Эритроцитарный росток.

4 класс - эритробласт - первая морфологически определимая клетка красного ростка. Ядро круглое, занимает большую часть клетки, имеет нежную сетчатую структуру и 2-4 ядрышка. Цитоплазма ярко-базофильная без просветлений вокруг ядра, в виде узкого ободка окружает ядро. По мере созревания ЭКЦ, начиная с ЭБ, размеры ядра и клетки в целом уменьшаются.

5 класс - пронормоцит (проэритробласт) напоминает эритробласт, но в отличие от него меньшего диаметра, имеет резко очерченное округлое ядро, структура хроматина более грубая, местами утолщена, более компактна, отсутствуют нуклеолы. Цитоплазма резко базофильная с легким перинуклеарным просветлением.

Нормоциты. В зависимости от насыщения Hb-ном они делятся на базофильные, полихроматофильные, оксифильные. Hb накапливается в цитоплазме при участии ядра. Поэтому первые скопления Hb наблюдаются в перинуклеарной зоне. Базофильные нормоцит имеет ядро округлой формы, с грубой структурой хроматина с чередованием темных и светлых участков, напоминая колесо со спицами. Цитоплазма базофильная.

Полихроматофилы отличаются от базофильного окраской цитоплазмы, воспринимают и кислые и основные красители (на рисунке КМ и кровь).

Оксифильные по величине приближаются к эритроциту, имеют небольшое пикнотичное ядро, оксифильную цитоплазму. Это полностью насыщенная гемоглобином клетка, цитоплазма окрашена в розовый тон, воспринимает кислые краски( на рисунке двухядерный плазмоцит, справа оксифильный нормоцит).

С началом гемоглобинизации цитоплазмы происходит инволюция ядра, пикноз. Ядро приобретает грубую радиарную (колесовидную) структуру, затем становится грубым, пикнотическим ("вишневая косточка"). Клетка освобождается от ядра путем кариорексиса, реже кариолизиса.

6 класс - ретикулоцит. В нормальных условиях часть полихроматофильных нормоцитов теряют ядро, превращаясь в ретикулоцит. Он является незрелым эритроцитом. В нем определяется сетчатая субстанция, которая является артефактом и состоит из агрегированных митохондрий, комплекса Гольджи, рибосом и других органелл, которая при прижизненной окраске (бриллиантовым крезиловым синим, акридиновым оранжевым) выявляется в виде сетчатой субстанции. В мазках, окрашенных обычным способом, сетчатая субстанция не видна, и эритроциты имеют полихроматофильную окраску.

Образовавшийся в КМ ретикулоцит пребывает в нем 36-44 часа, а затем попадает в кровь, где дозревает в течение 24-30 часов. В период пребывания ретикулоцитов в КМ в них происходит синтез большого количества белковых фракций, входящих в состав мембран, синтез липидов и гема. Костномозговые ретикулоциты, каково бы ни было их абсолютное количество, образуют небольшой резерв красной крови. По ретикулоцитозу судят об эффективности эритропоэза. Содержание ретикулоцитов в норме 0,8-1,3, до 0,2-2 %.

Весь цикл развития от эритробласта до ретикулоцита составляет от 3-4 до 5-7 дней.

Собственно эритроцит. Эритроцит человека в норме имеет двояковогнутую, дискоидную форму. Плоский диск наиболее приспособлен к транспорту веществ из клетки и внутрь ее и к диффузии газов к центру клетки. Объем, соответствующий диску, имеет в 1,7 раза большую поверхность, чем такой же объем, соответствующий сфере и может умеренно изменяться без растяжения мембраны клетки.

Двояковогнутая форма эритроцита, эластичность, деформируемость мембраны позволяет клетке проходить через капилляры шириной 3 мкм, проникать в стенки синусоидов, возвращаясь к исходным параметрам (форме).

Эритроцит представлен клеточной мембраной, окружающей цитоплазму с включенными в нее гемоглобином и ферментами. Клеточная мембрана эритроцита представляет собой жидкий двойной липидный слой, в котором плавают белковые структуры. Взаимодействуя друг с другом белковые молекулы создают каркас мембраны, обеспечивающий ее прочность. Между белками и липидами существует прочная взаимосвязь. Липиды определяют подвижность белков и отвечают за пластичность и деформабельность.25-30 % мембранных белков составляет спектрин, существующий в виде димеров и тетрамеров. Спектрин, актин, протеины 4.1 и 4.9 образуют основу скелета мембраны, имеющего прочную жесткую структуру. Эритроцит теряет способность синтезировать белки и липиды после нескольких дней циркуляции в крови, поэтому особенно важно, чтобы на протяжении жизни эритроцита эти элементы были защищены.

С изменением цитоскелета эритроцита связаны некоторые формы гемолитических анемий - наследственные элиптоцитоз, пиропойкилоцитоз, отдельные варианты наследственного микросфероцитоза.

Время циркуляции эритроцита в кровотоке у взрослых составляет 100-120 дней.

По мере созревания эритроидных клеток в КМ происходит их гемоглобинизация.

Гемоглобин является дыхательным пигментом, относящимся к группе хромопротеидов. Он составляет около 95 % всей твердой части эритроцита. Гемоглобин это сложный белок, состоящий из белковой части - глобина и простетической части - гема. Молекула гемоглобина содержит 1 глобин и 4 гема. В каждом эритроците содержится около 289 млн. молекул гемоглобина. Гем представлен комплексом протопорфирина IX с железом. Одним из этапов синтеза гема является образование протопорфирина. Порфирины синтезируются во всех клетках организма, но основная масса в ядерных клетках эритроидного ростка КМ. Для синтеза одной молекулы гема необходимо 8 молекул аминокислоты глицина. В соединение с ним вступает янтарная кислота. Для осуществления этой связи в качестве кофермента необходим пиродоксаль-фосфат - производное витамина В₆. В результате реакции образуется α-амино-β-кетоадипиновая кислота, которая очень нестойкая и при отщеплении от нее группы СО₂ образуется δ-аминолевулиновая кислота (АЛК), из 2-х молекул которой образуется порфибилиноген (ПБГ). ПБГ под действием ферментов превращается в протопорфириногн III, а затем в протопорфириноген IX и протопорфирин IX. Протопорфирин IX при участии гемсинтетазы соединяется с Fe²⁺ и образуется гем. Протопорфирин состоит из 4-х пирроловых колец, в центре которых находится железо, соединенное с 4-мя атомами азота пирроловых колец двумя главными и двумя дополнительными связями. Так как координационное число железа равно 6, то остаются 2 неиспользованные координационные связи: с одной из них связывается глобин, а к другой присоединяется кислород или другие лиганды. Гем также синтезируется в мышцах для образования миоглобина, в клетках печени, для образования пероксидазы, цитохромов, каталазы.

Гем одинаков для всех видов гемоглобина, и различия в свойствах гемоглобина связаны с различием глобина.

Молекула гемоглобина представляет собой тетрамер, состоящий из 4-х полипептидных цепей. У человека продуцируются несколько типов цепей гемоглобина, которые при различных сочетаниях между собой определяют тип гемоглобина. У лиц с нормальным геномом встречается 4 типа полипептидных цепей глобина: α, β, γ и δ, отличающихся по составу и количеству аминокислот. В различные периоды развития человека отмечаются различные виды гемоглобина. В период онтогенеза выявляется гемоглобин Р (примитивный), к 8-ой неделе гестации 90 % составляет HbF. Он остается доминирующим весь период внутриутробного развития. Синтез HbA начинается с 9-ой недели гестации. К моменту рождения его содержание колеблется от 5 до 45 %.Затем его синтез резко увеличивается, а синтез HbF падает и к 6-ти месяцам его доля составляет менее 3 %, а HbA - 95-98 %. У взрослого к нормальным типам гемоглобина относятся HbA (α₂ β₂ - основной гемоглобин взрослого, 95-98 %), HbF (α₂γ₂ - фетальный гемоглобин, 0,5-1 %), HbA₂ (α₂δ₂ - минорный гемоглобин взрослого, 1,5-3,5 %).

Эритроцит является высокоспециализированной клеткой, основная задача которой состоит в транспорте кислорода из легких в ткани и двуокиси углерода обратно в легкие. Эта функция осуществляется гемоглобином эритроцитов. Каждая молекула гемоглобина может обратимо связывать и транспортировать не более 4-х молекул кислорода.

13/ Ретикулоциты: методики подсчёта и морфологического анализа, клинико-диагностическое значение.

Ретикулоциты - это молодые формы эритроцитов, образовавшиеся из нормобластов после потери ими ядра (безъядерные, незрелые эритроциты), созревание которых происходит в течение 24-48 ч после выхода в периферическую кровь из костного мозга, и отражающие регенеративную способность костного мозга (т.е. эритропоэтическую активность костного мозга). МОРФОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕТИКУЛОЦИТОВ

Ретикулоциты обычно крупнее, чем зрелые эритроциты. Цитоплазма ретикулоцитов содержит базофильную сеточку (ретикулум) в виде мелких зерен, отдельных нитей, клубочков и т.п., которая представляет собой агрегированные рибосомы и митохондрии. По степени зрелости различают 5 видов ретикулоцитов: (1) ретикулоциты, имеющие ядро (эритронормобласты), причем зернистость у них располагается в виде плотного венчика вокруг ядра; (2) ретикулоциты, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде клубка или глыбки;  (3) ретикулоциты, имеющие зернистость в виде густой сети; (4) ретикулоцитов, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде отдельных нитей;  (5) ретикулоциты, содержащие отдельные зернышки.  Запомните: в норме, по Г. А. Алексееву, почти 80% ретикулоцитов относится к IV – V группам. В норме в периферической крови содержится 0,2 – 1% ретикулоцитов («%» - содержание ретикулоцитов от общего числа эритроцитов). Данный показатель отражает возможность выхода ретикулоцитов в периферическую кровь и их дальнейшее превращение в зрелые эритроциты (созревание), как вариант нормы, уже в периферической крови (в течение нескольких часов). (!) При нормальном эритропоэзе большинство эритроцитов проходит стадию ретикулоцитов в костном мозге. Некоторые авторы отмечают, что у женщин количество ретикулоцитов несколько большее, чем у мужчин. У детей в первые дни жизни количество ретикулоцитов по разным данным может достигать 5 - 10%, а затем уменьшается. Увеличение ретикулоцитов их в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается: • при гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах); • при острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом); • при малярии;  • при полицитемии;  • при лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 - 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии);  • при остром недостатке кислорода; • при метастазах опухолей в костный мозг. Следует помнить, что в случае усиленного разрушения эритроцитов доля ретикулоцитов может превышать 50% вследствие искусственного завышения числа ретикулоцитов (как уже было отмечено ранее, доля ретикулоцитов рассчитывается в % от всех эритроцитов). В таких случаях ля оценки тяжести анемий используют «ретикулярный индекс», который рассчитывают по формуле: (% ретикулоцитов х гематокрит) / 45 х 1,85, где 45 – нормальный гематокрит, 1,85- количество суток, необходимых для поступления новых ретикулоцитов в кровь. Если индекс < 2 – говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, если > 2-3, то происходит увеличение образования эритроцитов. Истинный ретикулоцитоз: увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови с одновременным увеличением количества ретикулоцитов в костном мозге.  Ложный ретикулоцитоз: отсутствие повышенного количества ретикулоцитов в костном мозге при повышении их количества в периферической крови (что говорит об усилении вымывания ретикулоцитов из костного мозга в периферическую кровь). Фактором, приводящим к увеличению значения %-ого содержания ретикулоцитов могут быть прием следующих препаратов: кортикотропин, противомалярийные лекарственные средства, жаропонижающие препараты, фуразолидона (у маленьких детей), леводопы.  Запомните: ретикулоцитоз, без соответствующей эритронормобластической реакции костного мозга, наблюдается при раздражении отдельных участков его раковыми метастазами или воспалительными очагами. Возможной ошибкой при подсчете ретикулоцитов может быть их ложное завышение из-за наличия:  • включений в эритроцитах (тельца Жолли, малярийные паразиты);  • высокого лейкоцитоза; • аномальной формы гемоглобина; • гипертромбоцитоза; • гигантских тромбоцитов. Снижение количества или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается: • при арегенераторных апластических и гипопластических анемиях;  • при анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты (микроцитарно-гипохромные и мегалобластные анемии);  • при талассемии;  • при сидеробластной анемии;  • при метастазах рака в кость;  • при лучевой болезни и лучевой терапии;  • при лечении цитостатиками; • при аутоиммунных заболеваниях системы кроветворения;  • при заболеваниях почек;  • при алкоголизме;  • при рецидиве анемии Аддисона-Бирмера; • при микседеме. Факторы, искажающие результат лабораторного исследования %-ого содержания ретикулоцитов: • неправильный выбор антикоагулянта или недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом; • длительное сдавливание руки жгутом;  • прием сульфаниламидов (возможны как заниженные, так и завышенные результаты);  • переливание крови незадолго до исследования; • гемолиз пробы крови.  Показания к назначению анализа на ретикулоциты:  • оценка активности эритропоэза при состояниях, сопровождающихся гемолизом или кровопотерей; • ценка способности костного мозга к регенерации после цитотоксической терапии и трансплантации костного мозга; • ценка восстановления синтеза эритропоэтина после трансплантации почки; • допинговый контроль у спортсменов (прием эритропоэтина); • диагностика неэффективного гемопоэза или снижения продукции эритроцитов; • дифференциальная диагностика анемий; • детекция нарушения регенераторной способности костного мозга при дефиците железа, витаминов B12, B6, фолатов, меди и мониторинга соответствующей терапии; • оценка реакции на терапию эритропоэтином, эритросупрессорами.

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ

(1) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.  Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории. Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.  Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I). (2) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.  Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям. Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.  Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается. (3) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора. В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.  Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры: • ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией); • ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией); • ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией); • незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction). Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга. Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях. 

14. Ретикулоцитопении и ретикулоцитозы, причины развития, диагностическое значение их выявления.