Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

за методом Грама. Після цього його засівають на середовище КіттаТароцці та молоко. Середовища ставлять у термостат при температу­ рі 37 °С і культивують 1-3 доби.

На другому етапі вивчають прояви росту мікроорганізмів (помут­ ніння, утворення осаду та газу на середовищі Кітта-Тароцці, пептонізація молока). Готують мазок, фарбують за методом Грама і прово­ дять посів матеріалу за методами Вейнберга або Цейсслера для одержання ізольованих колоній.

За методом Вейнберга готують декілька пробі­ рок (3-4) з розтопленим і охолодженим до 42-45 °С цукровим м’ясо-пептонним агаром. Матеріал із середовища Кітта-Тароцці вносять у першу про­ бірку за допомогою пастерівської піпетки й ре­ тельно перемішують, потім переносять у другу, а далі - в третю (рис. 28). Після застигання агару пробірки культивують при оптимальній темпе­ ратурі, і за деякий час спостерігають утворення ізольованих колоній. Однак вміст кожної пробірки можна всмоктати у пастерівські піпетки або

методом Вейнберга трубки Віньяль-Вейона, стежачи щоб не було колонії анаеробів бульбашок повітря. Останні мають довжину біля

ЗО см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній кінець їх, який закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді капіляра. Після заповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у термостат для культивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаеробних бактерій. Для того, щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на певному рівні, розламують, колонію беруть бактеріальною петлею і переносять у відповідне середовище.

Для виділення ізольованих колоній за методом Цейсслера мате­ ріал із середовища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі його пастерівською піпеткою на чашку Петрі з цукровокров’яним агаром і роблять посів шпателем за методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають на другу чашку, а потім і третю. На останній чашці виростають ізольовані колонії. Чашки пере­ вертають догори дном, підписують, ставлять в анаеростат, в якому створюють анаеробні умови, а потім - у термостат при температурі 37 °С на 2-3 доби.

Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливостей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках

100

Віньяль-Вейона. Досліджуються їх форма, величина, колір, харак­ тер країв, рельєф колонії, консистенція тощо. З колоній готують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсівають у середовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубують певний час при оптимальній температурі.

На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту чистої культури збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять ідентифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів подібно до аеробних за морфо­ логічними, культуральними, біохімічними та біологічними ознаками. Обов’язково використовують визначення токсигенних властивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лабора­ торних тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроорганізмів.

Практична робота

1.Ознайомитись із набором основних компонентів для приготування простих і складних живильних середовищ (м'ясна вода,пептон,хлорид натрію, агар-агар, сухі середовища).

2.Ознайомитись із готовими живильними середовищами (МПБ, МПА, кров'яний агар, згорнута сироватка,Ендо, Левгна, Плоскирєва).

3.Вивчити ознаки росту мікробів на живильних середовищах.

4.Зробити мазки із суміші мікроорганізмів, забарвити їх за методом Грама і розглянути під мікроскопом.

5.Суміш бактерій засіяти на щільне живильне середовище петлею, тампоном і за допомогою шпателя.

2.Ідентифікація мікроорганізмів

Ідентифікіація мікроорганізмів за біохімічними ознаками. Для дослідження здатності бактерій розщеплювати білки (протеолітичні властивості) використовують молоко або середовище з желатином. Протеоліз у молоці виражається розчиненням згустку казеїну, який утворено бактеріями, що згортають молоко.

Середовища із желатином готують на м’ясній воді, додаючи 1 % пептону, 0,5 % хлориду натрію та 10-20 % желатину. Посів роблять уколом. Протеоліз проявляється розрідженням стовпчика середовища. Оскільки деякі види бактерій відрізняються за особливостями розрід­ ження желатину, цю ознаку можна враховувати при їх ідентифікації.

101

Пептолітичні властивості (здатність розщеплювати пептони - продукти неповного гідролізу білка) виявляють за допомогою МПБ і пептонної води. їх засівають мікроорганізмами, а потім визначають утворення кінцевих продуктів - аміаку, сірководню та індолу. Для знаходження аміаку в пробірку вставляють та зажимають пробкою червоний лакмусовий папірець. В атмосфері аміаку він набуває синього забарвлення. Індикатором на сірководень є розчин ацетату свинцю, який за аналогічних умов визначення забарвлює фільтрувальний папір, змочений індикатором, у чорний колір за рахунок утворення сульфіду свинцю.

Індол можна виявити за допомогою смужки фільтрувального паперу, змоченого 12 % розчином щавелевої кислоти. За наявністю індолу папірець набуває рожевого кольору. Більш чутливим є метод Ерліха. Згідно із загальноприйнятим методом пробкою пробірки зажимають папірець, просякнутий спеціальним індикатором (спир­ товий розчин парадиметиламідобензальдегіду). При наявності індолу колір його змінюється на бузково-рожевий або малиновий.

У мікробіологічній практиці широко використовуються диферен- ційно-діагностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва, які дозво­ ляють виявити розкладання лактози бактеріями. Вони дозволяють проводити первинну диференціацію патогенних і сапрофітних бакте­ рій кишкового тракту, що надзвичайно важливо для швидкого ви­ далення чистих культур з їх наступною ідентифікацією. Ці середовища є елективними для багатьох представників родини кишкових бактерій. Випускаються вони у сухому вигляді, тому їх приготування в лабо­ раторіях не потребує багато часу.

Середовище Ендо складається з сухого живильного агару, 1 % лактози та індикатора фуксину, знебарвленого розчином сульфіту натрію. Свіже середовище має слабке рожеве забарвлення. При рос­ ті лактозопозитивних мікроорганізмів, тих, що розщеплюють лактозу (E. coli), їх колонії забарвлюються у темно-червоний колір з метале­ вим блиском. Колонії лактозонегативних мікробів (сальмонели, шигели) на цьому середовищі безбарвні.

До складу середовища Левіна також входить МПА, лактоза, однозаміщений фосфат калію,, індикатори метиленовий синій, еозин. Нативне середовище має фіолетовий колір. Колонії лактозопозитив­ них бактерій мають темно-синє забарвлення, а лактозонегативні - рожевий відтінок.

102

Сухий бактоагар Плоскирєва (Бактоагар Ж) містить у складі агар із солями жовчних кислот, лактозу, цитрат натрію, гіпосульфіт, фосфат натрію, брильянтовий зелений, соду кальциновану, йод і нейтральний червоний. Мікроорганізми, що розщеплюють лактозу, утворюють колонії червоного кольору, а ті, що її не ферментують - безбарвні.

У мікробіологічній практиці часто виникає потреба дослідити ферментацію не тільки одного, а декількох цукрів відразу. З цією метою використовуються середовища Гісса. Вони можуть мати рідку та напіврідку консистенцію.

Основою рідкого середовища є 1 % лептонна вода з 0,5 % натрію хлориду, 1 % вуглеводів (глюкози, мальтози, лактози, сахарози, манніту та ін.). До нього додають індикатор Андреде (кислий фуксин

ві н розчині МаОН). Встановлюють рН 7,2, при ньому середовище має жовтий колір. Середовища з різними вуглеводами розливають

вокремі пробірки, в які встановлюють поплавок - запаяну з одного кінця скляну трубочку довжиною 3 см відкритим кінцем донизу. Стерилізують текучою парою або парою під тиском 0,5 атм 15 хв.

Після посіву бактерій, якщо вони ферментують вуглеводи, спосте­ рігають появу червоного забарвлення, яке свідчить про зміну рН у кислу сторону (утворення кислоти), а деколи з поплавка витісняється рідина. Тоді роблять висновок про утворення газу. Отже, можливі три варіанти при обліку результатів посіву на середовише Гісса: мікроорганізми не ферментують субстрату (негативна відповідь) або бактерії розкладають вуглеводи (позитивна відповідь) з утворенням кислоти без газу чи кислоти і газу.

Враховуючи, що мікроорганізми по-різному відносяться до вугле­ водів (розкладають або не розкладають) при кінцевому обліку резуль­ татів спостерігають пробірки із зміненим або незміненим кольором рідини. Це створює враження строкатості, а такий ряд називають строкатим рядом Гісса.

Зараз у більшості випадків користуються набором сухих середо­ вищ для визначення цукролітичних ферментів, з яких готують напів­ рідкі строкаті ряди. На відміну від попередньої групи, до їх складу входять індикатори ВР (суміш водного голубого з розоловою кис­ лотою) або бромтимоловий синій чи бромкрезоловий пурпурний. При наявності газу спостерігаються бульбашки або розриви жи­ вильного середовища у товщі агару. При підкисленні середовища з індикатором* ВР воно стає синім, а при підлужнюванні - червоним

103

(бромкрезоловий пурпурний при утворенні кислоти дає дещо фіоле­ тове та лимонно-жовте забарвлення, а бромтимоловий синій - зе­ ленкувате або лимонне). У лужному середовищі вони мають відпо­ відно інтенсивно фіолетовий та синій колір із зеленкуватим полиском.

Випускаються також сухі середовища Рессела та цукровий агар із сечовиною Олькеницького.

Середовище Рессела є напіврідким агаром із лактозою (1 %) і глюкозою (0,1 %) та індикатором ВР. Після розливання його у про­ бірки їх кладуть так, щоб утворився стовпчик агару і була скошена поверхня. Мікроорганізми засівають петлею спочатку уколом у стовпчик, а потім по скошеній поверхні. Якщо бактерії ферменту­ ють лактозу і глюкозу, спостерігають зміну кольору (підкислення) всього середовища на синій. Якщо мікроби здатні метаболізувати тільки глюкозу, в цьому випадку змінює колір стовпчик середовища. За умови утворення газу спостерігають за появою його бульбашок або розривами агару.

Трицукровий агар із сечовиною Олькеницького - більш складне середовище порівняно з попереднім. Він дозволяє визначити фермен­ тацію лактози, сахарози, глюкози, утворення сірководню та наявність у бактерій ферменту уреази. До складу середовища відповідно вво­ дять сухий живильний агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексну сіль амоній-залізо сульфат, тіосульфат натрію, сечовину, індикатор феноловий червоний. Готове середовище має блідо-рожевий колір.

При розщепленні цукрів феноловий червоний забарвлює середо­ вище в жовтий колір. Оскільки глюкоза присутня в невеликих кон­ центраціях (0,1 %), в аеробних умовах (скошена поверхня) бактерії повністю утилізують її за перші години росту. Через 18-24 год вони споживають і пептони як білкову живильну основу. При цьому утворюється аміак, який робить середовище лужним, надаючи йому червоного кольору. Однак у стовпчику агару жовтий колір залишається, тому що там зберігаються кислі кінцеві продукти, які забезпечують низький рівень рН.

Ентеробактерії, які розкладають лактозу й глюкозу, підкислюють середовище в усій пробірці (жовтий колір стовпчика та скошеної поверхні). Оскільки лактози (1 %) в 10 разів більше, ніж глюкози, через 18-24 год інкубації її запаси ще не вичерпані, тому зберігається жовтий колір середовища. Однак через 48 год за рахунок розщеплення пептонів можна спостерігати за його почервонінням (зсув рН у лужну сторону).

104

Якщо бактерії утворюють газ (вуглекислий, водень) при фермен­ тації цукрів, з ’являються розриви середовища або відбувається скупчення газу на дні, що піднімає агар у пробірці.

Сірководень мікроби утворюють з неорганічних сполук, завдячу­ ючи ферменту тіосульфатредуктазі. Взаємодіють із сірководнем солі заліза, які вступаючи з ним у реакцію, утворюють сульфід заліза у вигляді нерозчинного преципітату чорного кольору в стовчику.

Уреаза, яку продукують бактерії, руйнує сечовину з виділенням великої кількості аміаку, під впливом якого все середовище червоніє. Тому при наявності уреазопозитивних штамів провести облік фермен­ тації цукрів неможливо. В таких випадках необхідно використовувати інші середовища.

За останні роки в практиці мікробіологічних лабораторій почали використовувати спеціальні тест-системи для визначення різноманіт­ них властивостей бактерій: “Roche”, “АРІ”, “Enterotest”, пластини та диски індикаторні біохімічні. Вони зручні для користування, надійні, дозволяють визначати 12-20 і більше різноманітних ознак, значно полегшити ідентифікацію мікробів (рис. 29, вкл.).

Гемолітична активність мікроорганізмів є однією з найсуттєвіших ознак їх вірулентності, тому її визначення стало рутинною процеду­ рою будь-якої спеціалізованої лабораторії. З цією метою використо­ вують кров’яний МПА. Його готують з розтопленого та охолоджено­ го до 45-50 °С живильного агару, до якого додають 5-10 % дефібринованої або свіжої крові тварини (барана або кролика). Агар з кров’ю ретельно перемішують, не допускаючи утворення піни, і розливають у чашки Петрі. Якщо бактерії продукують гемолізини, навколо колоній або штрихів посіву утворюються зони просвітління на матовому червоному фоні (рис. ЗО, вкл.). За кольором гемолізу (безбарвний, зеленкуватий) можна визначити тип гемолізинів (а, р, у тощо).

Щоб виявити ліпіолітичні властивості мікробів, до складу живильних середовищ вводять ліпіди або жироподібні субстанції - твіни. Бакте­ рії за таких умов утворюють райдужні вінчики навколо колоній при розщепленні ліпідів.

Редукуючі властивості вивчають, додаючи до складу середовищ барвники (метиленовий синій, наприклад), які здатні відновлюватись. Фіксуючи час зміни кольору індикатора, можна судити про ступінь вираження редукуючої активності.

Декарбоксилазну активність бактерій оцінюють на спеціальних середовищах з амінокислотами (лізином, орнітином, глютаміновою кислотою та ін.).

105

Практична робота

1.Вивчити макроскопічні та мікроскопічні особливості колоній мікро­ організмів, що виросли на поверхні щільного живильного середовища. Зробити мазок, забарвити його за методом Грама і розглянути під мікроскопом.

2.Посіяти за допомогою петлі мікроорганізми на скошений агар для одержання чистої культури бактерій. Виготовити мазок із суміші грам- позитивних і грамнегативпих бактерій (стафілококів і кишкових паличок)

ізабарвити за методом Грама.

3.Зробити мазки з чистої культури мікроорганізмів, забарвити їх за

методом Грама і розглянути під мікроскопом, зробити висновок про чис­ тоту виділеної культури.

4. Ознайомитись з демонстраційними кольоровими рядами Гіса, які використовуються для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів.

Пзшшпиа. длятмоконтролю

1.Охарактеризувати хімічний склад бактерій.

2.Конструктивний та енергетичний метаболізм бактерій.

3.Назвати типи живлення бактерій.

4.Ферменти мікроорганізмів та їх практичне значення.

5.Дихання бактерій та його типи.

6.Основні закономірності росту бактеріальної популяції. Намалювати криву розмноження бактерій і позначити її основні фази.

7.Вимоги до живильних середовищ. Класифікація живильних середовищ.

8.Особливості морфології та фізіології вірусів.

9.Віруси бактерій (фаги) та їх практичне значення.

Ситуаційні задачі

1. Виберіть вірне твердження:

а) автотрофи використовують С02 для синтезу всіх вуглецемістких сполук;

б) до хемоорганотрофів належать всі хвороботворні бактеріі; в) прототрофи використовують глюкозу і солі амонію як єдине джерело

вуглецю й азоту; г) ауксотофи можуть рости на мінімальних середовищах;

д) до облігатних паразитів належать рикетсіі та хламідіі.

2. Кров хворого з підозрою на сепсис засіяли на цукровий МПБ. Через добу він став мутним, і з нього зробили пересів на кров'яний МПА. Назвіть наступні етапи виділення та встановлення виду збудника.

Відповіді

1.А,б,в,д.

2.Після макро- і мікроскопічного дослідження колоній іх відсівають на скошений агар для одержання чистої культури та її ідентифікаціі.

106

Розділ 4. ЕКОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Екологія (оікоБ - дім, місце проживання) - наука про закономір­ ності формурання і функціонування біологічних систем і їх взаєми­ ни з навколишнім середовищем. Її ще називають наукою про наше довкілля. Мікроекологія - наука про місце заселення мікроорганіз­ мів і їх екологічні зв’язки.

При вивченні мікробної екології користуються такими ж поняття­ ми, як і в загальній екології. Головні з них такі: популяція - сукупність особин одного виду, які проживають у певному біотопі - ділянці обмеженої території з однорідними умовами існування; мікробіоценоз - сукупність популяцій мікроорганізмів, які проживають в одному біотопі; екосистема - система, в яку входять біотоп і мікробіоценоз; біосфера - жива оболонка землі, загальна сума всіх екосистем.

Вже давно відомо, що мікроорганізми убіквітарні, тобто вони практично всюдисущі. У величезних кількостях вони зустрічаються в грунті, воді й повітрі. Середовищем їх проживання є рослини, холоднокровні й теплокровні тварини, організм людини. І скрізь бактерії знаходяться у вигляді мікробіоценозів. Сучасні мікробні біо­ ценози сформувались у результаті довготривалої еволюції.

Взаємовідносини (співжиття) різних видів бактерій між собою, а також із іншими формами життя називають симбіозом. Види симбіозів досить різноманітні.

1. Нейтралізм - існуючі в одному біотопі популяції мікробів не стимулюють і не пригнічують один одного.

2Мутуалізм - взаємовигідне співжиття, коли одна популяція синтезує речовини, які є основою живлення іншої (наприклад, буль­ бочкові бактерії і бобові рослини, аеробні й анаеробні мікроби в організмі людини).

3Коменсалізм - така форма симбіозу, коли мікроби живляться залишками їжі хазяїна, злущеним епітелієм кишечника тощо, але не завдають йому шкоди.

4Антагонізм - пригнічення однієї популяції іншою. Мікробиантагоністи виділяють антибіотики, бактеріоцини, жирні кислоти, які викликають загибель інших видів або затримують їх розмноження.

5і Паразитизм - такий вид симбіозу, при якому одна популяція (паразит) завдає шкоди хазяїнові, маючи для себе вигоду. До мікро- бів-паразитів відносять збудників бактерійних, грибкових і вірусних захворювань.

107

Мікрофлора грунту

Земля є найбільшим і найважливішим середовищем для проживан­ ня мікроорганізмів. Перші бактерії, як і все живе, з ’явились у воді, однак у пізніші геологічні періоди, коли на поверхні земної кори утворився грунт, саме він став основним вмістилищем мікробного світу й основною ареною його життєдіяльності.

Кількість мікробів в 1 г грунту може бути дуже велика: від 200 млн до 10 млрд. Удобрювані орні землі населені мікроорганізмами найбільш густо. Грунти лісів, сфагнових боліт, піски пустинь і кам’я­ нисті грунти містять мало бактерій. Самий поверхневий шар землі (кірочка товщиною 2-3 мм) містить мало мікробів, оскільки висихан­ ня і сонячні промені згубно впливають на них. Основна маса їх зна­ ходиться на глибині 10-20 см. На глибині 1-2 м непорушеної землі бактерії майже не зустрічаються.

Мікрофлора грунту дуже різноманітна і включає кілька сот видів. Тут зустрічаються нітрифікуючі, денітрифікуючі, азотофіксуючі бак­ терії, численні сірко-, залізобактерії, гриби, найпростіші, віруси. Вони відіграють колосальну роль у кругообігу речовин у природі, підвищують урожайність полів, забезпечують життя на Землі. Мікро­ організми грунту беруть активну участь у всіх процесах трансформа­ ції речовин і енергії: здійснюють синтез біомаси, біологічну фіксацію азоту, бродіння, гниття, денітрифікацію, кругообіг сірки, заліза, фосфору та інших елементів.

Із виділеннями людей і тварин у грунт можуть потрапляти і зберігатися протягом деякого часу збудники правця, газової гангрени, сибірки, черевного тифу, дизентерії, холери, окремі віруси. Для бацил ботулізму й деяких видів грибів земля є природним середови­ щем їх проживання. Особливого епідеміологічного значення набуває мікрофлора грунту під час воєн, коли при масових пораненнях знач­ но зростає небезпека забруднення ран землею, яка містить спори анаеробних бактерій, у результаті чого можуть виникати такі тяжкі ранові інфекції, як правець і газова гангрена.

Санітарно-показовими бактеріями грунту є кишкова паличка,

ентерокок, Со8Ігісііит рег£гіп^сп8 і термофільні мікроорганізми.

За наявністю перших трьох видів судять про ступінь фекального забруднення грунту. Точніша оцінка проводиться при визначенні колі-індексу - кількість бактерій групи кишкової палички в 1 г грунту. Визначають також загальне мікробне число (ЗМЧ) - кількість сапрофітних бактерій в 1 г землі.

108

Грунт вважають чистим, якщо його колі-індекс не перевищує 1000, а кількість термофільних бактерій знаходиться в межах 1001000. За епідемічними показниками грунт ще досліджують на наявність патогенних бактерій (сальмонел, шигел, паличок правця, газової гангрени, ботулізму, сибірки) та ентеровірусів.

Мікрофлора води

Вода морів, океанів, річок і озер, як і грунт, є природним середо­ вищем для існування багатьох видів бактерій, грибів, найпростіших а також мікроскопічних водоростей. У грунтових водах містяться поодинокі мікроорганізми. Основний фактор, який визначає кількість мікробів у воді, - наявність у ній необхідних живильних субстратів. Чим більше вода забруднена органічними речовинами, чим більше в неї потрапляє відходів і нечистот, тим більше в ній бактерій. Отже, вода рік, які протікають через населені пункти і вбирають масу стоків і каналізаційних вод, містить величезну кількість мікро­ організмів.

Мікрофлора води поділяється на власну (автохтонну) і випадкову (заносну). До постійних бактерій належать актиноміцети, мікрококи, псевдомонади, спірохети, непатогенні вібріони. Із морської води при­ бережних зон систематично висіваються вібріони, які спричиняють у людей гострі гастроентерити від вживання малосольної морської риби, креветок, мідій.

При забрудненні водоймищ стічними водами виявляють багато кишкових паличок, ентерококів, клостридій, спірил, вібріонів, енте­ ровірусів і ротавірусів. Анаеробні бактерії у воді зустрічаються рідко. Інколи в неї заносяться і певний час зберігаються хвороботворні мікроорганізми. Так, спори сибіркових бацил зберігаються у воді роками, збудники тифів, ентеровіруси, вірус гепатиту А, лептоспіри - кілька місяців, а збудники дизентерії, холери, бруцельозу - ще менше (дні, тижні). Отже, вода може стати могутнім фактором переда­ чі багатьох інфекційних хвороб.

Санітарно-показовим мікробом для води є кишкова паличка

(Escherichia coli).

Доброякісна питна вода повинна відповідати певним вимогам дер­ жавного стандарту. Наказом МОЗ України від 23.12.1996 р. затверд­ жено Державні санітарні правила і норми “Вода питна. Гігієнічні

109