Гуморальный иммунный ответ. Иммуноглобулины Объемная реакция агглютинации

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Постановка и учет объемной реакции агглютинации для определения титра антител.

Алгоритм постановки и учёта объемной (развернутой) реакции агглютинации для определения титра антител.

В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида.

В пер­вую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью пробирку и т.д.

Получив двукратные разведения сывороток ((двукратные – 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024), вносят в них по 1 - 2 капли антигена (1-2 млрд бактерий).

Контролями служат изотонический раствор натрия хлорида с анти­геном и исследуемая сыворотка без него.

Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре

37 °С, затем ведут предварительный учет, начиная с контрольных.

Отсут­ствие агглютинации в контрольных пробирках и наличие взвешенных хлопьев в двух-трех и более пробирках опыта свидетельствует о положительной реакции.

Окончательные результаты учитывают через 18 - 20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре.

Интенсивность реакции выражается плю­сами: "++++" – сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; "+++","++" и "+" –убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка.

Заостряя внимание на образовании и характере осадка, следует указать, что атрихиальные бактерии и риккетсии, имеющие лишь соматические антигены, склеиваются через 18 - 20 ч с образованием мелкозернистых, трудно разбиваемых при встряхивании осадков; жгутиконосные бактерии агглютинируются спустя 2 - 4 ч в виде рыхлых, легко взбиваемых хлопьев.

Занятие № 15

Аллергия (гиперчувствительность) Реакция преципитации Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Постановка и учет реакции преципитации по Асколи.

Алгоритм проведения РП по Асколи

В узкую пробирку диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой в количестве 0,3 -0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена.

Пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально.

При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку возникает четкая граница между двумя слоями жидкости.

Реакцию учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1 - 2 ч или через 20 - 24 ч.

При положительной реак­ции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым эк­страктом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Реакция преципитации в геле

РПГ ставится на гелевых пластинах или на чашках Петри (метод Оухтерлони).

В ка­честве геля для реакции используют 1 % хорошо отмытый про­зрачный агар.

Антигены и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном расстоянии.

Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитела и антигены образуют иммунологический комплекс в виде белой полосы.

При наличии сложного по составу преципитиногена его предварительно делят на составные компоненты в реакциях иммуноэлектрофореза.

Занятие № 16

ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ. ОСОБЕННОСТИ ТРАНСПЛАНТАЦИОННОГО И ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА

Реакция связывания комплемента, оценка иммунного статуса

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Постановка и учет основного опыта реакции связывания комплемента (РСК).

Алгоритм постановки основного опыта реакции связывания комплемента

Реакция ставится в общем объеме 1,0 мл, каждый из ингредиентов добавляется в рабочей до­зе, содержащейся в 0,2 мл.

Берут шесть пробирок:

• в первую пробирку вносят исследуемую сыворотку (пациента), антиген и комплемент (опытная пробирка),

• во вторую – положительную сыворотку, антиген и комплемент (положительный контроль),

• в третью - отрицательную сыворотку, антиген и комплемент (отрицательный контроль),

• в четвертую - исследуемую сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хло­рида (контроль сыворотки),

• в пятую - антиген, комплемент и 0,85 % раствор натрия хлорида вместо сыворотки (контроль антигена),

• в шестую – только 0,6 мл 0,85 % раствор натрия хлорида (контроль гемсистемы).

Одновременно гото­вят гемолитическую систему, смешивая равные объемы гемолитическую сыворотку в тройном титре и 3 % взвесь эритроцитов барана.

Про­бирки ставят в термостат при температуре 37 ⁰С на 1 ч.

Затем во все пробирки добавляют по 0.4 мл гемолитичес­кой системы (индикаторная система). После тщательного смешивания ингредиентов пробирки вновь ставят в термостат при 37 °С на 1 ч.

Результаты учитывают после извлечения из термостата и оконча­тельно - после 15 - 18 ч нахождения реакции в холодильнике.

При окончательном учете интенсивность реакции связывания комплемента учитывают по факту отсутствия реакции гемолиза, отмечает плюсами:

"++++" - резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно;

"+++", "++" - положительная реакция, отличается нарастанием окраски жидкости вследствие гемолиза уменьшения количества эритроцитов в осадке;

"+" - слабо положительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов.

Отрицательная реакция связывания комплемента обозначается знаком "–" при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно-розовую окраску («лаковая кровь»). Во всех контрольных пробирках, за исключением положительного контроля сыворотки и контроля гемсистемы при правильной постановке РСК должен наблюдаться гемолиз.

В настоящее время РСК ставят не в пробирках, а в специальных планшетах, внося в лунки планшета те же самые компоненты реакции и в той же самой последовательности, но объем компонентов РСК, вносимых в каждую из лунок значительно меньше (как минимум в 10 раз).

Занятие № 17