• наследственные: синдром Франкони (Фанкони), врожденная тромбоцитопения, краснуха новорожденных;

• приобретенные: лейкозы, миелодиспластические синдромы, миелофиброз, метастазы новообразований в костный мозг; дефицит витамина В12 и фолиевои кислоты (мегалобластные анемии), ночная пароксизмальная гемоглобинурия, вирусные инфекции, интоксикации, наследственные аномалии, ионизирующее облучение, прием миелодепрессивных препаратов, циклическая тромбоцитопения, почечная недостаточность. в результате повышения деструкции PUT: инфекции (значительное, иногда катастрофическое снижение PLT, наблюдается при Конго-Крымской геморрагической лихорадке), эклампсия беременных, гемолитико-уремический синдром (ГУС), ВИЧ-инфекция, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, системная красная волчанка, хронический лимфолейкоз, хронический активный гепатит, посттрансфузионная тромбоцитопения; гемодиализ, кровотечения, разрушение в селезенке (гиперспленизм при болезнях накопления, лимфомах, волосатоклеточном лейкозе, миелопролиферативных заболеваниях, портальной гипертензии);

• в результате потребления PLT: синдром ДВС.

• Клинико-диагностическое значение тромбоцитопений (по с.А. Луговской и соавт., 2002)

  Патогенетические механизмы	Клинические ситуациии патологические состояния
  Недостаточность гемопоэза -нарушение образования тромбоцитов	Гипо-и апластические состояния, лейкозы, метастазы рака в костный мозг, ионизирующее облучение, химиотерапия, дефицит витамина В12 или фолиевои кислоты, вирусные инфекции, сепсис, милиарный туберкулез и др.
  Повышенное потребление тромбоцитов	Кровопотеря, ДВС, гигантская гемангиома, тромбоз, геморрагическая тромбоцитемия.
  Повышенная деструкция тромбоцитов  (внутриклеточный, внутрисосудистый гемолиз)	Ауто- и иммунные гемолитические анемии, изоиммунные, гетероиммунные (гаптеновые), лекарственные, вирусные, системная красная волчанка, лимфопролиферативные заболевания, поеттрансфузионные реакции и др.
  Механические повреждения тромбоцитов	Протезирование клапанов сердца, экстракорпоральное кровообращение.
  Интоксикация: экзогенная, эндогенная	Химические вещества, лекарственные препараты, алкоголь, уремия, тяжелые заболевания печени.
  Повышенная секвестрация в селезенке (гиперспленизм)	Спленомегалия при циррозе печени, портальной гипертензии, гистиоцитозах, болезнях накопления, болезни Гоше, синдроме Фелти, туберкулезе селезенки, миелопролиферативных заболеваниях, талассемии.

• Иммунные тромбоцитопении

• (по С.А. Луговской и соавт., 2002)

  Заболевание	Характеристика антитромбоцитарных антител
  Идиопатическая (аутоиммунная) тромбоцитарная пурпура	Аутоантитела против неизмененных антигенов тромбоцитов  больного
  Гаптеновая (гетероимунная) тромбоцитопения	Гаптеновые аутоантитела против измененных или чужеродных антигенов на поверхности тромбоцитов
  Лекарственная тромбоцитопения	Антитела против комплекса лекарства (хинин, гепарин) с тромбоцитарным антигеном
  Тромбоцитопения, ассоциированная с вирусной инфекцией	Антитела против вирусных антигенов, фиксированных на поверхности  тромбоцитов , или против измененных тромбоцитарных антигенов
  Аллоиммунная тромбоцитопения	Аллоантитела против аллоантигенов тромбоцитов  плода или переливаемых тромбоцитов
  Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопеническая пурпура	Аллоантитела матери, проникшие в организм плода. Направлены против аллоантигенов тромбоцитов  плода и отца, отсутствующих на тромбоцитах  матери

• Повышение количества PLT в крови - тромбоцитоз - характерно для миелопролиферативных заболеваний. Тромбоцитоз наблюдается также при злокачественных новообразованиях, после операций, при воспалительных заболеваниях (острый ревматизм, ревматоидный артрит, туберкулез, остеомиелит), после спленэктомии, циррозе печени, кровотечениях, в период выздоровления при мегалобластных анемиях, лечении кортикостероидами, остром гемолизе, физических перенапряжениях.

• Тромбоцитозы

  Тромбоцитоз	Заболевания и синдромы
  Реактивный	Спленэктомия, острая кровопотеря, острый гемолиз, состояние после операции, злокачественные новообразования, ревматоидный артрит, туберкулез, язвенный колит, остеомиелит
  Опухолевый	Миелопролиферативные заболевания (хронический миелолейкоз, идиопатический миелофиброз, эритремия, хронический мегакариоцитарный лейкоз), острый мегакариобластный лейкоз, идиопатическая геморрагическая тромбоцитемия

• Средний объем  тромбоцита  (МРV)

• У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа  тромбоцитов . MPV увеличивается с возрастом. У мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

• Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы  тромбоцитов  от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) - не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. Преходящее увеличение MPV отмечается у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, органическими растворителями. MPV - важный  диагностический показатель функции  тромбоцитов .

• PDW - показатель, являющийся мерой гетерогенности размеров (анизоцитоза)  тромбоцитов . Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

• Как артефакт, ложно завышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микроцитов, шизоцитов, микроагрегатов  тромбоцитов , фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

• Этот показатель находится в обратной зависимости от числа  тромбоцитов  и их периода жизни. В каждом конкретном случае важна не только величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными показателями. Так, увеличение PDW с одновременным снижением MPV свидетельствует о преобладании микротромбоцитов среди общей популяции  тромбоцитов  (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов ). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоцитов ведет к увеличению PDW, но MPV может оставаться в пределах нормы. В современных гематологических анализаторах отдельными показателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбоцитов (MacroPLT).

• PDW может применяться для дифференциальной диагностики. Так, увеличение PDW свыше 15% было обнаружено у 50% больных эссенциальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с реактивным тромбоцитозом и лишь у 14% здоровых людей.

• РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычисляется суммированием прямо измеренных объемов  тромбоцитов  или произведением среднего объема  тромбоцитов  на их число.

• У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа  тромбоцитов  усиливается тромбопоэз, в циркулирующую кровь выбрасывается большее число молодых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении  количества  циркулирующих  тромбоцитов  снижается продукция их в костном мозге, тем самым уменьшается процент макротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что, в конечном счете, приводит к патологии первичного гемостаза и риску возникновения кровотечений, или повышение РСТ, увеличивающее активность  тромбоцитов  и их способность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

• Нормальные  значения  РСТ варьируют в пределах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что снижение РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было отмечено, что этот показатель оказался более чувствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число  тромбоцитов .

• Если скрининговые методы указывают на нарушение функции  тромбоцитов , необходимо выполнить специальные тесты  с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых пациентом (отмена за 7-10 суток перед исследованием глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых каналов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаверина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

• Методы определения длительности кровотечения

• Длительность кровотечения является скрининговым тестом для выявления нарушений первичного гемостаза. Метод основан на определении времени кровотечения из нанесенной на поверхности кожных покровов небольшой ранки стандартного размера. Это время зависит от способности сосудисто-тромбоцитарных гемостатических механизмов останавливать кровотечение из поврежденных мелких сосудов и капиллляров и поэтому его продолжительность может характеризовать состояние первичного гемостаза. Оно может быть нарушено вследствие дефектов сосудистого звена, неполноценности функциональных свойств кровяных пластинок или дефицита/дефекта плазменных кофакторов тромбоцитарных реакций (фибриногена, фактора Виллебранда), выраженной тромбоцитопении. При снижении числа  тромбоцитов  менее 100x109/л имеется прямая связь между степенью тромбоцитопении и удлинением времени кровотечения. Длительность кровотечения коррелирует также с геморрагическими тенденциями при тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда. Увеличение времени кровотечения наблюдается и при тяжелой анемии (Ht<0,20) из-за нарушения участия эритроцитов в процессе первичного гемостаза.

• Помимо решения  диагностических  задач  тест  рекомендуется проводить для контроля за эффективностью применяемой гемостатической терапии, для своевременного выявления угрозы геморрагических осложнений при проведении дезагрегационной терапии. Длительность кровотечения должна быть определена у больного в период предоперационной подготовки, т.к. значительная часть больных с патологией тромбоцитарного звена гемостаза имеет скрытую форму заболевания, которая тем не менее дает тяжелые кровотечения в ходе операции и после нее.

• В настоящее время используют в основном два принципа при определении длительности кровотечения; проведение теста в условиях, не затрудняющих течение первичного гемостаза, и в условиях, препятствующих его осуществлению.

• К первым методам относится тест Duke, при выполнении которого колотую ранку глубиной 3,5 мм наносят скарификатором в нижней части мочки уха; выступающие капли крови осторожно, не прикасаясь к раневой поверхности, снимают фильтровальной бумагой через 15-30 с. Регистрируют время от момента нанесения укола до прекращения кровотечения, которое в норме не превышает 4 мин. Тест малочувствителен и не позволяет выявить нарушения при тромбоцитопатиях легкой и средней тяжести.

• Наиболее распространенными за рубежом методами определения длительности кровотечения второй группы являются различные модификации метода Ivy, который предложил проводить исследование на верхней конечности в условиях веностаза, затрудняющего сосудистые реакции.

• Определение длительности кровотечения по методу Айви

• Принцип метода

• Оценивают длительность кровотечения после разреза кожи предплечья скарификатором с глубиной разреза 3 мм. Стандартизация метода достигается равной глубиной кожного разреза и созданием венозного стаза путем повышения венозного давления до 40 мм рт. ст. при помощи сфигмома-нометра, что предупреждает эффект преждевременного склеивания краев раны.

• Реактивы и оборудование

• 70% раствор этанола.

• Сфигмоманометр.

• Скарификатор, способный осуществить разрез кожи глубиной 2-3 мм.

• Ход выполнения

• Сфигмоманометр накладывают на плечо, нагнетают в нем давление, равное 40 мм рт. ст., и поддерживают такое давление в течение всего исследования.

• Ладонную поверхность предплечья обрабатывают раствором этанола.

• Натягивают кожу предплечья в поперечном (по отношению к костям предплечья) направлении.

• Скарификатором наносят три разреза кожи по 5—10 мм (направление разреза должно быть перпендикулярно натяжению кожи предплечья, т. е. параллельно костям предплечья) глубиной 3 мм и включают секундомер.

• Капли крови осторожно удаляют фильтровальной бумагой путем ее смачивания через каждые 15-30 с.

• Регистрируют время остановки кровотечения из каждой ранки.

• Снижают давление в манжете сфигмоманометра.

• Вычисляют средний результат длительности кровотечения для каждого из трех разрезов.

• Оценка результатов исследования

• Существует несколько схожих методов для оценки длительности кровотечения [WW Duke, 1910; C.F. Borchgrevink, B.A. Waaler, 1958], однако метод Айви отличается от аналогичных неплохой воспроизводимостью и малой травматичностью. В оригинальном исполнении нормальное время кровотечения не превышает 8 мин, однако указанный норматив условен, поскольку результаты определения длительности кровотечения этим методом значимо варьируют в зависимости от варианта скарификатора и опыта исследователя, поэтому необходимо уточнить нормативы для каждой лаборатории. При тромбоцитопениях, тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда длительность кровотечения часто удлинена, а при изолированных дефектах коагуляцион-ного гемостаза (гемофилии и др.) длительность кровотечения не отличается от нормы.

• Причины ошибок

• Нестандартный скарификатор, неглубокий (менее 3 мм) разрез кожи, недостаточная квалификация лаборанта.

• Исследование агрегационной функции  тромбоцитов 

• Принцип метода

•  Тромбоциты  способны агрегировать под воздействием различных субстанций, называемых индукторами (стимуляторами) агрегации (АДФ, адреналин, арахидоновая кислота, тромбин, кальциевый ионофор А23187, коллаген, фибрин-мономер, бычий коагуляционный фактор VIII, ристоцетин и др.). Изучение агрегационной функции тромбоцитов  осуществляют при помощи специального прибора - агрегометра. В основе записи агре-гатограммы этим прибором — принцип Борна, который предполагает графическую регистрацию выраженности уменьшения оптической плотности богатой  тромбоцитами  плазмы в процессе агрегации  тромбоцитов . В случае нарушения агрегационной функции  тромбоцитов  происходит незначительное изменение оптической плотности, что и регистрирует этот прибор.

• Забор крови и подготовка плазмы для исследования

• После пункции локтевой вены самотеком кровью наполняют пластиковую или силиконированную пробирку, в которую предварительно добавлен раствор цитрата натрия (соотношение объемов крови и цитрата натрия равно 9:1). Затем пробирку тщательно и аккуратно (без встряхивания) перемешивают в течение 2-3 минут.

• Материалом для исследования является бедная  тромбоцитами  плазма.

• БТП получают в два этапа. На первом этапе получают богатую  тромбоцитами  плазму, для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 7 минут при 240 g. На втором этапе богатую  тромбоцитами  плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют в течение 15 минут при 1200-1400 g.

• Реактивы и оборудование

• 0,11 М раствор цитрата натрия (Na3C6H607).

• Агрегометр с компьютером и принтером.

• Стимуляторы агрегации (АДФ, адреналин, коллаген и др.). В табл. 12 представлены оптимальные конечные концентрации наиболее распространенных стимуляторов агрегации  тромбоцитов .

• Таблица. Оптимальные конечные концентрации стимуляторов агрегации  тромбоцитов 

  Индукторы тромбоцитарной агрегации	Конечные концентрации индукторов
  АДФ	5-10µМ
  Адреналин	10µМ
  Коллаген	2-5 ug/ml
  Арахидоновая кислота	0,5 mM
  Ристоцетин	1,25-1,50 mg/ml
  Ристоцетин для диагностики 2В типа болезни Виллебранда	0,25 mg/ml

• Для проведения анализа предварительно необходимо подсчитать число  тромбоцитов  на гематологическом анализаторе или микроскопическим методом.

• Ход определения

• Материалом для исследования является богатая  тромбоцитами  плазма, но для калибровки прибора необходима еще и бедная  тромбоцитами  плазма.

• Поскольку при разном числе  тромбоцитов  необходимы разные концентрации индукторов агрегации, следует приготовить богатую плазму с одинаковым числом  тромбоцитов  для всех образцов (исследуемых и контрольных). Для стандартизации числа  тромбоцитов  следует развести богатую  тромбоцитами  плазму бедной таким образом, чтобы число  тромбоцитов  стало равным 150-300 х 10⁹. Например, число  тромбоцитов  600 х 10⁹, поэтому исследуемую богатую  тромбоцитами  плазму необходимо развести бедной  тромбоцитами  плазмой этого же больного в 2 раза. Таким образом, на первом этапе исследования очень важно определить число  тромбоцитов .

• Для записи агрегатограммы любому агрегометру необходимо определить оптическую плотность и ряд других параметров в исследуемых образцах, поэтому компьютерный алгоритм агрегометра будет требовать установить в измерительные гнезда пробирки с бедной и богатой  тромбоцитами  плазмами.

• В кювету агрегометра вносят 0,3 мл богатой  тромбоцитами  плазмы (со стандартным числом  тромбоцитов  150—300 х 10⁹), инкубируют пробирку в гнезде для измерения в течение 60—120 с для нагрева богатой  тромбоцитами  плазмы до 37 °С, затем включают магнитную мешалку, добавляют 0,015 мл раствора индуктора агрегации. В момент добавления индуктора агрегации включают запись регистрации агрегации*.

• Оценка результатов исследования

• Существует много способов оценки агрегатограмм, но наиболее информативно измерение степени агрегации и угла наклона, поскольку неплохую воспроизводимость демонстрируют именно эти показатели. Их нормальный диапазон зависит от большого числа причин (марки агрегометра, используемых реагентов, числа  тромбоцитов , конечной концентрации индуктора, скорости вращения магнитной мешалки и многих других), поэтому общепринятых диапазонов нормы при измерении агрегационной функции  тромбоцитов  нет. Это вынуждает врачей-лаборантов уточнять нормативы самостоятельно.

• Применение низких концентраций стимуляторов агрегации дает возможность оценить раздельно первую и вторую волны агрегации. Большую ценность имеет информация о наличии или отсутствии второй волны агрегации, поскольку именно вторая волна на агрегатограмме отражает реакцию высвобождения содержимого тромбоцитарных гранул (плотных и а-гранул). Весьма полезно при записи агрегации  тромбоцитов  использовать несколько стимуляторов агрегации. При наличии геморрагического синдрома и отсутствии нарушений агрегации  тромбоцитов необходимо повторно выполнить исследование через 1—1,5 месяца. И наоборот, при наличии специфичных изменений агрегации для болезни Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна и другой патологии необходимо повторно исследовать агрегационную функцию  тромбоцитов .

• Причины ошибок

•  Тест  очень чувствителен к дефектам преаналитического этапа. Даже минимальный недостаток цитрата натрия вследствие низкого гематокрита ведет к значительным погрешностям и невоспроизводимым результатам.

• Последовательность манипуляций и объемы смешиваемых реагентов могут отличаться для разных типов агрегометров.

• Для исследования агрегации необходимо использовать специальные иглы для пункции кубитальной вены, которые способны наполнить кровью пробирки с цитратом натрия самотеком. Забирать кровь шприцом нельзя.

• Некачественная обработка магнитных мешалок и пробирок ведет к грубым ошибкам. Существенную помощь в обработке лабораторной посуды оказывают ультразвуковые мойки.

• Неточный замер прибором оптической плотности богатой и бедной  тромбоцитами  плазмы также приводит к ошибкам. Подобный дефект возможен при наличии царапин на пробирках.

• Неточное определение числа  тромбоцитов  и, как следствие, исследование образца плазмы с нестандартным числом тромбоцитов  является причиной ошибок.

• Варианты результатов записи агрегации  тромбоцитов  методом Борна при различных вариантах нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

Патология гемостаза	АДФ	Арахи-доновая кислота	Коллаген	Адреналин	Ристоцетин
Тромбоцитопатия	Норма или снижение*	Норма или снижение*	Норма или снижение*	Норма или снижение*	Норма
Влияние аспирина или других нестероидных противовоспалительных препаратов	Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны	Отсутствие или значимое снижение	Норма для концентрации 5 ug/ml или снижение для концентрации 2 ug/ml	Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегатограмме	Норма или умеренное снижение
Нарушение пула хранения	Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны	Норма	Норма	Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-грамме	Норма
Синдром Бернара-Сулье	Норма	Норма	Норма	Норма	Отсутствие или значимое снижение
Нарушение реакций высвобождения (секреции) из тромбоцитарных гранул	Норма или снижение (часто уме­ренное) с нарушением второй волны	Норма	Норма	Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато- грамме	Норма
Тромбастения Гланцманна	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие	Отсутствие	Норма
Болезнь Виллебранда	Норма	Норма	Норма	Норма	Отсутствие или значимое снижение (иногда норма при 2N, повышение при типе 2В)

• *

• При тромбоцитопатиях может быть нарушена агрегация с одним (обуславливая так называемую парциальную тромбоцитопатию) или разными индукторами агрегации.

• Иногда  диагностические  трудности возникают при дифференциальной диагностике болезни Виллебранда и болезни Бернара-Сулье, поскольку варианты нарушений при исследовании агрегационной функции  тромбоцитов  при этих состояниях одинаковы. В этом случае помогает добавление в исследуемую богатую  тромбоцитами  плазму нормальной БТП или крио-преципитата. Эта простая модификация восстанавливает ристомициновую агрегацию у больных с болезнью Виллебранда, но не исправляет нарушение агрегации при болезни Бернара-Сулье.

14. Автоматизированное исследование тромбоцитов, факторы, влияющие на результат анализа.

Подсчет  тромбоцитов  на гематологическом анализаторе.

На сегодняшний день методом выбора при  исследовании   тромбоцитов  является их определение на автоматическом анализаторе. Автоматические счетчики позволяют получать достаточно надежные результаты при определении количества  тромбоцитов .

При подсчете  тромбоцитов  по Фонио коэффициент вариации находится в пределах 20%, в камере Горяева - составляет 7-10%, тогда как автоматический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%.

Современные анализаторы сигнализируют о выходе количества  тромбоцитов  за референтные пределы, наличии агрегатов  тромбоцитов , макротромбоцитов или других элементов, сравнимых по объему с  тромбоцитами (микроэритроциты), что существенно облегчает трактовку получаемых результатов.

В то же время следует иметь в виду, что в отличие от ручного подсчета  тромбоцитов , где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют  тромбоциты  и эритроциты в одной камере без предварительной обработки.  Тромбоциты  распознаются по размерам в диапазоне 2-20 фл. Это создает проблему дифференцирования больших форм  тромбоцитов  (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровавшихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис).

Ложное занижение числа  тромбоцитов  может быть при их агрегации, агглютинации под действием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании  тромбоцитов  к лейкоцитам (тромбоцитарный «сателлитизм»). При подсчете на гематологических анализаторах в качестве антикоагулянта используется ЭДТА. При наличии аутоантител к тромбоцитам  калиевая соль ЭДТА инициирует агрегацию  тромбоцитов , что проявляется псевдотромбоцитопенией.

Нормальные величины. Количество  тромбоцитов  у здоровых людей составляет 170 - 350 х 10⁹/л.