1.3.6. Обгрунтування стадій виділення і очистки гентаміцину

Після процесу ферментації об’єм культуральної рідини, що містить позаклітинний антибіотик становить 7 м³. Культуральна рідина містить як цільовий продукт так і залишки клітин, поживного середовища та метаболітів життєдіяльності клітин. Задля виділення і очистки цільового продукту культуральна рідина повинна пройти наступні технологічні стадії:

1. Відділення біомаси;

2. Підкислення супернатанту;

3. Екстракція гентаміцину;

4. Концентрування;

5. Сушіння.

Вибір способу відділення біомаси та обладнання

Відразу після завершення процесу культивування культуральну рідину зливають з ферментера. Першочергово постає завдання розділення неоднорідної системи. Існує два основні способи розділення неоднорідних систем ­– це фільтрація та осадження [26].

Розглядаючи процес фільтрації, можна відмітити ряд переваг цього методу над осаджуванням, а саме :

• Можливість повного видалення твердих часток із рідини;

• Менші енерговитрати;

• Простота методу;

• Селективність.

Проте, процес фільтрування недоцільно застосовувати при розділенні фаз в культуральній рідині в даному випадку через високу ступінь насиченості рідини та можливість використання більш дешевого способу. Тож, для розділення компонентів культуральної рідини для одержання гентаміцину слід застосовувати метод осадження. До найважливіших технічних способів осадження належать [26]:

• Відстоювання;

• Осадження під дією центробіжної сили.

Метод відстоювання не практичний у даному випадку, він досить тривалий та малоефективний/не продуктивний. Оптимальним є метод відстійного (осаджувального) центрифугування, яка має ряд переваг :

• Висока продуктивність;

• Відносно низька тривалість процесу;

• Можливість варіювати розмір розділювальних часток;

• Можливість застосування для суспензій з високою концентрацією твердих частинок.

Осаджувальні центрифуги застосовуються для розділення суспензій з об’ємною концентрацією твердої фази до 40%, як складається з часток від 0,5 мкм до 10 мм. У результаті центрифугування виходить осад з деяким вмістом рідкої фази та освітлена рідина, що називається фугатом [26].

Відцентрові центрифуги поділяються в залежності від :

• Принципу дії (періодично діючі та безперервно діючі)

• За способом вивантаження матеріалу (ручні та механічні)

• За розташуванням валу ( вертикальні, горизонтальні, похилі)

• Ступенем розділення суспензії.

Для тонкодисперсних систем застосовують ультрацентрифуги з роздільною здатністю 0,5-1,5 мкм, проте, вартість такої центрифуги є досить високою і це значною мірою вплине на собівартість кінцевого продукту. Експериментальним шляхом вчені встановили можливість використання звичайних центрифуг. Загальний вигляд центрифуги зображено на рис. 1.1.

Рисунок 1.1. Загальний вигляд центрифуги.

1 – завантажувальний лоток; 2 – механізм зрізу осаду; 3 – металоконструкція; 4 – вал; 5 – корпус підшипників; корпус приводу; 7 – електродвигун; 8 – гумова муфта; 9 – стрічкове гальмо; 10 – гумовий амортизатор; 11 – привід; 12 – кришка кожуха; 13 – кожух; 14 – ротор [27].

Потужність центрифуг характеризується за фактором розділення. Для ультрацентрифуг це значення більше 3500, для нормальних центрифуг – до 3500. Як раніше було вказано, для відділення біомаси не потрібна велика потужність та високий ступінь розділення, тому достатньо буде центрифуги типу АГ-600-4, з фактором розділення 2090 та частотою оберту діючого механізму до 2500 об/хв.

Підкислення фугату

Після центрифугування фугат перекачують до збірної ємності, об’єм збірника залежить від кількості фугату та кількості використовуваної кислоти (HCl), необхідно обрати збірник з запасом – об’ємом 16 м³.

Для ефективнішого перебігу процесу екстракції рифаміцину проводять підкислення середовища до значення рН 2,0. Підкислення розчину краще проводити 2 N соляною кислотою (HCl). Соляна кислота має широкий спектр застосування та виробляється у великих об’ємах в світі, що робить її однією з найдешевших неорганічних кислот. Також, кількість 2N HCl необхідна для доведення значення рН 2,0 фугату є невисока, що значно економить кошти при закупівлі реагентів.

Вибір способу проведення екстракції та екстрактора

Оптимальним способом виділення антибіотику є екстракція, цей процес не потребує значних витрат енергії та не заснований на підвищенні температури і широко застосовується у біотехнологічних процесах. Основні питання які необхідно вирішити для проведення екстракції це вибір розчинника, вибір виду, способу екстракції та самого екстрактора [26].

Екстракція буває одно- та багатоступенева. Багатоступенева екстракція проводиться з метою кращого відділення цільового продукту з розчину до розчинника. Одноступнева (одноразова) екстракція проводиться з використанням ефективних розчинників, які б дозволили за один раз виділити максимально велику кількість цільового продукту з водного розчину [26]. Враховуючи вартість і кількість розчинника, а саме 13 м³ на одну екстракцію, доцільніше проводити одноразову екстракцію, що суттєво знизить вартість вихідної продукції, навіть, враховуючи втрати цільового продукту, що залишиться у водній фазі. Якщо ж, в лабораторних умовах для максимального виділення цільового продукту з суміші проводять екстракцію в три ступені, то за рахунок встановленого в екстракторі перемішуючого пристрою ми можемо досягти значного виділення гентаміцину, навіть при одноразовому процесі. При чому, необхідно контролювати вміст гентаміцину у водній фазі, значення має наближатися до 0, тоді ми будемо впевнені у ефективності проведення даного процесу.

Одноступенева екстракція поділяється на періодичну і безперервну [26]. Обидва варіанти зображені на рис. 1.2.

Рисунок 1.2. Схема однократної екстракції, проведеної періодичним (а) або безупинним (б) способом.

Безперервний спосіб забезпечує більшу швидкість процесу та можливість використання невеликих за розміром апаратів, проте періодичний спосіб є більш простим та ефективним. До того ж, застосувати на практиці безперервний спосіб екстракції є складним завданням, через неможливість ефективного протікання процесу відстоювання і розшарування систем, тому процес екстракції необхідно проводити одноступеневим періодичним способом [26; 27].

Для здійснення одноступеневої екстракції можна використовувати один апарат, в якому будуть проходити змішування, а потім розділення. Для проведення екстракції необхідно обрати екстрактор з перемішуючим пристроєм, що характеризує потужність екстрактору, чим краще буде проходити процес змішування фаз тип продуктивніше буде стадія екстрагування. Однак, в даному випадку не потрібні високі швидкості оберту мішалки, цілком достатньою буде швидкість у 150-200 об/хв. Об’єм екстрактора повинен дорівнювати сумі фугату та розчинника з урахуванням запасу (коефіцієнт заповнення 0,8), тобто об’єм екстрактора становить 20 м³. Під час процесу відстоювання екстрагент (етилацетат) буде верхньою фазою (за рахунок меншої густини), а водна фаза буде знаходитись знизу апарата. Після завершення процесу водна фаза зливається першою (R, як зображено на рис. 2) і слідом за нею через інший трубопровід зливається екстракт до збірника [26].

Обгрунтування вибору розчинника

Основні вимоги, що висуваються до розчинників [26]:

• Вибірність стосовно цільового компонента;

• Висока екстракційна ємність за цільовим компонентом;

• Легко здійснювана реестракція;

• Добре розшарування фаз;

• Безпека при роботі;

• Низька вартість.

Основною ж вимогою до розчинника є його селективна здатність та нерозчинність у суміші яку ми екстрагуємо. Із літературних джерел відомо, що екстракцію гентаміцину здійснювали водою (з твердої фази) та різними органічними розчинниками, такими як метанол, етилацетат, бутилацетат та ізопропанол [3; 4; 5]. Воду, як розчинник, в даному випадку, використовувати не можливо, так як водою екстрагували гентаміцин з твердої фази, що не відповідає нашому технологічному процесу. Серед ряду органчіних розчинників за ефективністю вирізняється етилацетат, до того ж як екстрагент при екстракції гентаміцину частіше за інші розчинники застосовують саме його, за рахунок наступних його переваг [31]:

• Відносно низька вартість;

• Безпечність;

• Нетоксичність;

• Висока екстракційна ємність;

• Легкість випарювання.

Це безбарвний органічний розчинник з приємним солодкуватим смаком, не є токсичним, не розчиняється у воді (густина етилацетату становить 0,901 г/см³). Задовільняє усі вищезазначені вимоги. Існує 2 марки етилацетату – марка А та марка Б. Марка А в свою чергу поділяється на вищий сорт та перший сорт. Для проведення більш ефективного процесу екстракції слід використовувати етилацетат вищого сорту марки А [31]. Орієнтовна вартість 1 м³ етилацетату на ринку України коливається від 15 тис. грн. до 16,5 тис. грн. В порівнянні з цінами на інші органічні розчинники етилацетат є більш дешевим. Так, вартість бутилацетату становить близько 30 тис. грн. за 1 м³, метилацетату – 16-18 тис. грн., циклогексанолу – 85-90 тис. грн.

Кількість етилацетату необхідна для екстракції гентаміцину дорівнює кількості фугату, а саме ~ 13 м³. Тобто, загальна вартість етилацетату який необхідний для проведення екстракції становить приблизно 195 тис. грн.

Вибір способу концентрування цільового продукту та обладнання

Наступним завданням є концентрація цільового продукту. Існують два основні способи концентрування речовин, а саме, це фільтрація, до якої відносять ультрафільтрацію, зворотній осмос, тощо, та упарювання розчинів. Застосування фільтрації в даному випадку не є доцільним, через високу вартість процесу, низьку швидкість протікання процесу та відносно низьку ефективність. Натомість, процес випарювання є доцільним через свою простоту, швидкість, ефективність та легкість випарювання органічного розчинника. Існує три види випарювання [26]:

• Під надлишковим тиском;

• При атмосферному тиску;

• Під вакуумом.

При використанні вакуумного способу знижується температура кипіння розчину, що дозволяє ефективно проводити видалення вологи з розчинів термолабільної природи. Також цей спосіб є більш економним та доцільним в даному випадку.

Найбільше поширення в промисловості отримали випарні апарати, які нагріваються водяною парою. Так як, водяна пара володіє високою питомою теплотою конденсації й високим коефіцієнтом тепловіддачі [26; 32].

Вакуум-випарні установки класифікують за способом дії – установки неперервної і періодичної дії, за кількістю корпусів розрізняють однокорпусні і багатокорпусні, за конструктивним виконанням нагрівальних поверхонь – установки з трубчастими і пластинчастими калоризаторами; в залежності від нагрівального агента – установки з паровим, аміачним і фреоновим обігрівом; від умов кипіння продукту – циркуляційні і плівкові.

Використання багатокорпусних випарних апаратів має деякі переваги над однокорпусними, проте, дана технологія дозволяє використовувати більш прості випарні установки без суттєвих відмінностей результатів. Тому дешевше і доцільніше використовувати однокорпусний випарний апарат [32].

На промислових підприємствах використовують два типи вакуум-випарних апаратів: вертикальні та горизонтальні. Вони можуть мати різні видозміни в конструктивному плані. Найтиповішим є вертикальний апарат з підвісною випарною камерою (рис. 1.3). Він, також, є відносно не дорогим та існують апарати з різними об’ємами. Від десятків літрів до десятків кубічних метрів. Підвісна випарна камера дозволяє більш ефективно вилучати тверді частинки з пари.

Рисунок 1.3. Вакуум-випарний апарат з підвісною випарною камерою.

Основним критерієм потужності випарних апаратів є їхня випарна спроможність – кількість випареного розчинника за годину. Потужність випарювачів залежить від об’єму випарної камери в ньому. На ринку представлені найбільші вакуум-випарні апарати з робочим об’ємом до 2 м³. Випарна потужність апарату даного типу досягає 2,5-2,8 м³/год.

Вибір способу сушіння та сушарки

Після випарювання ми одержуємо концентрат гентаміцину. Наступною метою є одержання сухого порошку гентаміцину з дуже низьким вмістом вологи (до 2%). Основним раціональним способом досягнення даної мети є використання методу сушіння. Існує цілий ряд методів сушіння речовин [26; 27; 32]:

• Конвективне сушіння;

• Контактне сушіння;

• Терморадіаційне;

• Сушіння при нагріванні струмами високих частот;

• Акустичний метод сушіння;

• Сублімаційне сушіння і ін.

Усі ці методи мають свої переваги та недоліки, орієнтовані на специфічні речовини та технологічні процеси, однак, при виборі способу сушіння слід керуватися, насамперед, властивостями цільового продукту та можливістю використання того чи іншого типу сушіння. Відомо, що температура руйнування молекули гентаміцину приблизно 80 °С. Найбільш ефективна сушарка яка дозволяє проведення процесу сушіння речовин є розпилюючи сушарка (рис. 1.4). Температура сушіння в них становить 50-60 °С, сушильний агент має значно вищу температуру – до 120 °С, але при контакті дрібних частинок сушильного агента з цільовим продуктом температура знижується до 50-55 °С, що ніяк негативно не впливає на фізико-хімічні властивості гентаміцину. За рахунок великої питомої поверхні утворених дрібних крапель швидкість процесу сушіння досить висока. Така сушарка обладнана фільтром, що дозволяє затримувати часточки цільового продукту які знаходяться у парі [26].

Рисунок 1.4. Схема розпилювальної сушарки.

1 – камера, 2 – рукавні фільтри, 3 – розпилюючий диск, 4 – вентилятор,

5 – шкребки.

Головний механізм даного апарату це розпилюючий диск (розпилюючи форсунки). Продуктивність розпилюючих форсунок в сушарці коливається від 5 до 500 кг/год продукту, в залежності від об’єму апарату. Для одержання необхідної кількості сировини, а саме – 3,5 кг гентаміцину за один цикл, достатнім буде апарат з найменшою потужністю, що суттєво зекономить кошти на придбанні обладнання.