И.А. |
Гертман О.П. |
Малыгина Н.А. |
Голик Г.И. |
Мамчиц Е.Н. |
Горбацевич В.Н. |
Марченко С.И. |
Грибанова В.П. |
Медяков М.М. |
Грицкевич Д.Н. |
Мельникова Г.Г. |
Грищенко С.И. |
Микушкин А.С. |
Грушевич Е.В. |
Милькевич В.В. |
Губина Л.П. |
Михайловская О.Н. |
Гурина Н.С. |
Моисеев Д.В. |
Демидова О.Н. |
Мороз О.Е. |
Дергачева Ж.М. |
Мороз Т.В. |
Дудорева И.В. |
Назарова Е.Ф. |
Дунец Л.Н. |
Никифорова Л.Н. |
Евдокимова Л.Н. |
Новик О.А. |
Еремейчик И.В. |
Новик Т.Г. |
Ермоленко Т.М. |
Осипова В.Н. |
Жебентяев А.И. |
Парахневич О.Г. |
Жерносек А.К. |
Плаксицкая Т.Д. |
Жучина Н.В. |
Позняк И.А. |
Закацура Л.Ф. |
Покачайло Л.И. |
Политова Е.В.
Попкова Е.В. Попова Н.А. Посконная Л.Б. Преснякова И.М. Протасевич Л.И. Прохорова М.В.
Рафалович Л.И.
Ридевская Н.В.
Рогович Т.Е.
Родионова Р.А.
Романенко Г.Г.
Рябкова Л.П.
Рядинская А.В.
Свентицкая Л.И. Свердлова Н.В. Селицкий В.Е.
Сеткина С.Б. Скворцова И.А. Снарская Г.С. Солодкова Г.С. Стреха И.С. Сыресина Н.В. Тарасова Т.И. Тихонович С.Н. Торбина Т.Д. Трембач А.С. Трухачева Т.В. Филиппова Г.Н. Фомичева Н.В. Хвеженко О.В. Хишова О.М. Холина Н.А. Цаприлова С.В.
Чернецкая Ю.В. Чернявская А.А.
Чигирь С.Н.
Шахницкий Д.М. Шеряков А.А. Шерякова Ю.А. Шимко О.М. Яковлев И.В.
12 |
Государственная фармакопея Республики Беларусь |
Список организаций, учреждений и предприятий Республики Беларусь, принимавших участие в разработке Государственной фармакопеи Республики Беларусь
РУП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»
УО Витебский государственный медицинский университет ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов»
ООО «Фармтехнология» УП «Минскинтеркапс» РУП «Белмедпрепараты»
РУП «Гродненский завод медицинских препаратов»
ОДО «Фармион» РУП «Несвижский завод медицинских препаратов»
ГУ «Республиканский научно-практический центр гематологии и транфузиологии»
Отдел контроля качества аптечного склада ТП РУП «БелФармация» Контрольно-аналитическая лаборатория ТП РУП «Минская Фармация» Контрольно-аналитическая лаборатория Брестского ТП РУП «Фармация»
Контрольно-аналитическая лаборатория Витебского ТП РУП «Фармация»
Контрольно-аналитическая лаборатория Гомельского ТП РУП «Фармация»
Контрольно-аналитическая лаборатория Гродненского ТП РУП «Фармация»
Контрольно-аналитическая лаборатория Могилевского ТП РУП «Фармация» ТП РУП «БелФармация», аптека № 52
1. Общие сведения |
13 |
1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
В 3-м томе Государственной фармакопеи Республики Беларусь в новой редакции приведены общие и частные статьи:
2.2.32. Потеря в массе при высушивании; 2.4.8. Тяжелые металлы;
# Лекарственное растительное сырье; Валерианы корневища с корнями. Введены новые общие статьи, тексты и
разделы:
2.2.55.Пептидное картирование;
2.2.56.Анализ аминокислот;
2.4.30.Этиленгликоль и диэтиленгликоль
вэтоксилированных субстанциях;
2.5.36.Анизидиновое число;
2.6.27. Микробиологический контроль клеточных продуктов;
5.9.Полиморфизм;
5.10.Контроль примесей в субстанциях для фармацевтического использования;
5.11.Раздел «Описание (свойства)» в частных статьях;
5.12.Стандартные образцы;
# 6. Экстемпоральные лекарственные средства.
Дополнения к общим статьям и разделам: 2.9.3. Тест «растворение» для твердых
дозированных форм; 4. Реактивы.
1.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Положения раздела «Общие сведения» рас-
пространяются на все общие статьи, частные
статьи и другие материалы Государственной фармакопеи Республики Беларусь.
В материалах Государственной фарма-
копеи Республики Беларусь слово «Фармако-
пея» без уточнений подразумевает Государственную фармакопею Республики Беларусь. Наряду с этим для обозначения Государственной фармакопеи Республики Беларусь может
быть использовано официальное сокращение
ГФ РБ.
Термин «компетентный уполномоченный орган» означает Министерство здравоохране-
ния Республики Беларусь и Республиканское
унитарное предприятие «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении» в соответствии с
его компетенцией.
# Все общие фармакопейные статьи и моно-
графии гармонизированы с Европейской Фармакопеей и построены в следующем формате:
–адаптированный перевод соответствующего материала Европейской Фармакопеи;
–национальные дополнительные испытания, информационные и иные материалы отме-
чены значком «#».
Ссылка в материалах Фармакопеи на какую-
либо статью и/или ее раздел означает, что продукт соответствует требованиям этой статьи. На-
звание статьи, на которую дается ссылка, и/или
ее номер обычно выделены курсивом. Лекарственное средство должно соответ-
ствовать требованиям Фармакопеи на протяже-
нии срока годности. Срок годности и дата, с кото-
рой он должен отсчитываться, согласовывают-
ся компетентным уполномоченным органом на
основании экспериментальных исследований по стабильности данного готового лекарственного
средства. Любой другой продукт (фармацевтическая субстанция, вспомогательное вещество
и др.) должен соответствовать требованиям конкретной фармакопейной статьи на всем протяжении периода его использования.
Требования частной статьи являются обя-
зательными, если нет специальных указаний в статье «Общие сведения» или в данной частной статье. Общие статьи становятся обязательными, когда на них приводится ссылка в той или иной частной или общей статье, если
только специально не указано, что ссылка при-
водится исключительно как информация или рекомендация.
# Субстанции для фармацевтического использования подразделяются на фармацевтические субстанции и вспомогательные вещества.
Фармацевтические субстанции, вспомога-
тельные вещества, лекарственное растительное
сырье, лекарственные средства и другие продукты, описываемые в частных статьях Фармакопеи, предназначены для использования в медицине.
Нормативный документ по контролю каче-
ства производителя лекарственного средства может не содержать все тесты (испытания), приведенные в Фармакопее. Для подтверждения
соответствия лекарственного средства требо-
ваниям Фармакопеи производитель при выпуске должен представить доказательства того, что лекарственное средство соответствует фарма-
копейному качеству исходя из результатов вали-
дационных испытаний в сочетании с результатами контроля процесса производства данного ле-
карственного средства. Такой подход, если ком-
петентные уполномоченные органы считают его
обоснованным, не противоречит необходимости
соответствия требованиям Фармакопеи.
Испытания и методики количественного
определения, приведенные в Фармакопее, являются официальными методиками, однако по со-
гласованию с компетентными уполномоченны-
ми органами могут использоваться и другие ме-
тодики при условии, что они дают результаты,
соответствующие фармакопейным методикам. В случае сомнений или разногласий решающей является фармакопейная методика.
Фармацевтические субстанции, вспомогательные вещества и другие продукты, на кото-
рые распространяются требования Фармако-
14 |
Государственная фармакопея Республики Беларусь |
пеи, могут использоваться в разных целях (на-
пример, для получения парентеральных ле-
карственных средств или таблетированных ле-
карственных форм и т.п.). Если на этот счет нет
указаний в соответствующей частной статье, ее требования распространяются на продукт
независимо от целей его применения. В неко-
торых случаях, к примеру, в случае вспомогательных веществ, частная статья может быть
дополнена списком характеристик, которые
являются важными для использования данно-
го вещества; этот список прилагается в каче-
стве информации и рекомендаций. В информационных целях также могут быть приведе-
ны методики контроля одной или нескольких
таких характеристик.
Общая фармакопейная статья на ту или
иную лекарственную форму распространяется
на все лекарственные средства, изготовленные
в виде этой лекарственной формы. Для конкретного лекарственного средства требования соответствующей общей фармакопейной статьи не
обязательно являются исчерпывающими и могут
быть дополнены компетентным уполномоченным органом в частной статье.
Словосочетание «если нет других указаний в частной статье» (под частной статьей под-
разумевается частная статья ГФ РБ на субстан-
цию или нормативный документ по контролю ка-
чества (НД), утвержденный уполномоченным ор-
ганом) означает, что требования общей статьи
должны быть выполнены, если только компе-
тентный уполномоченный орган не внес в эти требования изменения, что указывается в частной статье.
В некоторых общих и частных статьях Фар-
макопеи при описании реактива, микроорганизма, методики и т.д. используется термин «подходящий». Если при этом критерии их пригодности не сформулированы, то пригодность кон-
кретных реактивов, методик и т.д., используе-
мых в нормативной документации, должна быть обоснована перед компетентным уполномоченным органом.
2. Методы анализа |
15 |
2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА
2.2. ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2.2.32. ПОТЕРЯ В МАССЕ ПРИ ВЫСУШИВАНИИ
Определение потери в массе при высуши-
вании проводят одним из приведенных спосо-
бов и выражают в процентах (м/м).
Методика. Указанное в частной статье количество испытуемого вещества помещают во взвешенный бюкс, предварительно высу-
шенный в условиях, описанных для испытуе-
мого вещества. Вещество сушат до постоян-
ной массы или в течение времени, указанного
в частной статье, одним из приведенных ниже способов. Если температурный интервал не
указан, то высушивание проводят при указанной температуре ±2°С.
а) «в эксикаторе»: высушивание над фосфора (V) оксидом Р при атмосферном давлении и комнатной температуре;
б) «в вакууме»: высушивание над фосфора (V) оксидом Р при давлении от 1,5 кПа до 2,5 кПа и комнатной температуре;
в) «в вакууме в пределах указанного температурного интервала»: высушивание над фосфора (V) оксидом Р при давлении от 1,5 кПа до
2,5 кПа и температуре, указанной в частной статье;
с) «в пределах указанного температурного интервала»: высушивание в сушильном шкафу
при температурном интервале, указанном в
частной статье; д) «в глубоком вакууме»: высушивание
над фосфора (V) оксидом Р при давлении не
более 0,1 кПа и температуре, указанной в част-
ной статье.
Если указаны иные условия, используемая методика полностью описывается в част-
ной статье.
2.2.55. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ
Пептидное картирование (или составление пептидных карт) является методом идентифи-
кации белков, в особенности получаемых мето-
дом рекомбинантных ДНК. Метод включает в себя
этапы химического или энзиматического расщепления белков до образования пептидных фрагментов с последующим разделением и идентификацией этих фрагментов в воспроизводимых условиях. Это надежный метод испытания, позволяющий произвести идентификацию изменения
практически каждой отдельной аминокислоты,
произошедшего в результате таких явлений, как
ошибка в считывании последовательности ком-
плементарной ДНК (кДНК), либо являющегося ре-
зультатом мутации. Составление пептидных карт является сравнительным испытанием, поскольку
получаемая информация сравнивается со стан-
дартным образцом, подвергающимся аналогич-
ному воздействию. Данное испытание позволяет подтвердить первичную структуру белка, опре-
делить возможные изменения первичной структу-
ры в случае наличия таковых, подтвердить соот-
ветствие процесса и генетическую стабильность. Для каждого из белков характерна совокупность
уникальных характеристик, которые должны быть
описаны. Научные и аналитические методики по-
зволяют осуществлять развитие метода пептидного картирования, который, в свою очередь, ха-
рактеризуется достаточной специфичностью.
Данная статья содержит детальное опи-
сание аспектов использования и валидации
метода пептидного картирования с целью получения характеристики анализируемого белка,
оценки стабильности клеточных систем экспрессии, используемых для получения продуктов рекомбинантных ДНК и оценки согласованности процесса в целом — в отношении как оценки стабильности продукта, так и обеспечения иден-
тичности белка, либо определения содержания
протеинов с изменениями в структуре. Пептидное картирование не является
общим методом, а заключается в составлении индивидуальных карт для каждого отдельного белка. Хотя технологии продолжают стремительно развиваться, существует ряд методов, которые являются общепризнанными. При наличии определенных расхождений с данными методами они будут описываться в соответствующих частных статьях.
Составление пептидных карт может рассматриваться как метод получения «отпечатков пальцев» белка и представляет собой получаемую в результате ряда химических процессов полную расшифровку анализируемого белка. Метод включает четыре принципиальные стадии: выделение и очистка белка — в случае если белок входит в состав какой-либо смеси; избирательное расщепление пептидных связей; хроматографическое разделение образующихся пептидных фрагментов; анализ и идентификация пептидов. Анализируемый образец подвергается расщеплению и анализу параллельно со стандартным образцом. Полное расщепление пептидных связей более вероятно, когда вместо
химических гидролизующих реагентов использу-
ются такие ферменты, как эндопептидазы (на-
пример, трипсин). Для того чтобы карта была информативной, она должна содержать достаточное количество пептидов. С другой стороны, в случае если пептидных фрагментов будет слишком много, карта может утратить свою специфичность, поскольку у многих белков может ока-
заться аналогичный профиль.
16 |
Государственная фармакопея Республики Беларусь |
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА
Выделение и очистка являются обязатель-
ным этапом при проведении анализа нерасфа-
сованных или дозированных форм лекарствен-
ных средств, содержащих мешающие анализу вспомогательные вещества или белковые носи-
тели и, если это требуется, указываются в част-
ной статье. Количественное извлечение пептида из дозированной формы должно быть вали-
дировано.
ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ
ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ
Выбор метода расщепления пептидных связей зависит от анализируемого белка. Процедура выбора включает определение требующегося типа расщепления (химического или
ферментативного), а также типа протеолитиче-
ского реагента в рамках выбранной категории. В таблице 2.2.55.-1. приводится ряд протеолитических ферментов и параметры их специфичности. Данный список не является исчерпывающим и будет дополняться по мере определения
других реагентов, способных расщеплять пептидные связи.
Подготовка образца. В зависимости от
размера или конфигурации белка используют-
ся различные подходы к подготовке образца. В случае если используется трипсин для расщепления пептидных связей белка с молекулярной
массой более 100 000 Да, лизиновые остатки
должны быть защищены путем получения производных с лимонной или малеиновой кислотой,
так как в противном случае может образоваться слишком много пептидных фрагментов.
Подготовка реагента для расщепления пептидных связей. Подготовка реагента для
расщепления пептидных связей, в особенности
ферментов, может быть необходимым этапом для обеспечения требуемой чистоты и воспроизводимости карты. Например, трипсин, исполь-
зуемый в качестве реагента для расщепления
пептидных связей, следует обработать тозил-L- фенилаланинхлорметилкетоном с целью инактивации химотрипсина. Хорошо зарекомендовали себя, в особенности при ограниченном количестве имеющегося белка, другие методы очист-
ки, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) при очистке трипсина или иммобилизация фермента на гелевом носи-
теле.
Подготовка белка. При определенных
условиях может быть необходимо концентрирование образца либо отделение белка от исполь-
зуемых в готовой лекарственной форме сопут-
ствующих веществ и стабилизаторов, которые
могут искажать результаты картирования. Физические методы подготовки могут включать ультрафильтрацию, колоночную хроматографию
и лиофилизацию. С целью проведения денату-
рации белка до процедуры пептидного картирования возможно использование других методов подготовки, таких как добавление хаотроп-
ных агентов (например, мочевины). Для обеспе-
чения полного доступа фермента к местам разрыва связей и частичной денатурации белка во
Таблица 2.2.55.-1.
Примеры реагентов для расщепления пептидных связей
Тип |
Реагент |
Специфичность |
|
|
|
Ферментативные |
Трипсин (ЕС 3.4.21.4) |
С-концевые аргинин и лизин |
|
Химотрипсин (ЕС 3.4.21.1) |
С-концевые гидрофильные остатки (на- |
|
|
пример, лейцин, метионин, аланин, аро- |
|
|
матические аминокислоты) |
|
Пепсин (ЕС 3.4.23.1 и 2) |
Неспецифический реагент |
|
Лизил эндопептидаза (Lys-С эн- |
С-концевой лизин |
|
допептидаза) (ЕС 3.4.21.50) |
|
|
Глутамил эндопептидаза |
С-концевые глутаминовая кислота и аспа- |
|
(из S. aureus штамм V8) (ЕС |
рагиновая кислота |
|
3.4.21.19) |
|
|
Пептидил-Asp металло- |
N-концевая аспарагиновая кислота |
|
эндопептидаза (эндопротеаза |
|
|
Asp-N) |
|
|
Клострипаин (ЕС 3.4.22.8) |
С-концевой аргинин |
Химические |
Цианобромид |
С-концевой метионин |
|
2-Нитро-5-тио-цианобензойная |
N-концевой цистеин |
|
кислота |
|
|
О-Йодозобензойная кислота |
С-концевые триптофан и тирозин |
|
Разведенная кислота |
Аспарагиновая кислота и пролин |
|
BNPS-скатол |
Триптофан |
2.2.55. Пептидное картирование |
17 |
многих случаях до этапа протеолитического рас-
щепления необходимым представляется сокра-
щение числа дисульфидных связей путем их
восстановления и алкилирования. Расщепле-
ние пептидных связей с использованием трипсина может сопровождаться появлением в пеп-
тидной карте ряда неточностей ввиду протека-
ющих параллельно с реакцией протеолитического расщепления побочных реакций, таких
как неспецифическое расщепление, дезамини-
рование, дисульфидная изомеризация, окисле-
ние остатков метионина, образование пироглу-
таминовых групп при дезаминировании глутамина и N-концевых участков пептида. Более того,
при автогидролизе трипсина также могут появляться дополнительные пики. Интенсивность их образования зависит от соотношения содержа-
ния трипсина к белку. Для предотвращения гидролиза растворы протеаз могут быть приготов-
лены при рН, отличном от оптимального (например, при рН 5 для трипсина), благодаря чему фермент не перейдет в активное состояние до момента разведения с буферным раствором при проведении расщепления.
Установление оптимальных условий для расщепления пептидных связей. Факторы, ко-
торые влияют на полноту и эффективность расщепления протеинов, являются факторами, оказывающими влияние на химические и фермен-
тативные реакции.
рН реакционной среды. Значение рН смеси,
вкоторой осуществляется расщепление пептида, определяется эмпирически и направлено на
оптимизацию состояния расщепляющего реагента. Например, при использовании цианобро-
мида в качестве расщепляющего реагента необходимым является создание сильнокислой среды (например, рН 2, муравьиная кислота);
однако при использовании трипсина в качестве
расщепляющего агента оптимальной является слабощелочная среда (рН 8). В целом значение рН реакционной среды не должно изменять хи-
мическую структуру белка в ходе реакции расщепления и не должно изменяться в ходе проведения реакции фрагментации.
Температура. Для большинства реакций
расщепления наиболее подходящей является температура в интервале от 25°С до 37°С. Создаваемая температура должна способствовать минимизации побочных химических ре-
акций. Тип тестируемого протеина определя-
ет выбор температуры реакционной среды, поскольку некоторые белки с повышением температуры склонны к денатурации. Например, расщепление рекомбинантного бычьего соматропина проводится при температуре 4°С, поскольку
при более высокой температуре он осаждается
входе проведения реакции расщепления. Время. В случае если имеется достаточное
количество тестируемого образца, следует провести испытание по определению времени, являющегося оптимальным для получения воспро-
изводимой карты и достаточным для проведения полного расщепления. Время расщепления
варьируется от 2 ч до 30 ч. Реакция прекращает-
ся либо прибавлением кислоты, которая не ока-
зывает влияния на полученную пептидную карту,
либо замораживанием.
Количество используемого расщепляющего реагента. Для обеспечения достаточного бы-
строго расщепления (от 6 ч до 20 ч) использует-
ся избыточное количество расщепляющего реагента; тем не менее, его количество должно быть минимизировано, чтобы предотвратить вклад реагента в структуру пептидной карты. Обычно анализируемый протеин и реагент берут в соот-
ношении 20:1 или 200:1. Для оптимизации процедуры расщепления рекомендуется добавлять расщепляющий агент в два или более этапов.
При этом конечный объем реагирующей смеси
должен оставаться достаточно небольшим для
обеспечения следующего этапа пептидного картирования — разделения. Для того чтобы исключить возможное влияние искажающих продуктов расщепления (артефактов) на результаты по-
следующего анализа, проводится контрольное определение со всеми реагентами за исключением анализируемого белка.
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ
Для разделения пептидных фрагментов используются различные методы. Выбор метода зависит от белка, для которого составляется пептидная карта. В таблице 2.2.55.-2 перечислены методы, которые на данном этапе успеш-
но используются для разделения пептидных фрагментов при составлении пептидных карт. В
данном разделе описывается один из методов хроматографического разделения — наиболее часто используемый метод обращенно-фазовой
ВЭЖХ.
Критическими факторами при ВЭЖХ разделении являются чистота растворителей и подвижной фазы. Для проведения обращенно-
фазовой ВЭЖХ рекомендуется использование растворителей и воды степени чистоты «для ВЭЖХ». Растворенные газы являются пробле-
мой для градиентных систем в тех случаях,
когда растворимость газа в растворителе может быть меньше в смеси, чем в самом растворителе. В качестве эффективного способа дегазации может быть использована вакуумная дегаза-
ция и воздействие ультразвуком. В случае если
твердые частицы в растворителе попадут в хроматографическую систему, они могут повредить
герметичность клапанов насоса или засорить
верхнюю часть хроматографической колонки. В
связи с этим рекомендуется проведение филь-
трации до и после насоса.
Хроматографическая колонка. Для каждого белка выбор колонки осуществляется эмпирически. Колонки с размером пор от 10 нм до 30 нм, заполненные сорбентом на основе сили-
кагеля, могут обеспечить оптимальное разделе-
18 |
Государственная фармакопея Республики Беларусь |
Таблица 2.2.55.-2.
Методы, используемые для разделения пептидных фрагментов
Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография Ионообменная хроматография Хроматография гидрофобного взаимодействия
Полиакриламидный гель-электрофорез, неденатурирующий Гель-электрофорез в полиакриламидных слоях с использованием мицеллярных систем (натрия додецилсульфат)
Капиллярный электрофорез Бумажная электрохроматография
Электрофорез на бумаге при высокой разности потенциалов
ние. Для более мелких пептидных фрагментов
силикагель октилсилильный для хроматографии Р (3—10 мкм) и силикагель октадецилсилильный для хроматографии Р (3—10 мкм) в качестве наполнителей колонки являются более
эффективными, чем силикагель бутилсилильный для хроматографии Р (5—10 мкм).
Растворитель. Наиболее часто в качестве растворителя используется вода и ацетонитрил
в качестве органического модификатора с добавлением не более 0,1 % кислоты трифторуксусной. При необходимости для повышения растворимости компонентов смеси прибавляют пропанол или 2-пропанол. Прибавление спиртов не должно приводить к чрезмерному повышению вязкости компонентов.
Подвижная фаза. Подвижная фаза, содержащая фосфатный буфер, используется для обеспечения возможности выбора рН, поскольку изменение рН в интервале от 3,0 до 5,0 улучшает разделение пептидов, содержащих кислотные остатки (например, глутаминовая и аспарагиновая кислоты). Натрия или калия фосфаты, ацетат аммония, фосфорная кислота при значении рН между 2 и 7 (или выше при использовании полимерного наполнителя) используются с ацетонитрильным градиентом. Достаточно
часто используется ацетонитрил с трифторуксу-
ной кислотой.
Градиент. Градиент может быть линейным, нелинейным или включать ступенчатое измене-
ние состава. Для разделения сложных смесей
рекомендуется низкая скорость изменения состава. Градиент оптимизируют, добиваясь четкого разрешения с одним или двумя пиками, которые становятся «маркерными» пиками для теста.
Изократическое элюирование. Изокра-
тическая ВЭЖХ с подвижной фазой постоян-
ного состава используется ввиду ее удобства и улучшенного отклика детектора. В ряде случаев сложно подобрать оптимальный состав подвижной фазы, позволяющий добиться хорошего разрешения для каждого пика. Для проведения изократической ВЭЖХ не должны использо-
ваться подвижные фазы, для которых незначительное изменение в соотношении компонентов или в значении рН существенно влияет на время удерживания пиков на пептидной карте.
Другие параметры. Для достижения хорошей воспроизводимости, как правило, требу-
ется контроль температуры колонки. Скорость подвижной фазы варьируется от 0,1 мл/мин до
2,0 мл/мин, детектирование пептидов осущест-
вляется спектрофотометрически детектором при
длине волны от 200 нм до 230 нм. Используют-
ся и другие методы детектирования (например, постколоночная дериватизация), но они не столь
надежны и универсальны, как детектирование в
ультрафиолетовой области.
Валидация. В данном разделе приводятся экспериментальные средства для оценки
общих характеристик используемого метода.
Критерии оценки пригодности системы зависят
от определения критических параметров испытания, влияющих на интерпретацию данных и их приемлемость. Критические параметры яв-
ляются также критериями, по которым произво-
дится контроль расщепления и анализа пептидов. Для контроля полноты требуемого расщепления используется сравнение со стандарт-
ным образцом, который был подвергнут такому
же воздействию, как и испытуемый белок. Использование стандартного образца параллельно с испытуемым белком является необ-
ходимым для разработки и установления зна-
чений критериев оценки пригодности системы. Кроме этого, с целью дополнительного сравнения включается образец хроматограммы стан-
дартного образца. Другие показатели могут
включать визуальный контроль растворимости белка или пептидов, отсутствие интактного белка, измерение откликов труднорасщепляе-
мых пептидов. Критические параметры оценки
пригодности системы для пептидного анализа
будут зависеть от конкретного используемого
метода разделения и детектирования, а также
требований к получаемым в результате анали-
за данным.
В случае, когда пептидное картирование ис-
пользуется в качестве испытания по идентифи-
кации, требования к пригодности системы для
идентифицируемых пептидов включают избира-
тельность и воспроизводимость. В этом случае,
как и в случае идентификации отличающихся по
составу белков, определение первичной струк-
туры пептидных фрагментов при картировании обеспечивает как верификацию известной первичной структуры, так и идентификацию структуры отличающихся белков путем сравнения с пептидной картой стандартного образца для
2.2.55. Пептидное картирование |
19 |
белка установленной структуры. Использование
подвергнутого расщеплению стандартного образца при определении разделения пептидов и
аминокислот является референтным методом.
Для анализа отличающихся по составу белков
может быть использована охарактеризованная
по составу смесь отличающегося белка и стандартного образца, в особенности если отличные
по составу белки находятся в зоне худшего раз-
решения на пептидной карте. Критерием выбора системы определения структуры белка может
являться число основных определяемых пепти-
дов. Критерии выбора системы для определе-
ния структуры белка лучшим образом опреде-
ляются разрешением пиков пептидов. Хроматографические параметры, такие как разрешение
между пиками, ширина пика у основания, пло-
щадь пика, степень размывания заднего фронта пика и эффективность колонки, могут быть ис-
пользованы для определения разрешения пеп-
тидов. В зависимости от испытуемого белка и
используемого метода разделения могут уста-
навливаться требования к разрешению одного
или нескольких пептидов.
Повторный анализ продуктов расщепления
стандартного образца для испытуемого белка позволяет установить количественные характеристики прецизионности и открываемости. От-
крываемость определяемых пептидов в целом
устанавливается при помощи внутренних и внешних пептидных стандартов. Прецизионность выражается как относительное стандарт-
ное отклонение. Следует ожидать различий в
извлечении и воспроизводимости идентифицируемого протеина; следовательно, критерии допуска для оценки пригодности системы должны
быть установлены как для извлечения, так и для
воспроизводимости идентифицируемых пептидов. Установленные критерии допуска являются специфическими для данного протеина и указы-
ваются в частных статьях.
Визуальное сравнение относительных времен удерживания, параметров пиков (площади пика или высоты пика), числа пиков и в
целом метода элюирования производится изна-
чально. Оно дополняется и подтверждается ма-
тематическим анализом соотношений анализи-
руемых параметров пиков и хроматографиче-
ского профиля смеси 1:1 (об/об) продуктов рас-
щепления испытуемого образца и образца сравнения. Идентичность анализируемого образца
подтверждается, если все пики продуктов рас-
щепления анализируемого белка и стандартно-
го образца имеют аналогичные времена удер-
живания и соотношения оцениваемых параме-
тров пиков.
Если пики, которые изначально характеризовались значительно различающимися временами удерживания, затем в смеси 1:1 были охарактеризованы как изначально выявленное различие является показателем нестабильности си-
стемы. Однако если отдельный пик наблюдается
всмеси 1:1, это является доказательством на-
личия различных пептидов в каждом из пиков.
Если пик в смеси 1:1 существенно шире, чем со-
ответствующий пик в анализируемом белке и стандартном образце, это может означать нали-
чие отличных пептидов. Было предложено ис-
пользование компьютерной программы распо-
знавания для анализа данных пептидного картирования, однако аспекты валидации компью-
терной программы исключают ее использование
вкачестве справочного теста в ближайшем бу-
дущем. Использовались также иные автоматизированные подходы с использованием матема-
тических формул, моделей и систем распозна-
вания. Одним из таких подходов, например, яв-
ляется автоматическое определение соедине-
ний методом ИК-спектроскопии и применение диодно-матричного УФ-спектрального анализа
для идентификации пептидов. Данные методы
имеют ограничения, обусловленные недостаточным разрешением, одновременным элюиро-
ванием фрагментов, различиями в абсолютных
значениях параметров пиков между продукта-
ми расщепления анализируемого и стандартных образцов.
Можно произвести множественное срав-
нение времен удерживания и площадей или
высоты пиков для выбранной группы соответствующих пиков, которые правильно идентифицируются на пептидной карте. Площади
пиков могут быть рассчитаны с использованием
одного пика, демонстрирующего относительно небольшую вариабельность в качестве внутреннего стандарта, с учетом того, что интегрирова-
ние площади пика является чувствительным к
базовой вариабельности и может служить причиной ошибки анализа. Как альтернативный вариант для испытуемого образца может быть рас-
считан процент высоты пика каждого пептида от-
носительно суммы высоты всех пиков. Затем полученный процент сравнивается со значением аналогичного параметра соответствующего пика
стандартного образца. Возможность автогидро-
лиза трипсина контролируется при помощи создания пептидной карты-плацебо, получаемой при обработке трипсином раствора без опреде-
ляемого белка.
Минимальным требованием для оценки ка-
чества пептидного картирования является при-
нятая процедура тестирования, которая вклю-
чает пригодность системы в качестве контро-
ля. В целом на начальном этапе регуляторно-
го процесса качественный анализ пептидной
карты анализируемого белка является доста-
точным. с усовершенствованием процесса ре-
гуляторного одобрения белков дополнительные
испытания по оценке качества могут включать частичную валидацию аналитической процедуры для обеспечения гарантии того, что метод будет произведен в соответствии с запланированным при разработке пептидной карты определяемого белка.
20 |
Государственная фармакопея Республики Беларусь |
АНАЛИЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ
Вданном разделе приводится руководство по использованию метода составления пептидных карт при разработке частных фармакопейных статей и нормативных документов по контролю качества (НД) при регистрации лекарственных средств.
Использование метода составления пептидных карт в качестве метода качественного определения не требует подробной характеристики
индивидуальных пептидных пиков. Однако ва-
лидация метода составления пептидных карт при разработке частных фармакопейных статей
иНД требует исчерпывающей характеристи-
ки каждого из индивидуальных пиков пептид-
ной карты. Для характеристики индивидуаль-
ных пиков могут быть использованы как метод
N-концевого секвенирования с последующим анализом аминокислот, так и метод с использо-
ванием масс-спектроскопии.
Вслучаях, когда для составления характеристики используется метод N-концевого секвенирования с последующим анализом амино-
кислот, аналитическое разделение масштабируют для целей препаративного разделения. Необходимо убедиться на основании эмпирических данных, что ухудшения разрешения между пиками вследствие проведения масштабиро-
вания не происходит. Элюаты, соответствую-
щие специфическим пептидным пикам, собирают, концентрируют в вакууме и, при необходимости, повторно хроматографируют. Аминокислот-
ный анализ фрагментов может быть ограничен
размером пептидов. В случае если N-концевая аминокислота заблокирована, может потребоваться ее высвобождение до секвенирова-
ния. с целью получения характеристики может
также использоваться С-концевое секвенирование белков в комбинации с карбоксипептидазой
иметодом матрично-активированной лазерной
десорбции/ионизации с времяпролетным масс-
анализатором (MALDI-TOF).
Использование масс-спектроскопии для характеристики пептидных фрагментов производит-
ся либо путем непосредственного введения выделенных пептидов, либо с использованием on-line
системы ВЭЖХ с масс-спектрометром для струк-
турного анализа. В целом он включает электро-
распыление и MALDI-TOF масс-спектрометрию,
а также бомбардировку быстрыми атомами. Тандемная масс-спектроскопия также используется
для определения последовательности модифи-
цированных белков и для определения типа прои-
зошедшей аминокислотной модификации. Опре-
деление расположения дисульфидных связей
в различных сульфгидрил-содержащих пепти-
дах может быть произведено методом сравнения масс-спектров продукта расщепления до и после восстановления. Если некоторые части первичной структуры не могут быть достаточно четко отражены пептидной картой, может потребоваться
составление вторичной пептидной карты. Целью
валидированного метода характеристики проте-
ина методом пептидного картирования является определение как минимум 95% теоретического
состава структуры белка.
2.2.56. АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ
Анализ аминокислот — это комплекс методов, используемых для определения аминокис-
лотного состава или количественного содержа-
ния аминокислот в белках, пептидах и лекарственных средствах. Белки и пептиды являются макромолекулами, состоящими из ковалент-
но связанных остатков аминокислот, которые об-
разуют линейные полимеры. Последователь-
ность аминокислот в белках или пептидах опре-
деляет свойства молекулы. Белки представляют собой крупные молекулы, которые обычно суще-
ствуют в виде трехмерных структур со специфи-
ческой конформацией, в то время как пептиды имеют меньший размер и могут состоять только
из нескольких аминокислот. Анализ аминокислот может быть использован для количественно-
го определения белков и пептидов, определения
подлинности белков или пептидов на основе их аминокислотного состава, структурного анализа белков и пептидов, для оценки стратегий расщепления для пептидных остатков и для обнаружения атипичных аминокислот, которые могут присутствовать в белках или пептидах. Перед анализом аминокислот необходимо гидролизовать белки/пептиды до получения отдельных аминокислотных составляющих. После гидролиза белков/пептидов процесс анализа аминокислот может быть таким же, как и для свободных аминокислот в других лекарственных средствах. Аминокислотные составляющие испытуемого образца обычно подвергаются химической модификации (или дериватизации) для анализа.
ОБОРУДОВАНИЕ
Методы, используемые для анализа аминокислот, обычно основаны на хроматографическом разделении аминокислот, присутствующих
виспытуемом образце. Современные методики анализа основаны на использовании автоматизированных хроматографических приборов для решения аналитических задач. В качестве прибора для анализа аминокислот обычно используют жидкостный хроматограф низкого или высокого давления, способный создавать градиентное элюирование подвижной фазой, что обеспечивает разделение анализируемых аминокислот на хроматографической колонке. Если
анализ образца не осуществляется с использованием предколоночной дериватизации, прибор должен иметь устройство для постколоночной дериватизации. В качестве детектора обычно используется спектрофотометрический детектор
вультрафиолетовой/видимой области или флу-