Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

позитивна, справа - негативна

а - па склі, 6 -у пробірках; зліва -

сироватка хворого реагує з конкретним мікробним антигеном, це оз­ начає, що в сироватці є антитіла проти даного мікроорганізму, отже саме він викликав захворювання. Вид збудника, виділений із патологіч­ ного матеріалу, визначають за допомогою відомої імунної сироватки.

Відповідно до цього, в серологічних реакціях завжди використову­ ють один компонент стандартний, інший, який виявляють, одержу­ ють від хворого. Так, для серологічної діагностики беруть стандартні антигени (діагностикуми), суспензії інактивованих, рідше живих, бак­ терій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному розчині. Для серологічної ідентифікації застосовують стандартні імунні сироватки. їх одержу­ ють шляхом імунізації тварин відповідними бактерійними чи вірусними антигенами, в результаті якої в крові проти них з’являється значна кількість антитіл. Одержавши сироватку крові імунізованої тварини і очистивши від баластних речовин, її використовують як імунну сироватку. При одержанні такої сироватки визначають її титр - най­ більше розведення, в якому ще проявляється реакція з відповідним антигеном. Набори із різноманітних діагностикумів та імунних діагнос­ тичних сироваток є в кожній бактеріологічній лабораторії.

Реакція аглютинації (РА). У реак­ ції аглютинації антиген знаходиться у вигляді корпускулярних частинок. Такими корпускулами можуть бути суспензії бактерій, клітин, частинок (латекс, бентоніт), на яких адсорбова­ но антиген. При додаванні специфічної імунної сироватки клітини або частин­ ки злипаються, утворюючи візуально видимі пластівці, які згодом опадають в осад. Механізм реакції полягає в тому, що під впливом іонів електролі­

ту зменшується негативний поверхне­

Рис 52. Реакція аглютинації:

вий заряд бактерійних клітин, і вони можуть зблизитись на таку відстань, при якій між ними виникає аглютинація бактерій. Реакцію проводять

у пробірках, лунках пластмасових планшет або на склі (рис. 52). Антитіла в реакції аглютинації називаються аглютинінами, анти­

гени - аглютиногенами, а осад, який утворюється, - аглютинатом. За характером аглютинату розрізняють дрібнозернисту і крупнозернисту аглютинацію. Дрібнозернистий осад спостерігається, коли

210

бактерії під впливом антитіл до О-антигена склеюються між собою тілами. Аглютинат утворюється досить повільно у вигляді дрібних компактних зерен. Такий тип аглютинації властивий нерухомим бактеріям.

Крупнозерниста аглютинація має місце у джгутикових бактерій за рахунок склеювання бактерій антитілами проти джгутикового Н-ан- тигена. Аглютинат утворюється досить швидко із великих пластівців.

Постановка РА. Існує дві різновидності постановки реакції: орієн­ товна аглютинація на склі й розгорнута аглютинація в пробірках.

Реакція аглютинації на склі.На предметне скло наносять розділь­ но 2 краплі специфічної сироватки і краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. В краплю ізотонічного розчину й одну з крапель сироватки бактеріологічною петлею вносять досліджувану культуру й ретельно її розмішують. Після внесення культури в одну із крапель необхідно простерилізувати петлю, знову набрати культуру і внести її У Другу краплю. Крапля сироватки, куди не вносили культури, є контролем сироватки.

Реакція проходить досить швидко при кімнатній температурі. Якщо контрольна крапля сироватки залишається прозорою, в краплі ізотонічного розчину - рівномірне помутніння, а в краплі, де культура змішана з сироваткою, з ’являються зернистість або пластівці, реак­ ція вважається позитивною.

Проте орієнтовна реакція аглютинації дозволяє зробити лише по­ передній висновок про виділену культуру, тому що багато бактерій мають спільні антигени.

Щоб остаточно підтвердити або відкинути попередній висновок ставлять розгорнуту реакцію аглютинації. Діагностичні аглютинуючі сироватки, які одержані шляхом гіперімунізації тварин, мають великий титр (1:1600 - 1:40000 і вище) (табл. 5).

Спочатку готують робоче розведення сироватки (1:50 або 1:100), із якого в подальшому одержують двократні розведення від 1:100 до титру, вказаного на ампулі з сироваткою. Для цього в ряд пробірок розливають по 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, потім у першу пробірку вносять такий же об’єм сироватки робочого розведен­ ня і після перемішування 1 мл переносять у другу пробірку, звідти в третю і т.д., а в передостанню пробірку вносять 1 мл сироватки робочого розведення. В останню пробірку сироватку не вносять. Потім у всі розведення і в останню пробірку додають по дві краплі досліджувальної культури.

211

Таблиця 5

Постановка розгорнутоі реакції аглютинації для ідентифікації культури ентеропатогенної кишкової палички

				Пробірки					Контроль
Компоненти	1		2	3	4	5		6	сиро­	анти­
0,85 % розчин хло­									ватки	гена
									.
риду натрію (мл)	1,0		1,0	1,0	1,0	1,0		1,0		1.0
ОК-колі сироватка в										_
розведенні 1:50 (мл)	1,0		1.0 ->	1,0	1,0 ->	1,0-»		1,0 і	1,0
Розведення сиро­
ватки	1:100		1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200		1:100
Завись кишкової	2		2	2	2	2		2		2
палички (краплі)
	Термостат 37 °С 2 год; 18 °С 18 год							І........
Результат	|	|	|		,	і ........ і	.

Контрольні пробірки - дві останні. Передостання - контроль сиро­ ватки, остання - контроль антигена. Після струшування штатив із пробірками ставлять у термостат при 37 °С на дві год і при кімнатній температурі до наступного дня, потім проводять облік Якщо реакція виявилась позитивною до титру або, принаймні, до половини титру, вона вважається достовірною.

Розгорнуту реакцію аглютинації ставлять і при серологічній діаг­ ностиці захворювання. Тільки в цьому випадку роблять ряд послідовних розведень сироватки хворого (1:100 - 1:1600) і до кожного розведення додають по дві краплі діагностикуму.

Для одержання сироватки натще у хворого із ліктьової вени шпри­ цем у пробірку беруть 3-5 мл крові, вміщують її в термостат на ЗО хв. Утворений згусток відділяють від стінок пробірки петлею або скляною паличкою, потім ставлять у холодильник на 30-40 хв для ретракції згустку. Стерильною пастерівською піпеткою відсмоктують сироватку в окрему пробірку і готують робоче її розведення 1:50 об’ємним або крапельним способом. Приготовлене робоче розведення сироватки ви­ користовують для постановки реакції аглютинації.

Можна брати кров із пальця (до 1 мл), а в дітей - з мочки вуха або п’ятки.

При деяких інфекційних захворюваннях реакції аглютинації, що вживаються з діагностичною метою, мають свої назви: при черевному тифі - реакція Відаля, при бруцельозі - реакція Райта, висипному тифі - реакція Вейгля.

212

Реакція непрямої (пасивної) аглютинації. Реакція непрямої (па­ сивної) аглютинації за своєю чутливістю значно перевищує звичайну реакцію аглютинації і дозволяє виявити мінімальну кількість антитіл і антигенів. Така висока чутливість досягається завдяки адсорбції анти­ генів або антитіл на спеціальних інертних частинках (латекс, бентоніт) або клітинах (еритроцити). Якщо антигени адсорбовані на еритроци­ тах, така реакція називається реакцією непрямої (пасивної) гема­ глютинації (РИГА).

Навантажені антигеном еритроцити склеюються в присутності спе­ цифічних антитіл і випадають в осад у вигляді конгломератів (пере­ вернутої “парасольки”) на дні пробірок або лунок.

Антигени для РНГА називаються еритроцитарними діагностикумами. Це стандартні препарати, які складаються з антигенів різних бактерій і вірусів, адсорбованих на поверхні еритроцитів. За допомогою еритроцитарних діагностикумів можна виявляти в сироватці хворих антитіла до будь-якого збудника.

РНГА можна використовувати й для серологічної ідентифікації збудника. У цьому випадку як індикатор використовують еритроцити, навантажені відповідними антитілами. При додаванні до них культури збудника виникає феномен гемаглютинації. На відміну від попередньої реакції, її називають реакцією оберненої (зворотньої) непрямої гема­ глютинації (РОНГА).

Методика постановки РНГА У ряд лунок полістиролової планшети наливають по 0,5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, потім у першу лунку вносять 0,5 мл сироватки хворого розведеної 1:50, і одержують розведення сироватки 1:100. З першої лунки переносять 0,5 мл в другу, одержують розведення 1:200, з другої в третю і т.д., крім останньої. З передостанньої лунки 0,5 мл виливають, одержавши ряд послідовних розведень сироватки, в усі лунки додають по 0,25 мл відповідного еритроцитарного діагностикуму. Планшети вміщують у термостат при 37 °С на 2-3 год.

Результат реакції оцінюють за виглядом осаду еритроцитів, почи­ наючи з контролю, де вони повинні осісти на дно у вигляді круглого компактного осаду з рівними краями. У лунках із сироваткою при позитивній реакції осад буде мати нерівні краї і покриватиме майже всю лунку.

Інтенсивність РНГА оцінюють за чотирьохплюсовою системою: якщо майже всі еритроцити аглютинувались і утворився осад, який нагадує перевернуту “парасольку”, - реакція позитивна (++++, +++);

213

не всі еритроцити аглютинувались, мереживоподібний осад меншого розміру (++); більшість еритроцитів не склеїлись і утворюють у центрі дна лунки компактний диск з нерівними краями - реакція слабопозитивна (+).

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) набула широкого вико­ ристання для діагностики вірусних інфекцій. Її можна застосовувати як для серологічної ідентифікації вірусів, так і для серологічної діагнос­ тики. Гемаглютинація - це феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Деякі віруси мають на своїй оболонці рецептори, комплементарні рецепторам поверхні еритроцитів певних тварин, і при додаванні до суспензії вірусів еритроцитів, останні склеюються. Наприклад, вірус грипу аглютинує еритроцити курей, вірус кліщового енцефаліту - еритроцити гусей. Таким чином, у випадку гемаглюти­ нації можна зробити висновок про наявність вірусу в досліджуваному матеріалі. Проте ця реакція не імунологічна, тому що в ній не бере участі основна система - антиген і антитіло.

У той же час реакція гальмування гемаглютинації відноситься до серологічних реакцій імунітету. У РГГА специфічні противірусні антитіла, взаємодіючи з вірусом (антигеном), позбавляють його власти­ вості склеювати еритроцити.

Для постановки РГГА в лунках полістиролових планшетів готують послідовні розведення сироватки в об’ємі 0,25 мл і змішують їх з аналогічною кількістю вірусомісткого матеріалу. Суміш ставлять у термостат при 37 °С на ЗО хв, після чого в кожну лунку додають по 0,5 мл 1-2 % зависі еритроцитів.

Обов’язкові два контролі: контроль сироватки і контроль віруса. Облік проводять після повторного 30-хвилинного перебування реаген­ тів у термостаті. Якщо досліджувана сироватка містить антитіла до данного віруса, вона його нейтралізує, і феномен гемаглютинації еритроцитів не настає (позитивна РГГА).

Реакція преципітації (РП). За своєю сутністю реакція преципітації аналогічна реакції аглютинації. В основі її механізму лежить утворен­ ня і випадіння в осад комплексів антиген-антитіло. Проте вона відріз­ няється за характером антигенів: в реакції аглютинації вони корпуску­ лярні, а в реакції преципітації - молекулярні, в розчинному стані. Антигенами можуть бути екстракти мікроорганізмів, тканин, органів, хімічні речовини.

Феномен преципітації полягає в тому, що антитіла (преципітини), з ’єднуючись із розчинними антигенами (преципітиногенами),

214

53 Реакція

преципітації в

зумовлюють утворення осаду (преципітату) або помутніння розчину. За титр реакції приймають найбільше розведення антигена, яке дає позитивний результат.

Реакція преципітації значно чутливіша від реакції аглютинації й дозволяє виявити антиген у дуже малих кількостях. Її можна прово­ дити в рідкому і щільному середовищах. Обов’язковою умовою постанов­ ки реакції в рідкому середовищі є прозорість компонентів.

Реакція відбувається при змішуванні розчинів антигена й антитіла або нашаруванні одного компонента на інший. В останньому випадку на межі двох реагентів утворюється преципітат у вигляді кільця. Тому така реакція одержала назву реакції кільцепреципітації.

Методика постановки реакції кільцепреципітації. У вузенькі преципітаційні пробірки наливають 0,5 мл преципітуючої сироватки, а потім обережно пастерівською піпеткою нашаровують по стінці пробірки відповідний антиген. У випадку позитивної реакції через 5-30 хв на межі двох рідин з ’являється видиме на темному фоні кільце молочнобілого кольору.

Для аналізу складу антигенів широкого поширення набула реакція преципітації в гелі. Розрізняють просту і подвійну дифузію в гелі.

Проста імунодифузія (реакція Удена). Агаровий гель, який містить преципітуючу сироватку, поміщають у вузькі пробірки і зверху на­ шаровують розчин антигена. Дифундуючи в гель, антиген зв’язується з відповідними антитілами, утворюючи мутне кільце преципітації. Розміщення кілець в агарі визначається концентрацією відповідного антигена.

Подвійна радіальна імунодифузія за Ухтерлоні. В агарі, який розлитий тонким шаром в чашках або на предметних скельцях, роблять круглі лунки на од­ наковій відстані одна від одної (4-10 мм) за допомогою спеціальних-штампів. У лунки вносять досліджувану сироватку і розчин антигена в різних розведеннях або різні антигени. Із лунок антигени й антитіла дифун-

дують назустріч ОДИН одному, І В ТОЧЦІ ЇХ оптимального агаровому гелі співвідношення утворюється преципітат у вигляді тоненьких білих ліній. Якщо в сироватці є різні антитіла або антигени декількох видів, з’являються декілька ліній преципітації (рис. 53).

Однією із різновидностей реакції преципітації в гелі є проста ра­ діальна імунодифузія за Манчіні. За її допомогою визначають концент­ рацію імуноглобулінів у сироватці крові.

215

Феномен преципітації широко використовується в мікробіологіч­ ній практиці. Зокрема, в судово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової належності крові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, різних тварин і пта­ хів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. Таким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів (м’ясо, мед). Ця реакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспінального менінгіту, чуми, дизентерії тощо. Особливе значення має реакція термопреципітації Асколі, яку використовують для визначен­ ня інфікованості збудником сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, щетина). Із досліджуваного матеріалу шляхом кип’ятіння екстрагують сибірковий антиген, який потім вико­ ристовують для реакції.

Реакція Ухтерлоні за інформативністю переважає всі інші методи, в основі яких лежить феномен преципітації. Її використовують для ви­ значення антигенного складу органів і тканин, як нормальних, так і пухлинних, кількості анитигенів у складних системах. Вона має важ­ ливе значення в діагностиці дифтерії, віспи та інших захворювань.

Реакція лізису. Для реакції лізису необхідні антиген, антитіло й комплемент. Антигеном можуть бути мікроорганізми, еритроцити або інші клітини. Як антитіло (лізин) використовують специфічну сироватку або сироватку хворого. Залежно від того, проти яких клі­ тин спрямована дія лізинів, вони мають свої назви: проти бактерій - бактеріолізини, спірохет - спірохетолізини, еритроцитів - гемолізини, проти інших клітин - цитолізини. Комплемент при утворенні комплек­ су клітина (антиген) - антитіло, зв’язується з ним, активується за класичним шляхом і викликає розчинення клітини. Без комплементу лізис клітини неможливий. Розрізняють декілька реакцій лізису: бактеріолізу, гемолізу, цитолізу. Реакцію бактеріолізу з діагностичною метою практично не використовують. Частіше ставлять реакції ге­ молізу й цитолізу.

Постановка реакції гемолізу. Компонентами є антиген (еритроцити барана), антитіло (гемолітична сироватка), комплемент (свіжа сироватка гвінейської свинки або стандартний сухий комплемент). Для одержан­ ня еритроцитів у барана беруть кров із яремної вени у стерильний флакон із скляними кульками й енергійно струшують, щоб нитки фібрину намотались на кульках і кров не згорнулась. Потім ізото­ нічним розчином хлориду натрію відмивають еритроцити від плазми. Для цього кров центрифугують 10 хв при 2000 об/хв. Плазму

216

відсмоктують піпеткою, а до осаду еритроцитів знову додають ізото­ нічний розчин, ретельно перемішують і центрифугують. Таке проми­ вання еритроцитів роблять тричі. Рідину обережно відсмоктують, а з осаду еритроцитів готують 3 % суспензію в ізотонічному розчині.

Гемолітичну сироватку (гемолізин) одержують шляхом імунізації кроликів еритроцитами барана. Після циклу імунізації у них беруть кров, з якої готують сироватку, де містяться антитіла проти еритроци­ тів. Для ліквідації комплементу, що знаходиться в ній, її прогрівають при 56 °С протягом ЗО хв і визначають титр.

Для постановки реакції гемолітичну сироватку беруть у потрійно­ му титрі. Наприклад, якщо титр сироватки 1:1800, то її розводять до 1:600. Комплемент беруть у розведенні 1:10 (табл. 6).

Схема постановки реакції гемолізу			Таблиця 6
Компопепти		Пробірки
	1	2	3
Гемолізин у потрійному титрі (мл)	0,5	0,5	-
3% суспензія еритроцитів барана (мл)	0,5	0,5	0,5
Комплемент 1:10 (мл)	0,5	-	0,5
0,85 % розчин хлориду натрію (мл)	-	0,5	0,5
Термостат 37 °С 60 хв
Результат (гемоліз)	|1 +	-	-

Реакція вважається позитивною, якщо всі еритроцити лізувались. Рідина червоного кольору й абсолютно прозора. Ніякого осаду на дні пробірки немає. Реакція негативна, якщо еритроцити компактно осі­ ли на дно, рідина над ними безбарвна.

Реакція зв’язування комплементу (РЗК). Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації й преципітації є участь в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка виступає у вигляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не завжди зумовлює візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реак­ ції. Проте відомо, що при утворенні комплексу антиген - антитіло до нього завжди приєднується комплемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, то комплемент не зв’язується, залишаєть­ ся вільним у системі. При додаванні комплексу еритроцити барана - гемолізини вільний комплемент, зв’язуючись з ним, викликає гемоліз

217

еритроцитів. Цей принцип і покладено в основу РЗК. При відповіднос­ ті антигена антитілу з ним зв’язується комплемент. Щоб переконатись у цьому, додають еритроцити барана й гемолітичну сироватку. При відсутності гемолізу роблять висновок, що реакція позитивна, при наявності гемолізу - реакція негативна.

Для сероідентифікації використовують стандартні діагностичні сироватки відомого титру. Для серологічної діагностики досліджувану сироватку прогрівають при 56 °С протягом ЗО хв для інактивації влас­ ного комплементу, а потім готують ряд послідовних розведень для визначення титру антитіл. Антигенами можуть бути бактеріальні клітини, віруси, білкові або полісахаридні речовини, екстракти ор­ ганів і тканин.

Комплемент представлено свіжою або ліофілізованою сироваткою гвінейської свинки, яку розводять 1:10. Гемолітичну сироватку вико­ ристовують у потрійному титрі, а з еритроцитів барана готують 3 % суспензію в ізотонічному розчині хлориду натрію.

Підготовка реагентів. Промисловість випускає стандартні гемолі­ тичні сироватки з відомим титром, який вказаний на етикетці. Але при довготривалому зберіганні з метою його перевірки гемолітичні си­ роватки перед основним дослідом титрують. У ряду пробірок в об’ємі 0,5 мл готують послідовні розведення гемолізину до титру. У кожну пробірку вносять по 0,5 мл 3 % зависі еритроцитів, по 0,5 мл комп­ лементу у розведенні 1:10 і по 0,5 мл фізіологічного розчину. Пробірки ставлять у термостат при 37 °С на 1 годину. При відсутності гемолізу в контролі оцінюють його ступінь у дослідних пробірках за трьохплюсовою системою: повний гемоліз (+++), частковий гемоліа (++ або +), відсутність гемолізу (-).

За титр гемолітичної сироватки приймають те найбільше її роз­ ведення, яке в присутності комплементу викликає повний гемоліз еритроцитів. В РЗК беруть робочу дозу гемолітичної сироватки у потрійному титрі. Якщо титр сироватки складав 1:1800, то робочою дозою буде 1:600.

Титрування комплементу проводять в день постановки РЗК длН визначення дози, яку необхідно взяти в реакцію. Вона повинна бути, такою, щоб повністю зв’язалась комплексом антиген-антитіло. ЯшЦР якась частина комплементу залишиться незв’язаною, вільною, ТО при додаванні гемолітичної сироватки й еритроцитів, останні будуть лізуватись. А наявність гемолізу, як відомо, свідчить про негативний результат РЗК. Ось чому так важливо визначати титр комплементу.

218

Перед початком титрування в ампулу з сухим комплементом до­ дають 1 мл ізотонічного розчину. Одержаний розчин додатково розво­ дять 1:10 і використовують як вихідний для визначення титру компле­ менту.

Для цього в ряд пробірок вносять зростаючі на 0,05 мл дози комп­ лементу, починаючи від 0,05 мл до 0,5 мл, і в кожну пробірку до кінцевого об’єму 0,5 мл додають ізотонічний розчин хлориду натрію.

Попередньо готують гемолітичну систему, яка складається з од­ накової кількості 3 % суспензії еритроцитів барана і гемолітичної сироватки в робочому титрі. Її витримують при температурі 37 °С протягом ЗО хв, що необхідно для зв’язування еритроцитів з гемолі­ зином.

Після приготування відповідних розведень комплементу в усі пробір­ ки вносять по 1,0 мл гемолітичної системи і до об’єму 2,0 мл - 0,5 мл ізотонічного розчину. Суміш змішують і ставлять в термостат при 37 °С на 1 годину. Результати реакції оцінюють за появою гемолізу. Титром комплементу буде та його найменша кількість, при якій спо­ стерігається повний гемоліз (+++). Робоча доза комплементу завжди буде більшою від титру на 25 %, і практично вона буде міститись у наступній пробірці. Наприклад, якщо в першій пробірці, де є пов­ ний гемоліз, знаходилось 0,2 мл комплементу, за робочу дозу прий­ мають 0,25, ту кількість, що знаходиться в наступній пробірці.

Постановка основного досліду РЗК. Класичну методику постановки РЗК запропонували Ж. Борде і О. Жангу для діагностики хронічної гонореї. Згідно з цією методикою кожен компонент реакції беруть в кількості 0,5 мл, і загальний об’єм її становить 2,5 мл.

При постановці РЗК компоненти вносять у певній послідовності. Спочатку в пробірки, у яких міститься розведена сироватка хворого, додають рівні об’єми антигена і комплементу в робочій дозі. Пробірки ретельно струшують і ставлять у термостат при 37 °С на 1 год. За цей час з’єднується антиген з антитілом, і на цьому комплексі фіксується комплемент. Одночасно в термостаті інкубують гемолітичну систему. Через годину в усі пробірки основного досліду додають по 1 мл ге­ молітичної системи і знову ставлять у термостат. Через 30-45 хв про­ водять облік реакції при умові повного гемолізу в контролях сироват­ ки, антигена і комплементу.

РЗК оцінюють за чотириплюсовою системою: різко позитивна ре­ акція (++++, +++) - повна затримка гемолізу, рідина безколірна або блідо-рожевого кольору, еритроцити осідають на дно; позитивна

219