II.5. Определение активности антибиотиков методом

ДИФФУЗИИ В АГАР НА ЧАШКАХ ПЕТРИ

Описанная в предыдущем параграфе методика определения

активности антибиотиков по схеме латинского квадрата предполагает

использование лотков. Возможен и другой способ определения этой

активности - по диффузии в агар на чашках Петри. Ниже описан

трехдозный вариант этого метода <*>.

--------------------------------

<*> Этот раздел основан на разработке Всесоюзного НИИ

антибиотиков и Государственного НИИ по стандартизации и контролю

лекарственных средств Министерства здравоохранения СССР.

Стандартный (S) и испытуемый (U) образцы растворяют из расчета

1 Мг в 1 мл (основной раствор), затем готовят по три концентрации

S S S

рабочих растворов стандарта (D1, D2, D3) и испытуемого образца

U U U

(D1, D2, D3), относящиеся друг к другу как 1:2:4. Все 6

растворов закапывают на одну чашку Петри, причем

последовательность внесения растворов в цилиндры или в лунки

должна быть случайной (возможные последовательности внесения

растворов приведены в табл. II.5.1). Число чашек n должно быть не

меньше 6.

Для уменьшения влияния колебаний во времени между внесением

различных растворов рекомендуется после внесения растворов

выдерживать чашки в течение 1-2 ч при комнатной температуре. После

S U

измерения зон угнетения роста результаты опыта у , и у

i,j i,j

(i = 1, 2, 3 - номера доз, j = 1, 2, ..., n - номера чашек)

записывают в таблицу (как показано в приведенном ниже численном

примере). Там же записывают получаемые расчетом следующие

вспомогательные величины:

S U

Si = SUM у и Ui = SUM у (II.5.1)

j i,j j i,j

- суммы по чашкам для каждой дозы стандарта и испытуемого образца;

S U

Tj = SUM у + SUM у , (II.5.2)

i i,j i i,j

- суммы по всем дозам для каждой чашки;

у = SUM у = (S1 + S2 + S3) +(U1 + U2 + U3) = SUM Tj (II.5.3)

i,j i,j j

- суммы всех диаметров зон задержки роста по всем дозам и чашкам.

Далее вычисляют:

S = S1 + S2 + S3 и U = U1 + U2 + U3 (II.5.4)

- суммы всех диаметров зон задержки роста отдельно для стандарта и

для испытуемого образца;

L = S3 - S1 и L = U3 - U1 (II.5.5)

S U

- "линейные контрасты" для стандарта и для испытуемого образца;

Q = S1 - 2S2 + S3 и Q = U1 - 2U2 + U3 (II.5.6)

S U

"квадратичные контрасты" для стандарта и для испытуемого образца.

Для проверки законности дальнейших расчетов следует провести

дисперсионный анализ результатов опыта в соответствии с

табл. II.5.2, а именно должно получиться F < F(95%; f, fост) для

строк 2, 3, 4 и F > F (95%) для строки 1.

Выполнение первого условия одновременно означает, что вариации

в этих строках 2, 3, 4 должны рассматриваться как случайные, и

поэтому их следует включить в остаточную вариацию, произведя также

перерасчет значимости линейной регрессии (кстати, это относится и

к вариациям в строках 5 и 6, если они окажутся незначимыми).

Разумеется, при указанном перерасчете степени свободы вариаций,

включаемых в остаточную вариацию, должны прибавляться к числу

степеней свободы последней (fост).

Таблица II.5.1

Расположение растворов стандарта и испытуемого образца

при трехдозном варианте метода диффузии в агар

-------------------------------------------------------------------

|Номер|Порядок внесения растворов|Номер|Порядок внесения растворов|

|чашек| в цилиндры |чашек| в цилиндры |

| |--------------------------+-----+--------------------------|

| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | S | U | U | | S | U | U | S | S| U |

|1 |D1 |D2 |D2 |D3 |D1 |D2 | 17 | D1 |D2 |D3 |D1 | D3| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | S | U | U | | S | U | S | S | U| U |

|2 |D1 |D2 |D1 |D3 |D3 |D2 | 18 | D1 |D2 |D3 |D2 | D3| D1 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | U | S | U | | S | U | S | S | U| U |

|3 |D1 |D2 |D3 |D2 |D3 |D1 | 19 | D1 |D2 |D3 |D2 | D1| D3 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | U | S | U | | S | U | U | S | U| S |

|4 |D1 |D2 |D1 |D3 |D3 |D2 | 20 | D1 |D2 |D3 |D3 | D1| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | U | S | U | | S | U | U | S | U| S |

|5 |D1 |D2 |D1 |D2 |D3 |D3 | 21 | D1 |D2 |D1 |D3 | D3| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | U | S | U | | S | U | U | S | U| S |

|6 |D1 |D2 |D3 |D1 |D2 |D3 | 22 | D1 |D2 |D3 |D2 | D1| D3 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | S | U | U | | S | U | U | S | U| S |

|7 |D1 |D3 |D1 |D2 |D3 |D2 | 23 | D1 |D2 |D1 |D2 | D3| D3 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | S | U | U | | S | U | S | U | U| S |

|8 |D1 |D3 |D3 |D2 |D1 |D2 | 24 | D1 |D2 |D3 |D3 | D1| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | S | U | U | S | U | | S | U | S | U | U| S |

|9 |D1 |D3 |D2 |D3 |D2 |D1 | 25 | D1 |D2 |D3 |D1 | D3| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | U | U | U | S | U | | S | U | U | S | S| U |

|10 |D1 |D3 |D2 |D1 |D2 |D3 | 26 | D1 |D3 |D1 |D2 | D3| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | U | U | S | S | U | | S | U | S | S | U| U |

|11 |D1 |D1 |D2 |D3 |D2 |D3 | 27 | D1 |D3 |D2 |D3 | D2| D1 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | U | U | S | S | U | | S | U | S | S | U| U |

|12 |D1 |D1 |D3 |D2 |D3 |D3 | 28 | D1 |D3 |D3 |D2 | D1| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | U | S | S | U | U | | S | U | U | S | U| S |

|13 |D1 |D1 |D2 |D3 |D2 |D3 | 29 | D1 |D3 |D1 |D3 | D2| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | U | S | U | U | S | | S | U | S | U | U| S |

|14 |D1 |D1 |D3 |D2 |D3 |D2 | 30 | D1 |D3 |D3 |D2 | D1| D2 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | U | S | U | U | S | | S | U | S | U | U| S |

|15 |D1 |D1 |D2 |D3 |D2 |D3 | 31 | D2 |D3 |D2 |D1 | D2| D3 |

|-----+---+---+---+----+----+----+-----+----+----+---+---+---+----|

| | S | U | U | S | S | U | | S | U | U | S | S| U |

|16 |D1 |D2 |D3 |D2 |D3 |D1 | 32 | D1 |D3 |D1 |D2 | D3| D2 |

-------------------------------------------------------------------

Если дисперсионный анализ дал нужный результат (т.е.

выполняются указанные выше условия), то вычисляется логарифм

отношения активностей испытуемого образца и стандарта по формуле:

А

U 4 U - S

M = lg ---- = --- I ---------, (II.5.7)

A 3 L + L

S U S

где A и A - активности, соответствующие рабочим растворам, а I -

U S

логарифм знаменателя прогрессии разведения (в данном случае I =

lg 2 = 0,301). Тогда отношение активностей равно:

R = antilg M (II.5.8)

Чтобы найти отношение активностей основных растворов

а /а , надо умножить величину R на коэффициент, учитывающий

U S

соответствующие (например, максимальные) степени разведения

основных растворов стандарта и образца ("гамма " и "гамма ").

S U

Тогда имеем:

"гамма "

U

а = а R --------. (II.5.9)

U S "гамма "

S

Границы 95%-ного доверительного интервала для логарифма

отношения активностей вычисляются по формуле:

--------------------

/ 2 8 2

M = CM +/- \/(С - 1)(CM + --- I ), (II.5.10)

H, B 3

где

2 2

C = L / (L - t Sост ), (II.5.11)

2

причем L и Sост берутся из табл. II.5.2, а t - есть значение

критерия Стьюдента для Р = 95% и fост числа степеней свободы

2

величины Sост. Границы доверительного интервала для отношения

активностей (R и R ) будут антилогарифмами величин М и M, а для

H B H B

доверительных границ активности образца надо вводить коэффициент

"гамма " / "гамма " в соответствии с формулой II.5.9.

U S

Пример. II.8. Активность стандарта - 950 ЕД/мг. Основной

раствор стандарта готовят из расчета 1 мг/мл, так что a = 950

S

ЕД/мл. Учитывая, что контрольная концентрация для данного

S

антибиотика равна 1 ЕД/мл, готовят рабочие растворы стандарта D1,

S S

D2 и D3 путем разведения основного раствора в 500, 1000 и 2000

раз. Полагая, что активность испытуемого образца близка к

активности стандарта, и учитывая, что рабочие концентрации для

U U U

образца D1, D2, D3, должны быть близки к рабочим концентрациям

S S S

стандарта D1, D2, D3, основной раствор образца разводят также в

500, 1000 и 2000 раз. Количество чашек n = 6.

Результаты опыта записаны в табл. II.5.3. Там же записаны

значения Si, Ui, Tj и у, вычисленные по формулам II.5.1 - II.5.3.

По этим значениям, пользуясь формулами II.5.4 - II.5.6, получаем:

S = 3310; L = 325; Q = - 5;

S S

U = 3325: L = 345; Q = -5.

U U

Дисперсионный анализ результатов опыта представлен

в табл.II.5.4, из которой видно, что условия незначимости вариаций

в строках 2, 3 и 4 и значимости вариации в строке 1 выполняются,

что позволяет перейти к дальнейшим расчетам.

Прежде всего следует пересчитать остаточную вариацию с

включением в нее незначимых вариаций. Поскольку в данном случае

вариации незначимы не только в строках 2, 3 и 4, но и в строке 5,

последнюю тоже следует включить в остаточную вариацию. Тогда

получаем новое значение SUMост = 200,70 + 16,66 + 1,39 + 0 + 6,25

+ 225,00 при числе степеней свободы fост = 25 + 4 = 29, так что

2

Sост = 225,00/29 = 7,759. Новые результаты дисперсионного анализа

представлены в табл. II.5.5.

Таблица II.5.2

Дисперсионный анализ результатов опыта

-------------------------------------------------------------------------------------------------------

|Номер| | Число | | Дисперсия | Отношение | Табличные |

|стро-| Источник вариаций |степеней| Сумма квадратов SUM | 2 SUM | дисперсий | значения |

|ки | |свободы | | s = --- | 2 2 |F(95%,f,fост)|

| | | | | f |F = s / Sост| |

|-----+----------------------+--------+-----------------------+------------+------------+-------------|

| 1 |Линейная регрессия | 1 | 2 | 2|Отношение |Значения |

| | | |(L + L ) / 4n - L |Дисперсии s |дисперсий F|F(95%,f,fост)|

| | | | S U |получаются |получается |берутся из |

| 2 |Непараллельность | 1 | 2 2 |делением |делением |таблицы, |

| |тарируемых прямых | |(L + L ) / 2n - L |сумм квадра-|дисперсий из|имеющейся в |

| | | | S U |тов SUM на|предыдущего |руководствах |

| 3 |Квадратичная регрессия| 1 | 2 |соответству-|столбца на|по математи- |

| | | |(Q + Q ) / 12n = Q |ющие им чис-| 2 |ческой ста- |

| | | | S U |ла степеней|Sост, т.е.|тистике и |

| 4 |Различие квадратичных | 1 | 2 2 |свободы |на остаточ-|биометрии, а |

| |регрессий | |(Q + Q ) / 6n - Q | |ную диспер-|также в |

| | | | S U | |сию |сборниках |

| 5 |Между приготовлениями | 1 | 2 2 2 | | |математико - |

| | | |(S + U ) / 3n - у / 6n| | |статистичес- |

| | | | 2 2 | | |ких таблиц |

| 6 |Между чашками | n - 1 |SUM T / 6 - у / 6n | | | |

| | | | j | | | |

| 7 |Остаточная |fост = |Остаточная сумма ква- | | - | |

| | |5(n - 1)|дратов SUMост получа- | | | |

| | | |ется вычитанием сумм | | | |

| | | |квадратов всех преды- | | | |

| | | |дущих строк из пол- | | | |

| | | |ной суммы квадратов | | | |

| 8 |Полная |6 n - 1 | 2 2 | - | - | - |

| | | |SUM у - у / 6n | | | |

| | | |i,j i,j | | | |

-------------------------------------------------------------------------------------------------------

Таблица II.5.3

---------------------------------------------------------------------------

| | Стандарт | Образец | |

|Номера|---------------------------+----------------------------| Суммы |

|чашек | S | S | S | U | U | U |по каждой|

| | D1 | D2 | D3 | D1 | D2 | D3 | чашке |

|------+--------+---------+--------+--------+---------+---------+---------|

| 1 | 155 | 185 | 210 | 155 | 185 | 210 |T1 = 1100|

| 2 | 155 | 180 | 210 | 155 | 185 | 220 |Т2 = 1105|

| 3 | 165 | 190 | 215 | 160 | 190 | 215 |Т3 = 1135|

| 4 | 155 | 185 | 210 | 155 | 185 | 210 |Т4 = 1100|

| 5 | 150 | 180 | 210 | 155 | 180 | 205 |Т5 = 1080|

| 6 | 160 | 185 | 210 | 155 | 185 | 220 |Т6 = 1115|

| |S1 = 940|S2 = 1105|S3= 1265|U1 = 935|U2 = 1110|U3 = 1280|у = 6635|

---------------------------------------------------------------------------

Таблица II.5.4

------------------------------------------------------------------

| | | | | 2 | | |

|Номер | Источник |f | SUM | s | F |F (95%; f, 25)|

|строки| вариаций | | | | | |

|------+-------------+--+--------+--------+-------+--------------|

|1 |Линейная |1 |18704,17|18704,17|2329,87| 4,24 |

| |регрессия | | | | | |

|2 |Непараллель- |1 |16,66 |16,66 | 2,08| 4,24 |

| |ность прямых | | | | | |

|3 |Квадратичная |1 |1,39 | 1,39 | 0,17| 4,24 |

| |регрессия | | | | | |

|4 |Различие |1 |0 | 0 | 0 | 4,24 |

| |квадратичес- | | | | | |

| |ких регрессий| | | | | |

|5 |Между приго-|1 |6,25 | 6,25 | 0,78| 4,24 |

| |товлениями | | | | | |

|6 |Между чашками|5 |278,47 |55,69 | 6,94| 2,60 |

|7 |Остаточная |25|200,70 | 8,028 | - | |

|8 |Полная |35|19207,64| - | - | |

------------------------------------------------------------------

Таблица II.5.5

------------------------------------------------------------------

| | | | 2 | | |

|Источник вариаций |f | SUM | S | F |F (0,95%; f, 29)|

|------------------+--+--------+--------+-------+----------------|

|Линейная регрессия|1 |18704,17|18704,17|2410,77| 4,18 |

|Между чашками |5 | 278,47| 55,69| 7,18| 2,55 |

|Остаточная |29| 225,00| 7,759| - | - |

|Полная |35|19207,64| - | - | - |

------------------------------------------------------------------

Теперь по формулам II.5.7 - II.5.11 вычисляем:

4 3325 - 3310

M = --- 0,301 ----------- = 0,008985, R = 1,021;

3 345 + 325

2000

а = 950 х 1,021 х ----- = 970 (ЕД/мл);

U 2000

2

С = 18704,17 / (18704,17 - 2,045 х 7,759) = 1,0012

(t(95%,29) = 2,045),

M = 0,0090 +/- 0,0170 [- 0,0080; 0,0260];

H, B

R = [0,9817; 1,062];

Н, В

нижн 2000

а = 950 х 0,9817 х ---- = 933 (ЕД/мл);

U 2000

верх 2000

а = 950 х 1,062 х ---- = 1009 (ЕД/мл).

U 2000

III. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

С АЛЬТЕРНАТИВНЫМИ РЕАКЦИЯМИ

III.1. ОЦЕНКА И СРАВНЕНИЕ ПОРОГОВЫХ ДОЗ

ПРИ ИХ ПРЯМОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ

При испытаниях некоторых препаратов результат их действия

учитывается не в количественной, а в альтернативной форме (наличие

или отсутствие эффекта - гибели, судорог и т. д.; иногда это

называют реакцией "все или ничего"). В ряде случаев может быть

получена величина эффективной (пороговой) дозы ЕД для каждого

отдельного препарата: фиксируют ту дозу, при которой получается

ожидаемый эффект. Тогда оценкой эффективной дозы для данного

препарата может служить среднее значение по достаточно большой

группе животных. При расчетах найденные индивидуальные эффективные

дозы ЕД заменяются их логарифмами х = lg ЕД, ибо распределение

этих логарифмов обычно ближе к нормальному, чем распределение

самих доз. После того как вычислены значения

_

x = SUM х/n; (III.1.1)

------------

/ _ 2

/ SUM (х - х)

х = x +/- t(P, f) s_ = х +/- t(P, f) / -------------,

H,B х \/ n (n - 1)

(III.1.2)

находят доверительные границы для эффективной дозы:

ЕД = antilg (х ). (III.1.3)

H, B H, B

Величина t(P, f) ищется для числа степеней свободы f = n - 1.

Вычисление эквивалентной эффективной дозы и ее доверительных

границ производится по формулам:

_ _0

М = х - х ; (III.1.4)

---------

/ 1 1

M = M +/- t(P, f) x s / --- + ---, (III.1.5)

H, B / 0 n

\/ n

_0 0 0 _

x = SUM x / n ; x = SUM x/n; (III.1.6)

-----------------------------

/ 0 _ 2 _ 2

/ SUM ( х - х) + SUM (х - х)

/ ------------------------------, (III.1.7)

s = / 0

\/ n + n - 2

0

a t(P, f) ищется для числа степеней свободы f = n + n - 2.

Доверительные границы для отношения эквивалентных эффективных доз

равны:

0

(ЕД /ЕД) = antilg (2 +/- M ). (III.1.8)

H, B H, B

Если рассматриваемый эффект не является необратимым, то лучше

использовать одну группу тест - объектов, применяя к каждому из

них сначала один препарат, а затем после интервала, необходимого

для полного восстановления начального состояния, другой. Получив

для каждого тест - объекта разность логарифмов пороговых доз

0

"ДЕЛЬТА" = х - х , вычисляют:

______

M = "ДЕЛЬТА" = SUM "ДЕЛЬТА" / n; (III.1.9)

-------------------------------------

/ ______ 2

M = M +/ - t \/ SUM ("ДЕЛЬТА" - "ДЕЛЬТА") / n(n - 1),

H, B P (III.1.10)

причем t(P, f) ищется для числа степеней f = n - 1. Такая

постановка испытания позволяет уменьшить влияние изменчивости

исходных состояний и параметров тест - объектов и приводит к

сужению доверительных интервалов. При этом целесообразно разбить

группу тест - объектов на две примерно равные подгруппы с тем,

чтобы одна из них получала сначала стандартный, а затем испытуемый

препарат, а другая подгруппа - наоборот. Этим обеспечивается

лучшая рандомизация.