Лизирующий раствор[править | править вики-текст]

Другим важнейшим реагентом является лизирующий раствор (гемолитик), который при добавлении в разведение крови приводит к лизису эритроцитов и в то же время сохраняет лейкоциты. Необходимо, чтобы гемолиз эритроцитов был качественный, поскольку в гемолизате подсчитываются лейкоциты, которых первоначально примерно в 1000 раз меньше, чем эритроцитов. Для обеспечения этих свойств лизирующий раствор, как правило, содержит сложную композицию ионных поверхностно-активных соединений.

В анализаторах с дифференциацией лейкоцитов на три популяции лейкоциты под действием лизирующего раствора изменяют свои размеры так, что выделяются фракции лимфоцитов (первый пик лейкоцитарной гистограммы, 35...90 куб. мкм), гранулоциты (крайний правый пик лейкоцитарной гистограммы, 120...400 куб. мкм). В средней части гистограммы (90...120 куб. мкм) в области так называемых "средних" клеток расположены моноциты, базофилы и эозинофилы. Таким образом гематологический анализатор по анализу размера клеток может определять процентную и абсолютную концентрацию лимфоцитов, гранулоцитов и "средних" клеток (суммарно моноциты, базофилы и эозинофилы). Наряду с факторами пробоподготовки свойства реагентной системы оказывают существенное влияние на качество дифференциации лейкоцитов.

Промывающие растворы[править | править вики-текст]

Промывающие растворы непосредственно не участвуют в процессе измерения, однако их свойства существенно влияют на стабильность аналитических характеристик анализаторов. Характерной особенностью гематологических анализаторов, использующих принцип Культера, является наличие счетных апертур малого диаметра. А, как известно, кровь содержит в себе ряд веществ, которые имеют тенденцию осаждаться на апертуре и внутренней поверхности гидравлической системы. Это постепенно приводит к засорам и ошибочным результатам. В некоторых случаях прибор просто останавливается и требует капитальной чистки. То есть качество промывающих растворов влияет на долговременную стабильность работы прибора.

Промывающие растворы бывают, в основном, трех типов. Первый тип - растворы для мягкой промывки магистралей анализатора между пробами, и они не несут в себе особых моющих свойств. Такие растворы имеют в своем составе поверхностно - активные вещества (детергенты). К сожалению, детергентные промывающие растворы практически не отмывают белки. Поэтому для очистки от белковых осадков применяют растворы на основе гипохлорита натрия - второй тип промывающих растворов. Эти растворы являются очень сильными депротеинезаторами. Однако, раствор гипохлорита натрия - это очень едкое вещество, и долгого контакта с ним не выдерживают детали из пластика (они трескаются), металла (они подвергаются коррозии). Поэтому злоупотреблять такими растворами нельзя. Данные растворы в основном применяются в экстренных случаях, когда необходимо быстро очистить счетную апертуру, а также для сервисных работ.

Современное решение проблемы качественной промывки прибора - применение ферментативных промывающих растворов. Благодаря наличию ферментов, такие растворы эффективно удаляют адсорбированные на стенках гидравлической системы белки и другие вещества. При этом они совершенно нейтральны и не оказывают вредного действия на детали прибора. Трудность создания таких промывающих растворов заключается в известном свойстве ферментов быстро терять активность. Вследствие этого, в мире имеется сравнительно немного фирм производителей ферментативных промывающих растворов.

8. Назовите и охарактеризуйте классы кроветворных клеток.

В моменту рождения ребенка весь КМ является красным, т.е. гемопоэтическим.

Структура костного мозга.

Первое описание костного мозга было дано Р.Вирховым, который выделил в костном мозге по внешнему виду красный, желтый и желатинообразный костный мозг. В 1868 г. Нейман, а затем в 1889 г. В.П.Образцов показали значение костного мозга как органа кроветворения. Детальное изучение клеточного состава и структуры костного мозга в норме и при патологии практически началось с внедрением М.И.Аринкиным в 1927 г. в клиническую практику метода стернальной пункции, а затем и прижизненного гистологического исследования подвздошной кости с помощью метода трепанобиопсии.

В целом кроветворная ткань достаточно равномерна распределена в организме: очаги кроветворения разной степени выраженности имеются у взрослого человека в 206 костях скелета (при рождении местами кроветворения являются только костные полости).

Костный мозг состоит из 2-х неравновеликих частей:

а) ретикулярная строма (желтый костный мозг)

б) клетки кроветворной ткани (паренхима, красный костный мозг).

Ретикулярная строма костного мозга состоит из кровеносных сосудов, нервных окончаний, костной капсулы и клеточных элементов, к которым относятся:

Фибробласты (клетки стромы соединительной ткани) – в гистологических препаратах имеют веретенообразную форму, цитоплазма серовато-базофильной окраски, по полюсам вытянута в виде хвостов, границы нечеткие. Ядро округлой формы, с разреженной или компактной структурой хроматина, в центре определяется ядрышко. Клетки с отсутствием ядрышка называют фиброцитами. В цитологических препаратах (мазках) клетки теряют отросчатость и могут напоминать лимфоидные.

Адипоциты (жировые клетки) – в гистологических препаратах хорошо различимы, имеют эксцентрично расположенное небольшое ядро (как у малого лимфоцита) и большую "пустую" бесцветную цитоплазму. Наличие в ней липидов можно обнаружить специальной окраской, например, суданом. В мазках адипоциты обычно не видны, поскольку их липидная цитоплазма растворяется при фиксации препарата в спирте.

Эндотелиальные клетки (клетки внутренней выстилки сосудов). В гистологических препаратах имеют вытянутое ядро и широкую беззернистую цитоплазму. В мазках либо неопределимы (морфология соответствует большому лимфоциту), либо представлены в виде тяжей, в которых содержатся ядра вытянутой формы.

Остеобласты (клетки костеобразования) – данные клетки выстилают костномозговые полости, образуя эндостальную поверхность и разграничивая костный мозг и кость. Образуя вокруг себя кость, остеобласт оказывается внутри нее и превращается в остеоцит. В препаратах остеобласты выглядят как достаточно крупные клетки (примерно в 2 раза крупнее эритроцита), удлиненной или неправильной формы. Ядро круглое или овальное, обычно расположено эксцентрично, имеет маленькое ядрышко. Цитоплазма без зернистости, окрашена в базофильные тона от серо-голубого до нежно-синего с фиолетовым оттенком. Таким образом, остеобласты по морфологии несколько напоминают плазматические клетки.

В целом описанные клетки относятся к собирательному понятию ретикулярных. При подсчете миелограммы в понятие "ретикулярные" рекомендуется включать все клетки без места в рядах кроветворения. В результате, в этот раздел, помимо вышеописанных, могут попасть макрофагальные элементы-донаторы железа, трудно идентифицируемые клетки стромы, редкие в костном мозге иммунобласты и другие неопределяемые клеточные элементы.

Таким образом, в традиционной миелограмме понятие "ретикулярные клетки" означает смесь кроветворных и стромальных элементов, лишенных точной морфологической определенности. В норме их содержание не должно превышать 2%. При таком количестве их идентификация не имеет принципиального значения. Идентификация становится необходимой при повышенном содержании "нетипичных" клеток, что встречается в первую очередь при остром лейкозе с появлением в костном мозге высокого процента клеток с признаками морфологического опухолевого атипизма. В таком случае клетки следует называть не "ретикулярными", а "атипичными", они нуждаются в четком морфологическом описании, поскольку имеют диагностическое значение.

Ретикулярная строма костного мозга, хотя и не содержит непосредственных предшественников клеток крови, косвенно участвует в кроветворении, выполняя следующие функции:

1. гемопоэтическая – доставка к кроветворным клеткам гуморальных факторов регуляции кроветворения и нервных сигналов;

2. опорная – обеспечивается за счет расположения и взаимоотношения сосудистой и нервной системы, а также костной капсулы, и не позволяет изменяться объему кроветворной ткани;

3. функция микроокружения – ретикулярная строма костного мозга закладывается и заселяется ранними предшественниками кроветворения еще в эмбриональном периоде; образуется своеобразная гемопоэтическая "ниша", основа которой представлена стромой;

4. трофическая – за счет ретикулярной стромы происходит доставка к гемопоэтическим клеткам питательных веществ, необходимых для активного деления и дифференцировки. Интересно, что кровеносная система костного мозга является замкнутой, т.е. непосредственного омывания паренхимы кровью не происходит. По-видимому, это является основным барьерным фактором, который в нормальных условиях препятствует поступлению незрелых клеточных элементов в периферическую кровь. Поступление же питательных веществ к кроветворной ткани осуществляется путем диффузии.

Кроветворная ткань костного мозга.

Продолжительность жизни клеток крови существенно короче существования многоклеточного организма. Кроветворная система поэтому находится в состоянии постоянного самообновления. В течение всей жизни в кроветворных органах происходит новообразование клеток крови. Этот процесс исключительно интенсивен и в ходе его производится поистине астрономическое число клеток - более 30 млн. в минуту. В течение жизни человека годовая продукция кроветворной системы составляет такое число клеток, что суммарная их масса примерно равна массе человека.

Кроветворная ткань представлена кроветворными клетками различных ростков кроветворения, которые имеют четкую морфологическую структуру и являются производными унипотентных клеток-предшественниц. Таким образом, кроветворная ткань образована клетками различной степени дифференцировки начиная с бластов. В целом масса кроветворной ткани (красного костного мозга) примерно равна 50 % от общей массы костномозгового вещества и составляет около 1400 г, что соответствует весу печени взрослого человека. Сроки дифференцировки кроветворных клеток от общего предшественника до зрелой клетки и количество делений, происходящее за это время у здоровых людей стабильны; в условиях повышенной потребности (например, при инфекции, острой кровопотере) процессы созревания костномозговых предшественников ускоряются. Поступление образовавшихся в костном мозге клеток в кровоток также равномерное, а сроки их циркуляции в периферической крови постоянны: эритроциты находятся в кровотоке 120 суток, тромбоциты – 10 суток, нейтрофилы – 10 часов. В обычных условиях костномозговое кроветворение не только покрывает потребность организма, но и производит довольно большой запас клеток, например, зрелых нейтрофилов в костном мозге содержится в 10-20 раз больше, чем в кровеносном русле, для ретикулоцитов имеет приблизительно трехдневный запас.

Регуляция костномозгового кроветворения и количества зрелых клеток в периферической крови в основном гуморального типа и осуществляется по следующим направлениям:

1. воздействие исходную клетку-предшественницу кроветворения – регулируется вступление ее в деление и дифференцировку;

2. воздействие на ранние клетки-предшественницы различных ростков – регулируется в основном дифференцировка по определенному ростку;

3. воздействие на депо зрелых клеток – регулируется скорость выхода их в периферическую кровь.

Современная схема кроветворения.

Схемой кроветворения называют схематическое описание последовательности дифференцировок в кроветворной ткани начиная от исходных клеточных звеньев и заканчивая неспособными к пролиферации формами. В настоящее время используется скорректированная схема Воробьева-Черткова-Бриллианта (1981), которая учитывает 2 основных гипотезы:

1. унитарное происхождение всех клеток крови (т.е. их происхождение от единого предшественника)

2. гистогенетическая независимость кроветворных клеток от клеток стромы костного мозга.

Согласно современной схеме, в кроветворении выделяют 6 кроветворных ростков (ряды кроветворения):

1. эритроидный;

2. гранулоцитарный (миелоидный);

3. мегакариоцитарный

4. моноцитарный

5. Т-лимфоцитарный

6. В-лимфоцитарный;

и 6 уровней дифференцировки (классов кроветворения):

1. стволовые кроветворные клетки

2. поли- дипотентные клетки-предшественницы

3. унипотентные клетки-предшественницы

4. бластные клетки

5. созревающие (дифференцирующиеся) клетки

6. зрелые (дифференцированные) клетки.

При изображении схемы традиционно кроветворные ростки располагают по горизонтали, а классы кроветворения – вертикально.

Характеристика классов кроветворных клеток.

1. Стволовые кроветворные клетки (СКК).

Данный класс представлен т.н. "родоначальными" кроветворными клетками, являющимися исходным звеном кроветворения. Морфологически эти клетки не идентифицируются в костном мозге, поскольку имеют морфологические признаки малого лимфоцита. Их отличительными признаками являются:

3. способность к длительному самоподдержанию собственной популяции без притока клеток из какого либо класса вышестоящих неидентифицируемых элементов, т.е. "независимость". Следует подчеркнуть, что в настоящее время свойство независимости не рассматривается как способность СКК к бесконечному, неограниченному самоподдержанию, а лишь означает, что эта способность у них максимальна по сравнению с другими кроветворными клетками.

4. максимальная способность к пролиферации (репродуктивный потенциал);

5. максимальная полипотентность – способность образовывать все типы кроветворных клеток или дифференцироваться по любому из ростков кроветворения. Полипотентность реализуется через дифференцировку, коммитирование и созревание. Термин "дифференцировка" является наиболее общим понятием и в физиологических условиях характеризует процесс необратимого развития от более молодых клеточных элементов к более зрелым.

6. наименьшая степень дифференцировки и отсутствие вследствие этого цитохимических маркеров.

Именно СКК заселяют ретикулярную строму костного мозга еще в эмбриогенезе. Исследования последних лет показали отсутствие значительных отличий в гемограмме у лиц старше 80 лет по сравнению с другими возрастными группами. Т.е. с возрастом количество СКК сохраняется. Это возможно благодаря особенностям развития СКК:

1. Деление СКК происходит симметрично, т.е. образуются 2 однотипные дочерние клетки, после чего одна из них вступает в процессы дальнейшего деления и дифференцировки, давая начало клону кроветворных а затем и зрелых клеток, а вторая остается в покое. Именно такой механизм ранее и давал основании говорить о способности СКК к бесконечному самоподдержанию;

2. В последние годы убедительно доказано, что СКК организма участвуют в процессах кроветворения поочередно, т.е. нормальный гемопоэз происходит на основании смены клонов. Клональный (каскадный) характер кроветворения сближает гемопоэз в норме и при лейкозах, однако в физиологических условиях клетки имеют гораздо более низкий пролиферативный потенциал по сравнению с лейкозными. Каскадная теория кроветворения хорошо согласуется с гипотезой о смене "гемопоэтических клеточных пластов", которая наблюдается в течение всей жизни организма и, возможно, лежит в основе различий в частоте заболеваемости различными видами лейкозов у детей и взрослых. Если исходить из клоновой теории гемопоэза, то можно полагать, что по мере жизнедеятельности организма происходит постепенное "старение" только тех клонов СКК, которые в данный момент участвуют в продукции дифференцированных клеточных элементов, после чего клон ликвидируется. Пролиферативный же потенциал клеток, не участвующих в поддержании гемопоэза с возрастом практически не меняется. Только при некоторых экстремальных ситуациях (например, при многократных курсах цитостатической терапии) большинство СКК участвуют в кроветворении а, следовательно, и стареют.

Регуляция пролиферативной активности СКК осуществляется через межклеточные взаимодействия с фибробластами и жировыми клетками ретикулярной стромы, а также через гуморальные факторы со стороны ближайших потомков. СКК содержат большое количество рецепторов, способных воспринимать такого рода сигналы и реагировать на запросы организма через изменение темпов пролиферации и направления дифференцировки.