1.3.3. Обґрунтування вибору біологічного агента

При виборі біологічного агента, як продуценту біологічно активної речовини слід керуватися його здатністю до синтезу цільового продукту. Також, необхідно враховувати економічні характеристики і показники, які суттєво впливають на вартість виробництва та собівартість кінцевого продукту. Додатково треба розглядати дані щодо тривалості процесу біосинтезу і культивування, так як їхні значення суттєво впливають на доцільність і вигідність виробництва.

Продуцентом антибіотика гентаміцину є Micromonospora purpurea. Росте на дешевих та простих середовищах. Здатен засвоювати крохмаль, глюкозу, сахарозу, мальтозу, арабінозу, ксилозу. M. purpurea має набір ферментів, що |клітині| забезпечує також всі необхідні життєві процеси. Утворює протеолітичні ферменти — протеази, амілази|, за допомогою яких культури розкладають білки тваринного і рослинного походження, глюкозу та інше. Аєроб [7].

Даний продуцент здатний до надсинтезу антибіотика і є єдиним промисловим продуцентом. Аналогічних йому мікроорганізмів не існує, як природних так і генно-інженерних штамів. Проте відомо декілька штамів цього мікроорганізму які здатні синтезувати гентаміцин, г/л :

• M. purpurea ТСС 31849 – 0,452;

• M. purpurea ВНИИА 7R – 0,215;

• M. purpurea 5309/5АБ – 0,347;

• M. purpurea N 1931 – 0,385

Отже, для вибору біологічного агенту слід керуватися його синтезу вальною здатністю. Обираючи з поміж представлених штамів можна відмітити штам M. purpurea ТСС 31849. Тип вирощування штамів та поживні середовища суттєво не відрізняються, тому економічно доцільніше обрати саме цей штам.

1.3.4. Обґрунтування вибору складу поживного середовища

Для синтезу всіх клітинних компонентів мікроорганізмам потрібні поживні речовини з яких мікроорганізми будують свою клітину. Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, повинні відповідати таким мінімальним вимогам: в них повинні бути присутні всі елементи, з яких будується клітина, причому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати.

Основні потреби в джерелах живлення для біосинтезу антибіотика має велике значення для кінетики утворення гентаміцину. Для промислового отримання антибіотиків середовище повинно бути дешевим і разом з тим повинен забезпечуватися високий рівень біосинтезу антибіотика і відносно легке його виділення. Для одержання гентаміцину використовують прості, натуральні середовища.

Для визначення впливу джерел вуглецю на виробництво гентаміцину, були проведені дослідженя. Глюкоза, як основне джерело вуглецю була замінена єквівалентною кількістю інших джерел вуглецю: фруктоза, мальтоза, лактоза, сахароза, крохмаль, декстрин, патока, гліцерин [14].

Таблиця 1.1

Номер	Джерело карбону (г/л)	Джерело нітрогену (г/л)	Макроелементи (г/л)	Мікроелеме-нти (г/л)	Концентрація Гента-міцину (г/л)
1	D-глюкоза (1) Крохмаль (24)	Мясний екстракт(3) Дріжжовий екстракт(5)	-	-	290
2	Крахмаль(20) D-глюкоза(1)	Мясний екстракт (10) Дріжжовий екстракт (10) Казеїн (50)	CaCO3 (5)	CoCl2 (0,02)	312
3	Крахмаль(30)	Пептон(10)	NaNO3 (4) K2HPO4 (2) KCl (1)	FeSO4(0,02) CoCl2 (0,001)	328
4	D- ксилоза(5)	Соєве борошно(10)	CaCO3 (1) NaCl (2,5)	-	334
5	D-глюкоза (10)	Соєве борошно (5)	CaCO3 (4) K2HPO4(1)	FeSO4(0,03) CoCl2 (0,001)	345
6	Сахароза (20)	NH4Cl(4)	MgSO4·7 H2O (0,02) CaCO3 (10) K2HPO4 (1) NaCl (3)	MnSO4·7 H2O (0,01) ZnSO4·H2O (0,03) FeSO4 (0,03) CoCl2 (0,001)	295

Вплив різних джерел вуглецю на зростання концентрації антибіотика було показано в таблиці 1.1 Проаналізувавши дані таблиці видно, що максимальна концентрація гентаміцину (345 мг/л) була отримана при використанні середовища під номером 5 на пятий день культивування після чого концентрація зменшувалась від 334 мг/л до 290 мг/л [14].

Крохмаль був визнаний кращим джерелом вуглецю для виробництва гентаміцину. Темпи зростання були аналогічними, але концентрація гентаміцину була знижена, коли мальтоза була використана як джерело вуглецю замість крохмалю. Лактоза, фруктоза і сахароза також підтримує високі темпи зростання, але гентаміцину утворюється менше. Концентрація гентаміцину була максимальною 429 мг/л, коли концентрація крохмалю становила 7,5 г/л. Максимальний ріст клітин (8,1 г/л) спостерігалась у середовищі з (12,5 г /л) крохмалю [13].

Здатність продуцента гентаміцину використовувати крохмаль пов’язана з наявністю потужного ферментаційного апарату. Вивчення ферментаційної системи M. purpurea ТСС 31849 показало, що вона включає фермент амілазу, яка утворюється на середовищі як з глюкозою, та з крохмалем. Однак на середовищі, яке містить крохмаль, активність амілази вища, ніж на середовищі з глюкозою.

Вплив різних джерел азоту. Соєве борошно і глютамат натрію є найкращими джерелами азоту для виробництва гентаміцину, але ріст клітин менш, коли глютамат натрію був використаний в якості єдиного джерела азоту. Неорганічний азот джерел, таких як (NH₄)₂S0₄, NH₄С1, NH₄NO₃ були менш ефективні в порівнянні з органічними джерелами азоту, такі як дріжджовий екстракт, соєве борошно, казеїн, сечовина, глутамат натрію, екстракт яловичини (пептон).

Використання дріжджового екстракту було сприятливими для зростання, але не для синтезу антибіотика. Таким чином, соєве борошно було обрано в якості джерела азоту. Використання складних білкових сполук в рослинних продуктах (соєве борошно) пов’язано з діяльністю активних протеолітичних ферментів. Вплив різних джерел нітрогену на зростання концентрації гентаміцину було показано в таблиці 1.2

Таблиця 1.2

Назва	Швидкість зростання (мг/год)	Кількість днів	Концентрація антибіотика (мг/г)	Кількість днів
Глутамат натрію	37	2	393	5
Соєве борошно	73,5	4	435	5
М’ясний екстракт	80,2	4	328	5
Дріжджовий екстракт	36,9	3	325	5
Казеїн	52	6	354	9
Сечовина	51,3	4	275	6
(NH4)2S04	43	3	271	6
NH4С1	29	3	275	8

Обов’язковим елементом для культивування продуценти гентаміцину є наявність в середовищі фосфору.

Вплив різних концентрацій фосфатів. При концентрації фосфатів 1.2 г/л, утворюється максимальна концентрації гентаміцину 452 мг/л. Концентрація 1.0 г/л фосфату виявилася оптимальною для росту клітин 7,1 г/л. Синтез гентаміцину сильно гальмується при концентрації нижче 0,2 г/л і вище 2 г/л [4].

При використанні середовища даного складу були отримано максимальну концентрацію антибіотика (410 мг/л), концентрація біомаси становила 6,5 г/л [13].

Середовище, яке використовують для промислового отримання гентаміцину:

Крохмаль	20 г/л
Соєве борошно	12 г/л
CaCO3	4 г/л
K2HPO4	1,2 г/л
FeSO4	0,05 г/л
CoCl2	0,001 г/л

Розрахунок складу поживного середовищ

Розрахунок вмісту в середовищі джерела вуглецевого живлення

Потреби для синтезу гентаміцину. Як джерело вуглецю для одержаннягентаміцину використовується крохмаль.

Розрахуємо, скільки вуглецю (за елементом С) міститься в 0,41г гентаміцину. Молекулярна маса гентаміцину [C₁₉H₃₇N₅O₇] становить477. Отже, у477г гентаміцину міститься 228 г вуглецю, а в 0,41 г гентаміцину (228 × 0,41) / 477 = 0,196 г вуглецю.

Далі розрахуємо, у скількох грамах крохмалю міститься 0,196 г вуглецю. Отже, у 162 г крохмалю міститься 72 г вуглецю, а 0,196 г вуглецю міститься у (162 × 0,196) / 72 = 0,44 г крохмалю.

Враховуючи, що при вирощуванні мікроорганізмів на вуглеводах близько 40% субстрату окислюється до СО₂для одержання енергії, необхідної для конструктивного метаболізму, вміст крохмалю у середовищі становитиме (0,44 × 0,4) + 0,44 = 0,616 г/л.

Потреби для синтезу біомаси. У біомасі міститься 50% вуглецю, отже вміст вуглецю у 6,5 г біомаси становить 6,5 × 0,5 = 3,25 г. Ця кількість вуглецю міститься у (3,25 × 162) / 72 = 7,31 гкрохмалю.

Враховуючи 40% втрат субстрату на “холосте окислення”, для одержання 6,5 г/л біомаси у середовище необхідно внести (7,31 × 0,4) + 7,31 = 10,2 г/л крохмалю.

Отже, загальний вміст крохмалю в середовищі, необхідний для синтезу біомаси (6,5 г/л) та генміцину (0,41 г/л), становить 10,2 + 0,616 = 10,8 г/л.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення

Потреби для синтезу біомаси.Припустимо, що у біомасі міститься 10 % азоту. Таким чином, у 6,5 г біомаси вміст азоту (за елементом N) становить (6,5 × 0,10) = 0,65 г.

Соєве борошно є джерелом органічного азоту, який засвоюється продуцентом гентаміцину.

Таким органічним азотом є амінний азот і частково білковий (зокрема, коротколанцюгові поліпептиди). У ньому міститься близько 43 % білків. Для хімічного складу білків характерний постійний середній вміст нітрогену - біля 16%.

Далі розрахуємо, у скількох грамах білку міститься 0,65 г нітрогену.

Отже, у 100 г білку міститься 16 г нітрогену , тоді 0, 65 г нітрогену міститься в ( 100 × 0,65 ) / 16 = 4,06 г білку.

У перерахунку на соєве борошно одержимо 9,44 г/л.

Потреби для синтезу гентаміцину.Розрахуємо, скільки нітрогену (за елементом N) міститься в 0,41г гентаміцину. Молекулярна маса гентаміцину [C₁₉H₃₇N₅O₇] становить477. Отже, у477 г гентаміцину міститься 70 г нітрогену, а в 0,41 г (0,41 × 70) / 477 = 0,06 г нітрогену.

Отже, у 100 г білку міститься 16 г нітрогену , тоді 0,06 г нітрогену міститься в ( 100 × 0,06 ) / 16 = 0,375 г білку. У перерахунку на соєве борошно одержимо 0,872 г/л.

Отже, загальний вміст соєвого борошна в середовищі, необхідний для синтезу біомаси (6,5 г/л) та генміцину (0,41 г/л), становить 9,44 + 0,872 = 10,8 г/л.

Розрахунок вмісту фосфору у середовищі

У біомасі міститься близько 3% фосфору (за елементом Р). Отже, для синтезу 6,5 г/л біомаси вміст фосфору у середовищі повинен становити 6,5 × 0,03 = 0,195 г/л. Джерелам фосфору у промисловому виробництві гентаміцину є двозаміщений калій фосфорнокислий – К₂НРО₄.

Далі розрахуємо, у скількох грамах К₂НРО₄ міститься 0,195 г фосфора.

Отже, у 174 г – К₂НРО₄міститься 31 г фосфора , тоді 0,195 г фосфору міститься в ( 174 × 0,195 ) / 31 = 1,09 г К₂НРО₄.

Розрахунок вмісту заліза у середовищі

У біомасі міститься близько 0,2% заліза (за елементом Fe). Отже, для синтезу 6,5 г/л біомаси вміст заліза у середовищі повинен становити 6,5 × 0,002 = 0,013 г/л. Джерелаом заліза у промисловому виробництві гентаміцину єFeSO₄ .

Отже, у 152 г FeSO₄ – міститься 56 г заліза , тоді 0,013 г феруму міститься в ( 152 × 0,013 ) / 56 = 0,035 г FeSO₄ .

Інші компоненти середовища

Джерелами таких необхідних елементів для росту продуцента є соєве борошно. Мінеральний склад багатий та різноманітний, зольні елементи становлять 4,5 −6,5% . Серед них − кальцій, магній, натрій, залізо, кремній, сірка, хлор, мідь, марганець, цинк, нікель. Містяться вітаміни групи В, D, А.

Отже, проаналізувавши необхідну кількість основних елементів і розрахувавши потрібну кількість компонентів можно зробити висновок про достатність даного поживного середовища для потреб штаму у рості та синтезу гентаміцину.