Методика разделения и идентификации компонентов смеси
Хроматографическая методика состоит из следующих основных этапов:
1) подготовка анализируемой пробы, выбор соответствующей неподвижной и подвижной фазы, подготовка сорбента (колонки или тонкого слоя);
2) нанесение пробы на тонкий слой сорбента или ввод ее в разделительную колонку;
3) собственно хроматографирование, т.е. передвижение вместе с подвижной фазой относительно неподвижной фазы;
4) обнаружение зон разделенных веществ, т.е. их детектирование и идентификация;
5) количественное определение веществ в разделенных зонах.
Общая схема колоночного хроматографа приведена на рис. 127.
Важнейшей частью такого прибора, кроме разделительной колонки, является детектор. Это прибор непрерывного действия, создающий аналитический сигнал (например, электрический ток) на соединения, присутствующие в подвижной фазе, выходящей из колонки (элюате). Подвижная фаза, вводимая в колонку, называется элюентом.
Рис. 127. Принципиальная схема колоночного хроматографа: 1 – устройство для ввода пробы в хроматографическую колонку (дозатор); 2 – хроматографическая колонка; 3 – детектор (анализирующая система); 4 – регистратор
Аналитический сигнал, создаваемый детектором, преобразуется с помощью самописца в так называемую внешнюю хроматограмму, графически показывающую зависимость интенсивности сигнала от времени. Если скорости перемещения компонентов достаточно различаются, то на выходе из колонки сначала появляется наименее сорбируемый компонент, затем следующий и т.д. В результате хроматограмма состоит из нескольких пиков, имеющих форму гауссовой кривой (рис. 128).
Рис. 128. Типичная хроматограмма смеси, состоящей из трех веществ, полученная методом ГЖХ
К основным хроматографическим параметрам, характеризующим поведение веществ в колонке, относятся: время удерживания (tR) и удерживаемый объем (VR).
Время удерживания– это время от момента ввода анализируемой пробы до регистрации максимума пика (рис. 128).
Удерживаемый объем– это объем подвижной фазы, который нужно пропускать через колонку с определенной скоростью, чтобы полностью элюировать вещество.
При постоянных условиях хроматографирования время удерживания и удерживаемый объем строго воспроизводимы и могут быть использованы для идентификации веществ.
Площадь пика на хроматограмме позволяет судить о количественном присутствии того или иного вещества в смеси.
Для идентификации веществ на тонкослойной хроматограмме используется степень или коэффициент разделения Rf, представляющий собой отношение путиlx, пройденного веществом к пути, пройденному растворителемl0(рис. 129):
Rf = lx/l0
Рис. 129. Тонкослойная хроматография. Анализируемую смесь (А + В) наносят на линию старта, подвижная фаза перемещается от линии старта к линии фронта. При правильном подборе адсорбента и растворителя компоненты образуют отдельные зоны (А и В)
Зоны разделенных веществ в тонкослойной хроматографии часто выявляют с помощью специальных веществ, которые образуют с разделяемыми компонентами смеси окрашенные соединения, проявляемые на неподвижной фазе в виде цветных пятен. Например, при разделении смеси аминокислот неподвижную фазу после проведения анализа обрабатывают раствором нингидрина. При этом на ней образуются области окрашивания, расположенные на разных расстояниях от линии старта в зависимости от адсорбционной способности той или иной аминокислоты (рис. 129).
В настоящее время хроматография является широко используемым, высокочувствительным, универсальным и экспрессным методом, позволяющим определить как качественный, так и количественный состав самых различных смесей веществ.
Особенно широко она применяется в биологических исследованиях для выделения из биологических жидкостей липидов, полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот, ферментов, аминокислот и других биологически активных соединений.
Хроматография широко применяется не только в медико-биологических исследованиях, но и в клинической практике. Анализ крови на присутствие в ней алкоголя, наркотиков, летучих веществ, вызывающих токсикоманию, проводят с помощью хроматографии за считанные минуты. Хроматография является незаменимым методом для допинг-контроля, т.е. обнаружения стимулирующих веществ в организме спортсменов. С помощью хроматографии можно выявить микрокомпоненты (не определяемые другими методами), которые появляются в биологических жидкостях при наличии той или иной патологии.
С каждым годом значение хроматографии, как важного диагностического метода, постоянно возрастает.