Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

цього вони повинні вміти відповідно підготувати інструменти, посуд, пробірки, піпетки, перев’язний матеріал тощо та знати режими різних видів стерилізації.

Інструменти перед стерилізацією обробляють в такій послідовності Спочатку їх прополоскують у проточній воді, потім замочують у миючому розчині 15 хв, миють у тому ж розчині 0,5-1 хв, прополоскують проточною і дистильованою водою, висушують у сухожаровій шафі при 80-85 °С до повного зникнення вологи.

Пробірки, флакони, колби закривають ватними пробками. Пробірки загортають у папір по 25-30 шт., а чашки Петрі по 4-5 шт., або вміщують у стерилізаційні коробки (бікси). Пастерівські й градуйовані піпетки з широкого кінця затикають ватою, обгортають папером ; або вміщують у картонні чи металеві пенали по 10-15 шт. Живильні середовища в колбах, флаконах, пробірках також закривають пробками.

У лабораторній практиці використовують такі види стерилізації: а) високою температурою; б) механічна (холодна); в) хімічними речо­ винами і газами.

Існує багато способів стерилізації з допомогою високої температури.

1. Прожарювання в полум’ї пальника - швидкий і абсолютно надійний спосіб. Ним стерилізують бактерійні петлі, пінцети, пред­ метні й покрівні скельця.

2.Стерилізацію сухим жаром в сухожаровій шафі проводять при 160 °С протягом 150 хв, або при 180 °С - 60 хв після досягнення заданої температури. Стерилізують переважно скляний; посуд (рис. 36).

3.Кип’ятіння протягом 40 хв у спеціальних; стерилізаторах використовують для обробки хі- і рургічних інструментів, шприців, голок, гумових

Рис. 36. Сухожарова трубок. Для підвищення температури кипіння й* шафа усунення жорсткості води додають 1 % бікарбо-! нату натрію. Цей метод не забезпечує повної стерилізації оскількі^ спори деяких видів бацил і клостридій витримують кип’ятіння протя-і

гом декількох ГОДИН.		І
4.	Стерилізація парою під тиском - найбільш надійний метод повногб

знищення бактерій та їх спор. Вона досягається дією пари, температу­ ра якої під тиском вища, ніж при кип’ятінні. Таку стерилізацію проводять в автоклаві. Це двостінний міцний металевий котел ци­ ліндричної форми з кришкою, яка герметично закривається. Воду в

130

котел заливають через спеціальну воронку й нагріва­ ють за допомогою електричного струму. Сучасні авто­ клави макл> манометри і автоматичні регулятори включення і відключення струму, тримаючи заданий тиск, а отже й задану температуру всередині автокла­ ва (рис. 37). Робота з ним вимагає суворого дотримання правил безпеки, які викладені в інструкції до кожно­ го автоклава.

У автоклаві при 120 °С протягом 20 хв стерилізу­ ють прості живильні середовища (МПБ, МГІА), ізотонічні розчини, білизну, перев’язний матеріал, а при 134 °С - знешкоджують заразні матеріали,

відпрацьовані культури бактерій протягом 40 ХВ. Рис. 37.Автоклав Середовища з вуглеводами не витримують такої обробки, так як вони карамелізуються, у зв’язку з чим їх стерилізують текучою парою.

Для перевірки надійності роботи автоклавів і ефективності сте­ рилізації застосовують хімічні й біологічні контролі. Є хімічні речови­ ни, які мають певну температуру плавлення: сірка - 119 °С, бензойна кислота - 120-122 °С, бетанафтол - 123 °С, манноза і сечовина - 132-133 °С. Саме при таких температурах найчастіше здійснюють стерилізацію.

Названі хімічні речовини вміщують у скляні трубки, додають не­ велику кількість анілінового барвника, запаюють і кладуть між об’єктами, що стерилізуються. Рівномірне забарвлення препарата в трубці свідчить про належну температуру в автоклаві, а отже й надійність Стерилізації. При біологічному контролі в автоклав вміщують пробірку з споровою культурою. Якщо після стерилізації висів із пробірки не дав росту, це свідчить про загибель спор. Є відповідні контролі і для перевірки сухожарової стерилізації.

5.Стерилізація текучою парою (100 °С) проводиться в автоклаві

знезагвинченою кришкою. При нагріванні пара проникає між вкла­ деними об’єктами й стерилізує їх. Таким способом обробляють середо­ вища з вуглеводами. Оскільки одноразова дія пари не вбиває спори, вживають роздрібну стерилізацію - 3 дні підряд по ЗО хв. Ті спори, які не загинули при першому нагріванні, проростають до наступного Дня у вегетативні клітини й гинуть при другій і третій обробці. Для Т'их речовин, які не витримують 100 °С (білкові рідини, вітаміни, Деякі ліки), вживають так звану тиндалізацію - стерилізацію на воДяній бані при 58-60 °С протягом години 5-6 днів підряд.

131

6 . Пастеризація - термічна обробка молока, пива, вина, різних соків при 70 °С протягом ЗО хв або при 80 °С - 5-10 хв. Цей спосіб вперше запропонував Пастер для знищення безспорових форм мікробів, переважно патогенних і умовно-патогенних видів. Спори при цьому залишаються живими. Пастеризовані продукти зберіга­ ються на холоді.

7. Згортання (ущільнення) сироватки і яєчних середовищ із одно­ часною їх стерилізацією проводять у спеціальних згортувачах Коха з електричним підігрівом. Асептично приготовлені сироватки та яєчні середовища у нахиленому положенні прогрівають однократно при 80-90 °С одну годину. При підозрінні на мікробну контамінацію їх прогрівають при тій же температурі три дні підряд.

	8 .	Механічна (холодна) стерилізація прово
	допомогою фільтрування через дрібнопористі фільт­
	ри. Її використовують для відокремлення бактерій,
	від токсинів, вірусів, бактеріографів. У лабораторіях
	найчастіше використовують фільтри Зейтца (рис. 38).
	Фільтрування проводять через азбестові пластинки,
	які вміщують між циліндричною й опорною частинок^
Рис. 38. Фільтр	металевого корпусу апарата Зейтца. Обидві частини
Зейтца	з ’єднують гвинтами. Зібраний фільтр вставляють у

гумовий корок колби з боковим відростком. Повністю змонтований фільтр загортають у папір і стерилізують в автоклаві. Рідину для фільтрування наливають у металевий циліндр, з ’єднують боковий відросток колби з розріджуваним насосом, щоб створити вакуум у колбі й прискорити фільтрування. Фільтрат з колби набираютй1 стерильною піпеткою і досліджують.

Хімічним способом стерилізують вироби з гумових і полімерних матеріалів. Для цього використовують 6 % розчин перекису водню, & який занурюють вироби на 6 год при 18 °С і на 3 год при 50 °С. Можназастосувати розчин дексона з експозицією 45 хв при 18 °С. Післй закінчення стерилізації вироби двічі занурюють у стерильну дистих льовану воду, кожного разу змінюючи її, переносять корнцангом У стерильний бікс.

Газовий метод стерилізації парами формальдегіду, хлороформуй Р-пропілактону, окисом етилену використовують для знезараженні ендоскопічних інструментів, кетгута, апаратів для штучного крово­ обігу, пластмасових виробів. Інструменти для ендоскопії й автома-'

тичні піпетки можна також стерилізувати спиртом.

1

132

Практична робота

1. Виготовити ватні пробки, підготувати пробірки, флакони, колби, градуй овані, пастерівські піпетки, чашки Петрі для стерилізації в

сухож аровій шафі.

2. Ознайомитись із приладами для стерилізації та правилами роботи з

цими.

3. Врахувати результати посівів змиву з рук із попереднього заняття.

Ритання для самоконтуолю

1. Охарактеризувати такі поняття екології мікроорганізмів: популя­ ція, біотоп, мікробіо'ценоз.

2.Які є види симбіозів?

3.Яка роль мікроорганізмів у кругообігу речовин у природі?

4.Назвати санітарно-показові бактерії грунту, води, повітря.

5.Мікрофлора води, її практичне значення. Які мікробіологічні показники безпеки питної води?

6.Які захворювання передаються повітряно-краплинним способом?

7.Назвати основних представників мікрофлори людини в різних біотопах. Яке значення має нормальна мікрофлора для життя людини?

8.Що таке дисбактеріоз? Методи його виявлення, лікування та профілактики.

9.Охарактеризуйте вплив фізичних, хімічних, біологічних факторів на мікрорганізми.

10.Що таке стерилізація, дезинфекція, дезинсекція, дератизація, антисепттика і асептика? Які є види стерилізації?

1.Через стерильний мембранний фільтр пропущено 1500 мл водопро­ відної води. На ньому виросло 5 колоній E. coli. Зробіть висновок про якість води.

2.У повітрі операційної на початку робочого дня загальна кількість мікробів в 1 м3 повітря становила 750, гемолітичні стрептококи та золотисті стафілококи виявлялись в 100 л повітря. Оцінити санітарний стан повітря операційної.

3.У хворого при бактеріологічному дослідженні випорожнень виявлено: біфідобактеріі - 106/г , молочнокислі бактергі - 10і/г , кишкові палички - 104/г, гемолітичні кишкові палички - 102/г , стафілококи - 106/г , умовнопатогенні ентеробактеріі - 105/г , гриби роду Candida - 105/г . Зробіть висновок про стан мікробіоценозу кишечника.

4.Запропонуйте метод стерилізації середовищ, які містять речовини, Що не витримують високих температур.

Відповіді

1 Вода якісна, так як колі-mump дорівнює 300.

2Стан повітря в операційниій незадовільний.

3У хворого спостерігається дисбактеріоз.

133

Розділ 5. ГЕНЕТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ

Генетика бактерій та вірусів - наука, що вивчає механізми успад­ ковування генетичних ознак та їх фенотипні прояви.

Вона започаткована блискучими експериментами Грегора Менделя в 60-х роках минулого століття. Закони Менделя були підтверджені дослідами Г. де Фріза, К. Клорренса, Е. Чермака. Значний вклад у розвиток вчення про мінливість мікроорганізмів внесли К. Негелі (засновник теорії плеоморфізму - про безмежну мінливість бактерій), Р. Кох і Ф. Кон, які висунули ідеї мономорфізму, що стверджували постійність та незмінність бактерійних ознак, притаманних певним видам.

Значний внесок у вивчення законів мінливості мікроорганізмів зро­ били Л. Пастер, І. Мечніков, Л. Ценковський, М. Вавілов, М. ТимофєєвРесоцький. У 1944 р. О. Ейвері, К. Маклауд, М. Мак-Карті довели, що саме ДНК є речовиною, яка зберігає генетичну інформацію. Д. Уотсон і Ф. Крик, М. Уілкінсон у 1953 р. розшифрували генетичний код, встановивши особливості механізмів синтезу білка.

Організація генетичного матеріалу бактерії

Як відомо, генетичний апарат прокаріотів побудовано з двоспіральної нитки ДНК, яка складається з 3x10° пар нуклеотидів і замк­ нута в кільце. Вона суперспіралізована завдяки поліамінам (сперміну, спермідину), іонам магнію і на електронних мікрофотографіях має форму намиста.

ДНК складається з пуринових (аденін, гуанін) та піримідинових (тимін, цитозин) нуклеїнових основ - гетероциклічних азотистих сполук, до складу яких входить цукор дезоксирибоза. З’єднує поліме­ ри фосфорна кислота. Між ланцюгами існують ковалентні та водневі зв’язки, тому молекули легко розпадаються. Кількість аденінових основ дорівнює тиміновим, а гуанінових - цитозиновим.

Хромосома у функціональному відношенні поділяється на фраг­ менти, які називаються генами. Ген - елементарна одиниця спадко­ вості, що контролює синтез специфічного поліпептидного ланцюга (структурний ген) або діяльність структурних генів (ген-регулятор, ген-оператор). Представлено його невеликими ділянками геномної або епісомної ДНК. Кожний ген складається з триплетів (кодонів) нуклеїнових основ, які кодують одну амінокислоту.

134

Гени, які відповідають за синтез сполуки, позначають рядковими літерами латинського алфавіту, які відповідають назві сполуки. Наприклад, his+ - гістидиновий ген, 1еи+ - лейциновий ген. Гени, шо контролюють резистентність до антибіотиків, інших препаратів, позначаються літерою r (resistance - стійкість). Чутливі до препаратів бактерії позначаються літерою s (sensitive - чутливий). За цим прин­ ципом позначення kanr, risr означає резистентні до канаміцину та ристоміцину штами, a kans, riss - чутливі. Фенотип батерій познача­ ється аналогічно генотипу, однак прописними літерами.

Сукупність генів нуклеоїда та позахромосомних факторів спадко­ вості зумовлюють генотип бактеріальної клітини. Фенотип - інди­ відуальний вияв генотипу в конкретних умовах існування.

Існує певний механізм, за допомогою якого послідовність нуклеотидів у гені визначає послідовність амінокислот у білку.

Спочатку ДНК клітини деспіралізується, і на одній із її ниток, як на матриці, фермент ДНК-залежна РНК-полімераза за принципом комплементарності формує полірибонуклеотидний ланцюг, який на­ зивається інформаційною або матричною РНК (ІРНК, мРНК). Ця стадія синтезу білка називається транскрипція (transcri ptio - переписую).

Інформаційна РНК переноситься клітиною в цитоплазму, де розташовані рибосоми. Розпочинаєтся наступний етап - трансляція (translatio - перенесення). Саме в цей період на рибосомах відбувається зчитування генетичного коду ІРНК та побудова поліпептидних ланцюгів.

У цитоплазмі клітини завжди існують особливі специфічні нуклеї­ нові кислоти, які називаються транспортними РНК (тРНК). На одному з кінців вони мають триплет нуклеотидів (антикодон), а на іншому - місце для з’єднання з відповідною амінокислотою (кодон). Вони достав­ ляють необхідну амінокислоту до рибосоми, на якій відбувається елонгація (elongatio - подовження) поліпептидиого ланцюга.

Генетична інформація клітини може бути закодована як хромо­ сомними генами, так і генами, які знаходяться у позахромосомному стані, тобто відмежовані від хромосоми, але здатні до тривалого підтримання та відтворення в такій формі. їх виявлено у бактерій багатьох родів. Позахромосомні елементи спадковості представлено плазмідами, транспозонами, Is-елементами та фагами.

Найдрібнішими за своїми розмірами є Is-послідовності (insertion sequenses - вставлені йослідовності). Вони складаються з 1000 пар нуклеотидів і не несуть інших генів, крім генів, що відповідають за ї х переміщення у різні ділянки бактеріальної ДНК. В усіх випадках

135

вони пов’язані з хромосомною або плазмідною нуклеїновою кислотою і не здатні до самостійної реплікації. Вони виконують координуючу роль, пов’язуючи між собою всі елементи спадковості клітини, регулятор-*: ну функцію, а також здатні індукувати мутації типу делеції чи інверсії.

Транспозони (transposition - переміщення) є нуклеотидними послі­ довностями, які крім генів, що відповідають за транспозицію, можуть нести гени, кодуючі інші функції. Довжина їх сягає 2000-20000 нуклеотидних основ. Вони можуть існувати самостійно у вигляді кільцевої! молекули ДНК, не здатної до реплікації, або бути включеними до| складу бактерійних геномів і плазмід. Вони можуть нести інформацію про синтез, наприклад, бактеріальних ентеротоксинів, ферментів!

руйнуючих антибіотики.

1

Транспозони виявлено у клітинах дріжджів, бактерій, рослині комах, хребетних і навіть людей. Найважливіша їх властивість - здатні ність до міграції з одного реплікона до іншого. За рахунок цього вощі виконують регулюючу, кодуючу функції, здатні індукувати генш мутації. і

Плазміди - кільцеві молекули ДНК молекулярною масою до 10е« 108 Д з 1,5-400 тис пар основ. Вони можуть існувати в цитоплазмі я вільному стані або бути інтегрованими з клітинною хромосомою. Тощ їх називають епісомами. Плазміди містять у своєму складі tra-опероЯ (transfer - перенос), який забезпечує їх здатність до передачі, і гена які кодують якусь ознаку. їх називають трансмісивними, якщо вощ| самостійно передаються іншим клітинам за допомогою кон’югації,я нетрансмісивними, коли не мають власного апарату передачі, а ї ж реносяться разом трансмісивними або при трансдукції. Вони можу™ існувати в клітині у декількох копіях. Ж

Плазміди виконують регуляторну та кодуючу функції. Регулято Я ний ефект їх полягає в здатності представляти власні реплікоЯ при порушенні функціонування клітинних генів; кодуюча роль - Я внесенні в клітину нових ознак, які надають їй певних переваг п Я взаємодії з організмом хазяїна. Я

Сьогодні відомо декілька десятків різноманітних плазмід. СерЯ них найдетальніше вивчено плазміди F, Col, R, Ent, Ніу, бактерЯ циногенності, біодеградації. Плазміди F забезпечують перенос бакіЯ ріальної хромосоми при кон’югації. R-плазміди є факторами множиЯ ної резистентності до лікарських засобів. Вони кодують стійкість Я 10 антибіотиків та солей важких металів (Ni, Cu, Hg). Col-плазміЯ забезпечують синтез коліцинів - білків з летальною активністю npof

136

коліформних мікроорганізмів. Ніу-плазміди зумовлюють утворення гемолізинів у золотистих стафілококів, Еп1>плазміди забезпечують ентеротоксигенну активність штамів кишкової палички. Плазміди біодеградації надають мікроорганізмам здатність утилізувати незвичні субстрати: Сат-плазміда - камфору, Осі-плазміда - октану тощо.

Про плазмідну локалізацію гена можуть свідчити високі темпи втрати ознаки спонтанно, а також підсилення її під впливом підви­ щеної температури, хімічних речовин (акридинові барвники), спільна втрата і спільне набуття декількох ознак.

Сприяти проявам мінливості бактерій можуть деякі помірні та дефектні бактеріофаги. За своїми біологічними властивостями вони подібні до плазмід, можуть самостійно існувати в цитоплазмі бакте­ ріальних клітин. При інтеграції з хромосомою мікроба вони можуть надавати йому нові ознаки.

Таким чином, плазміди убіквітарні. Вони не мають вирішального значення для забезпечення існування бактерійних клітин, однак віді­ грають чи не найважливішу роль у створенні розмаїття генетичного матеріалу при природному відборі.

Мінливість мікроорганізмів

Однією з основних ознак будь-якої живої структури є її мінливість. Не стали винятком в цьому плані численні представ­ ники мікробного царства.

Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову або модифікаційну та спадкову або генотипну.

Модифікаційна мінливість полягає у зміні різноманітних власти­ востей мікроорганізмів під впливом факторів навколишнього середо­ вища, однак вона не зачіпає генетичний апарат клітини спадково не передається. Вона зумовлюється адаптаційними механізмами бактері­ альної клітини, її здатністю призвичаюватись до умов довкілля за рахунок активації генів, які перебувають у “німому” стані.

Підлягають модифікаціям найрізноманітніші властивості бактерій. Досліджено зміни морфологічних ознак внаслідок старіння клітини, появу довгастих, зігнутих паличок вульгарного протею під впливом фенолу, зміну морфології холерного вібріона в результаті дії Гліцерину. Під впливом пеніциліну, лізоциму, специфічних імунних сироваток грампозитивні та грамнегативні бактерії можуть втрачати

137

свою клітинну стінку, перетворюючись у Ь-форми. Клітина при цьому втрачає свою типову морфологію, набуває кулястої форми, в ній можуть з ’являтись дрібні зерна, вакуолі. Після припинення дії агента вони набувають звичного виду.

Отже, модифікаційні зміни нетривалі, характеризують ступінь пристосування бактерій до нових умов існування, вони є нормою реакції клітини, засвідчуючи потенційну здатність генотипу реагува­ ти на змінені умови існування.

При генотипній мінливості мікроорганізмів різноманітні ознаки бактерій успадковуються та передаються нащадкам. Вона може розвиватись внаслідок мутацій та рекомбінацій.

Мутаціями називають будь-які зміни послідовності нуклеотидів гена, що змінюють його структуру, а відповідно, й функціонування, але не пов’язані з рекомбінаційним процесом. Вважається, що мутацій­ ний процес лежить в основі еволюції мікроорганізмів у природі. Послі­ довність нуклеотидів може змінитись або при заміні однієї пари основ на іншу внаслідок помилки під час реплікації або при розриві ДНК з наступним випадінням чи інверсією фрагменту, який лежить між точками розриву, або внаслідок вставки якогось нового фрагменту.

Класифікувати мутації можна з різних точок зору. За своїм проя­ вом їх можна поділити на морфологічні, фізіологічні, біохімічні та інші залежно від виду ознаки, яка змінилась внаслідок мутації. Серед морфологічних ознак може змінитись забарвлення або характер колонії бактерій. Інша група - це мутації стійкості. Після них мікроор­ ганізм набуває здатності, наприклад, переносити токсичні концентра­ ції речовин, які пригнічують ріст диких штамів (резистентність д о , антибіотиків). До біохімічних мутацій належать прояви ауксотрофності та прототрофності.

За сво'ім походженням мутації поділяють на спонтанні та індуковані. Спонтанні мутації відбуваються з частотою 10"5-10"12 без втручання"; експериментатора, за, нібито, оптимальних умов існування мікробів»! Вони виникають внаслідок дії якихось не встановлених навколишніх^ факторів. |

Індуковані мутації виникають під впливом дії н а клітину встанов-і лених мутагенних факторів. Частота їх на декілька порядків вища,1 ніж спонтанних.

За локалізацією мутації подіяють на нуклеоїдні, які виникають в^ нуклеоїді клітини, та цитоплазматичні, що виникають у позахромосомних елементах спадковості - плазмідах; за кількістю генів, які

138

мутували, - на генні та хромосомні, за величиною - на великі (хро­ мосомні) та малі (точкові).

Хромосомні мутації частіше бувають інверсіями (фрагмент ДНК в молекулі перевертається на 180°), дуплікаціями (подвоєння ділянки хромосоми), делеціями (випадіння частини хромосоми), дислокаціями (відбувається зміна локалізації ділянки ДНК).

Точкові мутації частіше спостерігаються як делеція, вставка фрагменту ДНК (інсерція) або заміна основ. Якщо спостерігають за­ міну пуринових основ на пуринові, а піримідинових на піримідинові, таку мутацію називають транзицією. За умови заміни пуринової основи на піримідинову і навпаки, мутація називається трансверсією.

Будь-яка мутація, що змінює генотип дикого штаму, називається прямою мутацією. Якщо внаслідок мутації відновлюється вихідний генотип дикого штаму, вона називається зворотньою. Однак, коли відновлюється фенотип дикого штаму, але мутація відбувається в локусі, не зачепленому прямою мутацією, такий тип змін одержав назву супресорної мутації. Вона може бути внутрішньогенною та позагенною. Плейотропними називають такі мутації, які ведуть до зміни двох і більше ознак.

Збільшувати частоту мутаційного процесу можуть особливі фак­ тори, які називають мутагенами. Найдоступніший мутаген - ультра­ фіолетове випромінювання з довжиною хвилі 2600 А°. Воно викликає особливі пошкодження - утворення димерів тиміну та заміну основ. Іонізуюче опромінення (рентгенівські промені, у-промені) також спричиняє мутації різної природи. Велику групу складають хімічні мутагени. Найбезпечніший з них - азотиста кислота, яка дезамінує аденін. М-нітрозометилсечовина є супермутагеном й канцерогеном, здатним викликати різні типи мутацій. Не поступаються їй за своєю активністю нітрозогуанідин, етилметансульфонат. Високу мутагенну активність мають акридини, аналоги основ (5-бромурацил), які вклю­ чаються до складу ДНК між основами, викликаючи зсув рамки зчитування* До біологічних мутагенів належить перекис водню, що утворюється при метаболізмі всередині клітин, лікарські препарати, такі як нітрофурани, деякі антибіотики (мітоміцин С).

Однак протягом своєї еволюції бактерійні клітини виробили певні механізми, що забезпечують стабільність генетичного коду, оберігають його від мутацій або ліквідують їх негативні наслідки. Вони називаються репараціями. Репаративні процеси поширені у мікробів і контролюються за допомогою спеціальних генів.

139