Лабораторная работа доказательство функционирования белков как биокатализаторов (ферментов)

Цель работы: доказать каталитическое действие белков-ферментов, показать их высокую специфичность, а также наивысшую активность в физиологической среде.

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки на 1мл, водяная баня, термостат, 1%-ный раствор крахмала, 2%-ный раствор сахарозы, 1%-ный раствор иода, 5%-ный раствор сульфата меди, 10%-ный раствор гидроксида натрия, 0,2%-ный раствор соляной кислоты.

Ход работы:

1. Ферментативный гидролиз крахмала. В качестве фермента, гидролизующего крахмал на его составные части (мальтозу, глюкозу), выступает амилаза слюны. Оценка результатов опытов проводится с помощью цветных реакций с иодом и реакции Троммера. Соответственно продукты гидролиза крахмала не дают реакции с иодом, но положительно реагируют на реактив Троммера.

В 2 пробирки налейте по 10 капель 1%-ного раствора крахмала. В пробирку №1 (контроль) внесите 4 капли воды, а в пробирку №2 – 4 капли раствора слюны, разведенной в 5 раз. Перемешайте и поставьте в термостат или водяную баню на 15 мин при 37⁰С. Затем из пробирки возьмите 4 капли исследуемого вещества, которые внесите в 2 разные пробирки. В одну из них добавьте одну каплю 1%-ного раствора иода, а в другую – одну каплю 5%-ного раствора сульфата меди и 4 капли 10%-ного раствора гидроксида натрия, осторожно нагрейте до кипения (реакция Троммера). Аналогичную процедуру выполните с содержимым пробирки №2. Результат должен показать, что в присутствии воды гидролиза крахмала не происходит и реакция с иодом должна быть положительной, а реакция Троммера – отрицательной (гидрат окиси меди – голубой цвет), тогда как в присутствии амилазы слюны результаты должны быть противоположными, поскольку произошел гидролиз крахмала.

Нет реакции с иодом и произошло окрашивание в кирпично-красный цвет (закись меди) в реакции Троммера.

2. Специфичность действия ферментов.Каждый фермент действует только на одно вещество или группу сходных субстратов, что обусловлено соответствием структуры фермента, точнее его активного центра и структуры субстрата. Например, амилаза действует только на крахмал, сахараза – только на сахарозу.

Приготовление сахарозы: палочку дрожжей (100г) разотрите и залейте водой (400мл). через 2час отфильтруйте и храните в холодильнике. В две пробирки (№1 и №2) внесите по 10 капель 1%-ного раствора крахмала, в две другие (№3 и №4) – по 10 капель 2%-ного раствора сахарозы. Затем в пробирки №1 и №3 добавьте по 4 капли раствора слюны, разведенного в 5 раз, а в пробирки №2 и №4 – такое же количество раствора сахарозы. Перемешайте и оставьте в термостате на 15 мин при 37⁰с. После этого с содержимым всех четырех пробирок осуществите реакции с иодом и Троммера. Результаты занесите в таблицу.

№ пробирки	Субстрат	Фермент	Реакция с иодом	Реакция Троммера
1	Крахмал	Амилаза
2	Крахмал	Сахараза
3	Сахароза	Амилаза
4	Сахароза	Сахараза

В выводах следует отметить, в какой пробирке и при каких условиях обнаружено действие фермента и почему.

3. Влияние рН среды на активность фермента. Для каждого фермента существует определенное значение реакции среды, при котором он проявляет наивысшую активность. Изменение рН вызывает снижение или полное торможение деятельности фермента.

В 8 пробирок прилейте по 1 мл дистиллированной воды, а затем в пробирку №1 внесите 1 мл 0,2%-ного раствора соляной кислоты, перемешайте, отберите из нее 1 мл смеси и перенесите в пробирку №2. Перемешайте, отлейте 1 мл и перенесите в пробирку №3 и т.д. из пробирки №8 отберите 1 мл и вылейте, таким образом получите различные рН среды. После этого в каждую пробирку добавьте по 2 мл 1%-ного раствора крахмала и по 1 мл раствора слюны, разведенного 1:10. Пробирки встряхните и поставьте в термостат на 15 мин при 37⁰С. Затем охладите и добавьте во все пробирки по 1 капле 1%-ного раствора иода.

Полный гидролиз крахмала произойдет в пробирках №5 и №6, где рН среды раствора находится в пределах 6,8-7,2, т.е. оптимальных для действия амилазы.