Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

Виділяють два види репарацій: фотореактивація та тсмнова. Фотореактивація захищає клітину від негативної дії ультрафіолетової радіації, яка викликає утворення тимінових димерів. На сонячному світлі (А. - 300-400 нм) утворюються особливі ферменти, які руйнують зв’язки між піримідиновими димерами.

Феномен темнової репарації складніший за попередній. Його сутність полягає в тому, що особливі ферменти знаходять мутовану ділянку ДНК і вирізають її. За допомогою ДНК-залежної ДНК-поліме- рази комплементарно відновлюється вихідна структура молекули, і ферменти лігази зшивають її з материнською ниткою.

Для одержання мутантів розроблено методи, засновані на виявленні різниці в швид­ кості росту бактерій, різної здатності їх до виживання тощо. Найчастіше використо­ вують метод реплік Ледер-' бергів (рис. 39). Для цього чис-

Рис. 39. Метод реплік: 1 - матрична чашка з Ту Культуру бактерій, на ЯКу>’

повноцінним середовищем; 2 -	чашка з міні- діяв мутагенний фактор за-
мальним середовищем	СІВаЮТЬ на ПОВНОЦІННЄ Щ ІЛ Ь-

не живильне середовище з розрахунку, щоб виросло 1 0 0 - 2 0 0 ізольо-> ваних колоній. Після цього за допомогою штампа-реплікатора, вкри-> того оксамитом, діаметром дещо меншим за чашку Петрі колоній переносять на мінімальне живильне середовище. На ньому виростають тільки колонії прототрофних організмів. Порівнюючи їх розташування з вихідною материнською чашкою, знаходять колонії, утворені бакте-* ріями-мутантами. їх відсівають на живильні середовища для одер-* жання чистої культури і вивчають морфологічні, культуральні, ан-з

тигенні, біохімічні, біологічні та інші властивості,! Своєрідною формою генотипної мінливості^ бактерій є явище дисоціації. Його можна спо-^ стерігати при культивуванні мікроорганізмів^ на щільних живильних середовищах. Ізольовані колонії мікроорганізмів певного виду утворюють на поверхні середовища колонії двох типів - £И

Рис 40	Гладенькі й	(smooth - гладенький) і R-форми (rough -
шорсткі	колон"т Кпри	шорсткий)	(рис. 40). Колонії першого типу -і
дисоціації		гладенькі,	блискучі, з рівними краями. Колоній

140

R-типу, навпаки, мутні, шорсткі, з нерівним зазубреним краєм. Виявилось, що деякі властивості мікроорганізмів, незважаючи на те, що вони належать до одного й того ж виду, також відрізняються. Так, клітини S-форми колоній, нормальної морфології, викликають дифузне помутніння бульйону, біохімічно вони більш активні, повно­ цінні в антигенному відношенні, більш вірулентні, їх виділяють, як правило, в гострому періоді захворювання. Збудники чутливі до бак­ теріофагів і стійкі до фагоцитів, бактрицидної дії сироватки крові.

Мікроорганізми, що утворюють R-форми колоній, мають слабшу біохімічну активність, менш чутливі до дії бактеріофагів і мають менш виражені вірулентні властивості. Винятком є збудники туберку­ льозу, сибірки, чуми.

Дослідження довели, що такі зміни відбуваються внаслідок мута­ цій у генах, що детермінують синтез окремих компонентів мембран бактерій.

Вважається, що дисоціація надає мікробам певних селективних переваг при існуванні в організмі хазяїна, і в той же час вона утруднює діагностику інфекційних хвороб, насамперед, дизентерії та ешерихіозів.

Генетичні рекомбінації

Рекомбінації - особливі феномени спадкової мінливості мікроор­ ганізмів, які не пов’язані з мутаційним процесом. Рекомбінанти, що при цьому виникають, успадковують деякі ознаки обох “батьківсь­ ких” клітин, адже відбувається експресія гена реципієнта та частини генома донора. Генетичні рекомбінації створюють невичерпне дже­ рело різноманітних комбінацій генів, які природа використовує в процесі еволюції. Вважається, що здатність клітин до рекомбінацій детермінується особливими гес-генами (recombination - рекомбінація).

Виділяють три основні види генетичних рекомбінацій: трансфор­ мація, трансдукція та кон’югація.

Трансформація - процес гібридизації внаслідок переносу генетичних Детермінант від бактерії бо бактерії за допомогою ізольованої ДНК.

Вперше на явище трансформації звернув увагу Ф. Гриффітс у 1928 p., вивчаючи пневмококи (Streptococcus pneumoniae), які утво­ рюють капсулу в організмі, а на агарі ростуть у вигляді гладеньких (S-форма) колоній. При введенні білим мишам вбитих нагріванням

141

вірулентних капсульних пневмококів III типу разом з авірулентними бескапсульними пневмококами II типу (R-форма) лабораторна твари­ на через декілька днів гинула, а з її крові висівались живі капсульні пневмококи II серотипу. Отже, відбувалася глибока перебудова гене­ тичного апарата клітини, яка набувала здатності синтезувати капсулу. Це означає, що авірулентний штам перетворився у вірулентний, що з мертвих клітин виділився якийсь агент, який надавав можливість живим клітинам утворювати полісахарид капсули. І ця ознака переда­ валась спадково.

У 1944 р. О. Евері, К. Маклеод та М. Маккарті змоделювали цей феномен in vitro, виділили та очистили трансформуючий агент. Ним виявилась молекула ДНК. Трансформація відбувається тільки в тих клітинах, які здатні до неї. Такий стан визначається поняттям компе­ тентності, природа якої остаточно не з ’ясована. Вважається, що вона зумовлюється наявністю особливого білка - компонента клітинної мембрани, здатного розщеплювати деякі структурні елементи клі­ тинної поверхні. Таким чином вивільняються рецепторні ділянки, з якими взаємодіє ДНК. Стан компетентності формується на певних стадіях розвитку бактеріальної клітини.

Механізм явища трансформації полягає в тому, що спочатку на поверхні клітини-реципієнта адсорбується невеликий фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 частина хромосоми клітини-донора). Зго­ дом він проникає всередину клітини, де одна нитка ДНК перетравлю­ ється ендонуклеазами, а інша - вмонтовується у клітинну хромосому. Настає остання фаза процесу - експресія рекомбінантів. Такий процес інтеграції відбувається дуже швидко. Досліджено, що для появи рекомбінантів достатньо п’яти-десятихвилинного контакту клітини* реципієнта з донорською ДНК, а сам процес завершується через 2 год

Трансформуючу активність ДНК можна призупинити хімічними мутагенами, ультрафіолетовим, іонізуючим опроміненням і, особливо, ферментом ДНК-азою, що переконливо свідчить про участь ДНК у цьому процесі.

Здатність до трансформації виявлено у багатьох мікроорганізмів Н представників родів Bacillus, Neisseria, Haemophilus, Staphylococcus,! Escherichia та інших. За її допомогою можна передати резистентність : до антибіотиків, здатність метаболізувати різноманітні речовини, капсулоутворення тощо. Феномен трансформації можна використати" для аналізу спадкування певних ознак бактерійною клітиною, одер­ жання шляхом гібридизації мікроорганізмів з новими властивостями.

142

рй^іТ^Сон’югація у

При кон’югації внаслідок фізичного контакту між бактеріямидонорами та бактеріями-реципієнтами відбувається передача гене­ тичного матеріалу через особливі вирости, які називаються секс-

ЛІЛІ.

Вперше це явище дослідили Д. Ледерберг та Е. Тейтум на моделі кишкової палички (1946). Необхідною умовою для процесу кон’югації є наявність в клітині-донорі особливого фактору, який називається F-фактор (fertility - плодючість). Він є кон’югативною плазмідою, що існує автономно в цитоплазмі бактерії. Складається вона з генів пе­ реносу та генів, що кодують певні ознаки клітини. Бактерії з F-фак- торами позначаються як F+-, а без нього - F"- клітини. F-фактор детермінує утворення статевих ворсинок, отже, здатність клітин до кон’югації. Статеві ворсинки - особливі трубчасті вирости на поверхні клітини. Вони порожнисті, довжина їх у декілька разів перевищує

величину бактерії.
Процес кон’югації починається з того, що за
допомогою статевих ворсинок клітина-донор
торкається клітини-реципієнта, фіксує її та
притягує до себе (рис. 41). Після цього плазміда
починає реплікуватись, і одна її нитка переда­
ється в реципієнтний штам, а інша залишаєть­
ся на місті. Відбувається комплементарний син­
тез іншої нитки ДНК. Таким чином, Г+-фактор
мають вже дві бактерії. Клітина, яка отримала
кон’югативну плазміду F, набуває здатності
синтезувати статеві ворсинки на поверхні, отже,	j

може сама вступати в кон’югацію. Частота цього

процесу - 10“в-10“8. В деяких випадках F-плазміда бактерій

здатна інтегрувати з хромосомою. Якщо така інтеграція стабільна, утворюється клон клітин, в якому всі бактерії здатні вступати в кон’югацію з досить високою частотою - 10"!-10"4. Такий штам нази­ вають штамом Hfr (high frequency of recombination - висока частота рекомбінацій). На відміну від Р+-клітин в Hfr-донорах F-фактор інтегрований з хромосомою бактерій. Коли такі клітини вступають в кон’югацію з F'-штамами, до них передається тільки одна нитка ДНК. Триває процес 60-90 хвилин, а швидкість переносу становить До 5.104 пар нуклеїнових основ за одну хвилину. Таким чином, в клітині-реципієнті експресується власний геном та частина генома Донора.

143

Деколи в клітинах IJfr може відбуватись відщеплення F-фактора, і він переходите в автономне існування в цитоплазмі, захопивши з собою сегменти хромосоми клітини-господаря. Такий F-фактор нази­ вається F-генота, а клітина, що його несе, клітиною F'. В її хромосомі є дефект, відповідний втраченому фрагменту.

Таким чином, від б а к т ер ії до бактерії можна перенести різнома­ нітні властивості донорСЬКОго штаму. Крім того, перериваючи процес кон’югації через певні пром іж ки часу і вивчаючи нові властивості, які набула клітина-реципієнт, можна визначити локалізацію генів на хромосомі, тобто провести її картування.

Явище кон’югації досліджено для багатьох представників мікроб­ ного царства - кишкових і синьогнійних паличок, сальмонел та інших.] Встановлено, щ о процес кон’югації може відбуватись не тільки в, межах одного виду, ал е й між різними родами бактерій. З медичної точки зору заслуговує ь*а увагу факт передачі за допомогою кон’югації^ фактора множинної лікарської резистентності (R), який зумовлює] стійкість бактерій до багатьох антибіотиків.

Трансдукція. У 1952 p. Н. Щндер і Д. Ледерберг, вивчаючи процес кон’югації м іж різними иггамами сальмонел, звернули увагу, що іноді; обмін генетичним матеріалом відбувається не в результаті кон’юга- 1 ції, а внаслідок вивільнення з батьківських штамів помірного бакте­ ріофага. Явище обміну генетичною інформацією у бактерій шляхом переносу ф агам и фрагментів ДНК від клітини-донора до клітиниреципієнта одержало назву трансдукції.

Вона часто відбуваться в ентеробактерій, псевдомонад, стафіло­ коків та бацил. Вважають, що більшість видів мікроорганізмів несуть у своєму геномі проф ^г> Тому трансдукція може бути надзвичайно поширеним явищ ем у мікробному світі.

Виділяють три основні види трансдукції: специфічну, загальну або генералізовану та. абортивну.

Специфічна трансдукція характеризується здатністю бактеріофагів переносити лиш е пев**і Гени від бактерії донора, які локалізуються по обидві сторони від іуіісця інтеграції фага в геном клітини. Наприк­ лад, фаг X E. coli м а € сайт інтеграції в хромосому бактерій між генами gag і bio, які йодують відповідно ферментацію галактози й синтез біотину. При відході з бактеріальної хромосоми, він захоплює частку генетичного Матеріалу донора (гени gag і bio), а сам при цьому втрачає частину власного генома. Такий бактеріофаг називають дефектним, том у що кількість власної ДНК обмежена за рахунок

144

включення генома хазяїна. Бактеріофаг ер 80 переносить тільки трип­ тофановий ген кишкових паличок.

Клітини, які лізогенізовані дефектними фагами, стають несприй­ нятливими до зараження гомологічними вірулентними бактеріофагами.

Під час формування головки бактеріофага і збирання фагових корпускул у нього може проникнути, отже, передатись бактеріїреципієнту, будь-який фрагмент ДНК бактерії-донора, наприклад, ген, що зумовлює резистентність до антибіотиків.

Отже, фаг просто переносить генетичну інформацію, а його власна ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів.

Процес трансдукції відрізняється від лізогенної конверсії, яку також забезпечують помірні бактеріофаги. При останній клітина набуває нових властивостей за рахунок експресії в ній власних генів фага. Яскравим прикладом такого явища є перенос tox+ генів дифтерійних фагів у дифтерійні палички, внаслідок чого вони набува­ ють токсигенних властивостей. Аналогічне явище спостерігається у збудників ботулізму, стафілококів.

При абортивній трансдукції фагова ДНК та гени бактерії-донора не інтегруються в хромосому реципієнта, а залишаються в цитоплаз­ мі. Під час поділу клітини вони передаються тільки одній з дочірніх клітин, а згодом просто елімінуються з неї.

Явище неспадкової та спадкової мінливості спостерігається також у вірусів. Модифікаціям підлягають склад білків капсиду, суперкапсиду, який зумовлюється впливом клітинних компонентів при репро­ дукції віріонів.

Як прояв генотипової мінливості, у вірусів виявлено також фено­ мени мутацій та рекомбінацій. Внаслідок мутацій можуть змінюватись розміри бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність вірусів для тварин, чутливість їх до дії хіміотерапевтичних препаратів. Завдяки мутаціям, які виникли при пасажах вірусів ^ерез мозок кро­ ликів, одержано фіксований вірус, а при пасажах через мозок кур­ чат - штам Флюрі, які використовуються при створенні антирабічних вакцин для‘активної профілактики сказу. При зараженні чутливої клітини одночасно декількома вірусами спостерігаються прояви числен­ них генетичних рекомбінацій: множинна реактивація, пересортування генів, крос-реактивація, гетерозиготність, транскапсидація. Вони зустрічаються також in vivo, що дозволяє по-новому оцінити деякі сторони розвитку вірусних інфекцій.

145

Практичне значення генетики бактерій

Генетичні феномени знайшли широке практичне застосування в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промис­ ловості, біотехнології, сільського господарства.

Завдяки застосуванню генетичних методів, одержано високоактив- * ні штами бактерій, грибів, актиноміцетів, дріжджів, які продукували у 2 0 0 - 1 0 0 0 разів і більше амінокислот, органічних кислот, ферментів, вітамінів, кормового білка, порівняно з вихідними, а також вакцинні штами мікроорганізмів та вірусів. Використання різноманітних мута­ генів (ультрафіолетове та радіоактивне опромінення, хімічні речовини) дозволило створити мутантний штам гриба Pénicillium chryzogenum, який у дикому стані продукував 1 0 0 од/мл пеніциліну, а після нап­ равленої селекції - 1 0 0 0 0 од/мл.

Встановлено, що деякі мікроорганізми, наприклад, Fuzariurr. monilifore, синтезують біологічно активні субстанції типу фітогормонів, гіберелінів, біоінсектицидів та інших, які є ефективними стимулято­ рами росту й розвитку вищих рослин. Гєнетичні підходи дозволили проводити цілеспрямований селекційний процес для одержання про­ дуцентів цих речовин.

Суттєвий вклад вносить генетика у зменшення забруднення довкіл­ ля: очистка стічних вод, переробка відходів і побічних продуктів сільськогосподарського виробництва та промисловості, запропону­ вавши спеціально селекціоновані з цією метою мікроорганізми.

Стрімкий розвиток біологічної науки яскраво проявився у станов­ ленні генної та клітинної інженерії - сукупності експериментальних методів, за допомогою яких переносять гени від одного організму до іншого. Вона народилась у 1972 p., коли американським дослідникам П. Бергу, Г. Бойеру, С. Коєну вдалось одержати гібрид вірусу мавпи SV-40 і бактеріофага X.

Ще донедавна можливість конструювання живих організмів із заданими властивостями здавалась недосяжною. Для здійснення цього фантастичного експерименту необхідно одержати відповідний ген, приєднати його до спеціального вектора - провідника, щоб не бути знищеним клітинними ферментами, ввести в іншу клітину і заставити там працювати. Для всіх цих операцій необхідна участь спеціальних ферментів (їх відомо вже декілька сотен), які здатні розрізати донорську ДНК і ДНК вектора в певних ділянках на окремі фрагменти. Інші ферменти необхідні для приєднання відповідних генів

146

д о ДНК. Для розшифровування будови генів використовують методи біохімічного синтезу за участю ферментів ревертаз. Як вектори вико­ ристовують бактеріальні плазміди, бактеріофаги, деякі віруси. Вони здатні реплікуватись у клітині-реципієнті і містять один або декілька маркерів, що дозволяють розпізнавати рекомбінантні клітини.

Про високу ефективність генно-інженерних методів одержання хімічно чистих біологічно активних речовин свідчить такий факт. Щоб одержати 5 мг соматотропіну, було використано мозок 500 000 овець протягом 5 років, в той час як аналогічну кількість гормону дають 9 л бульйонної суспензії кишкової палички.

Генна інженерія надала можливість одержати інсулін, простаглан­ дини, енкефаліни, інтерферон, інтерлейкіни, гормони, різноманітні ферменти, численні хімічно чисті вуглеводи - глюкозу, ксиліт тощо.

Медична наука стоїть на порозі розробки методів генної хірургії. Наприклад, у людини деколи зустрічається вроджена недостатність ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (ГГФРТ). У такому випадку вона схильна до подагри, часто спостерігається біль у суглобах, розвивається нирково-кам’яна хвороба. Експерименти на тваринах переконливо довели, якщо вмонтувати ген, відповідаль­ ний за синтез цього ферменту, в ретровірус і ввести його у спинний мозок білих мишей, вони починають синтезувати ГГФРТ. Клонований з макрофагів людини ген фактору некрозу пухлин у кишковій паличці при введенні її білим мишам із саркомами викликає їх руйнування.

Широкі перспективи відкриває генна інженерія на шляху створення високоефективних засобів специфічної профілактики інфекційних захворювань. Введення в геном кишкових паличок, вірусів вісповакцини, дріжджів деяких генів вірусів гепатиту В, ящура дозволили роз­ робити субодиничні вакцини.

Таким чином, мікробіологічна наука дозволяє створити струнку систему взаємопов’язаних галузей біотехнології, які мають унікальну перевагу - вони засновані на функціонуванні природних систем, які підпорядковуються інтересам людини.

Питання для самоконтролю

1. Як організовано генетичний апарат бактерій? Що таке ген,генотип, фенотип?

2. Значення транспозонів і плазмід.

3.Які є види мінливості бактерій? Що таке мутації? їх різновидності.

4.Назвати й охарактеризувати різні види генетичних рекомбінацій.

5.Яке практичне значення вчення про генетику бактерій і вірусів?

147

Розділ 6. ВЧЕННЯ ПРО ІНФЕКЦІЮ

Інфекційні хвороби відомі людству з найдавніших часів. У стародав­ ніх письменах згадується про поширення віспи, туберкульозу, про­ кази, сказу. Нині нараховуються сотні інфекційних хвороб, які спри­ чиняються бактеріями, спірохетами, актиноміцетами, рикетсіями, вірусами, грибами, найпростішими. За даними ВООЗ, наймасовішими є інфекції, які супроводжуються діареєю, - 4 млрд випадків щоріч­ но, малярія - 500 млн, гострі інфекції дихальних шляхів - 395 млн, венеричні захворювання - 330 млн, кір - 42 млн, кашлюк - 40 млн та ін. Загальна кількість заражених вірусом імунодефіциту людини досягає 28 млн чоловік, 6 млн людей вже померло від цієї хвороби. За останні 20 років з’явилось понад ЗО нових інфекційних захворювань (хвороба легіонерів, волосатоклітинний лейкоз, геморагічні лихоманки Марбурга, Ебола, СНІД та ін.), проти більшості з яких поки що немає задовільних засобів лікування та профілактики. Загальною ознакою цих хвороб є заразливість, тобто можливість передачі від хворої до здорової людини і здатність до масового, епідемічного розповсюдження. При вивченні інфекційних хвороб користуються термінами “інфекція”, “інфекційний процес”, “інфекційна хвороба”, які походять від латинсь­ кого слова “игіесіло” - зараження. Часто ці поняття не відрізняють одне від іншого або взагалі трактують неправильно. Тому наводимо їх сучасне визначення.

Інфекція - всі види взаємодії макро- і мікроорганізмів у певних умовах зовнішнього та соціального середовищ, незалежно від того, розвивається явна або прихована хвороба, чи тільки мікробоносійство. Аналогічний процес, викликаний найпростішими, називається інвазією.

Інфекційний процес - сукупність усіх захисних і патологічних реакцій організму, які виникають у відповідь на проникнення і дію збудника.

Інфекційна хвороба - крайній ступінь розвитку інфекційного процесу, що проявляється певними клінічними, патолого-анатомічними, біохімічними, мікробіологічними й імунологічними ознаками.

Отже, поняття “інфекція” ширше, ніж поняття “інфекційний про­ цес” та “інфекційна хвороба”.

Виникнення і розвиток інфекційного процесу (хвороби) залежать від трьох факторів: ступеня патогенності мікроорганізму, імунологічної реактивності макроорганізму й умов зовнішнього і соціального сере­ довищ.

148

Роль мікроорганізму у виникненні й розвитку інфекційного процесу

Серед величезної маси мікроорганізмів, які населяють нашу пла­ нету, порівняно невелика кількість може спричиняти інфекційний процес. Вони називаються патогенними або хвороботворними. Решта (переважна більшість) відноситься до вільноіснуючих мікробів або сапрофітів, які неспроможні викликати захворювання.

Патогенність - це потенціальна здатність даного виду мікроорга­ нізмів викликати інфекційний процес. Ця властивість є видовою рисою, яка виробилась у процесі тривалого еволюційного розвитку. Патогенність є специфічною ознакою, тобто даний збудник викликає тільки певне, властиве лише йому захворювання. Наприклад, дифтерійна паличка спричиняє дифтерію, холерний вібріон - холеру і т.п., що зумовлено генетичними особливостями збудника.

Хвороботворна активність мікробів (патогенність) неабсолютна і нестабільна. Вона може значно коливатись навіть у різних штамів одного й того ж виду. Ступінь або міру патогенності називають віру­ лентністю. Отже, вірулентність - це якісна, індивідуальна ознака даного штаму.

Вірулентність бактерій може бути посилена, послаблена і навіть зовсім втрачена. При цьому інші їх властивості не змінюються. Поси­ лення вірулентності досягають пасажами культури через організм чутливих тварин, різними генетичними методами. Послаблення - шляхом багаторазових пересівів культури на несприятливих середо­ вищах, дією підвищеної температури, бактеріофагів, хімічних речо­ вин, імунних сироваток тощо. Такий підхід часто використовують при виготовленні живих вакцин та інших бактерійних препаратів.

Для характеристики патогенних мікроорганізмів встановлені оди­ ниці вірулентності. Одна з них - DLM (Dosis letalis minima) - мінімальна смертельна доза. Це та найменша кількість мікробів або їх токсинів, яка при зараженні викликає загибель 90-95 % чутливих тварин. Друга одиниця - DCL (Dosis certa letalis) - найменша доза, яка викли­ кає смерть 100 % взятих у дослід тварин. Найбільш об’єктивною, точною і прийнятою в лабораторних дослідженнях є LD50 (Dosis letalis^) - доза, що вбиває половину заражених тварин.

Вірулентні властивості патогенних мікроорганізмів визначаються такими факторами: токсиноутворення, адгезивність, інвазивність, наявність капсул, агресинів, полісахаридів, певних антигенів та ін.

149