voronina

Рис.19. Пентануклеотид РНК

91

Рис. 20. Пентануклеотид ДНК

Повне написання полінуклеотидних ланцюгів складне і громізд- ке, тому запропоновано різноманітні схематичні зображення.

Використовують систему літер: літерами А, Г, Ц, Т у ДНК і А, Г, Ц, У в РНК позначають азотисті основи, літерою «Ф» або «Р» – 5'-початок полінуклеотидного ланцюга, а 3'-ОН пентози – його кі- нець. У нашому прикладі: 5'Р-У-А-У-Г-Ц-3'ОН (для РНК) і для ДНК – 5'Р-Т-дА-Т-дГ-дЦ-3'ОН, або ще простіше: 5'УАУГЦ-3', 5'ТдАТдГдЦ-3'. Використовують і такі зображення:

92

Дослідження первинної структури ДНК показали, що в полінук- леотидних ланцюгах можуть спостерігатися такі закономірності:

1. Повторення окремих нуклеотидних блоків (від 10 до 104 ко- пій), наприклад:

ЦТТЦГАЦТТЦГА

ГААГЦТГААГЦТ 2. Переривання блоків, що повторюються, наприклад:

ЦТТЦГААТГЦАЦТТЦГА

ГААГЦТТАЦГТГААГЦТ

3. Повторення блоків нуклеотидів у зворотному порядку (зво- ротні повтори або паліндроми – від грецьк. palindromeō – перевер- тень), наприклад:

ЦТТЦГАТЦГААГ

ГААГЦТАГЦТТЦ

Послідовність основ в одному з ланцюгів паліндрому збігається з послідовністю основ іншого ланцюга, якщо читати її в протилеж- ному напрямку. Зазначені закономірності мають відношення до прояву біологічної активності ДНК.

Нуклеотидний склад ДНК і РНК. Полінуклеотидні ланцюги нуклеї- нових кислот у клітині сполучаються в багатьох випадках з білками, утворюючинуклеопротеїни. PНK входить доскладурибонуклеопротеїнів (PНП), ДНК– дезоксирибонуклеопротеїнів (ДНП). Звичайно для вста- новлення нуклеотидного складу нуклеїнових кислот нуклеопротеїни ек- страгують з клітин 1M розчином нейтральних солей. Білкову частину відокремлюють, використовуючи розчин фенолу, суміш хлороформу з ізоаміловим спиртом, а також детергенти, наприклад, додецилсульфат натрію, або використовують розщеплення білків ферментами протеї- назами. Після відокремлення білка нуклеїнову кислоту осаджують, поступово додаючи етиловий спирт, а потім визначають нуклеотидний склад, тобто набір і порядок розташування нуклеотидів, що служить дуже важливою характеристикою нуклеїнових кислот. Один з основних шляхів визначення складу нуклеїнових кислот ґрунтується на дослі- дженні продуктів їх гідролізу. Оскільки міжнуклеотидні зв'язки в поліну-

93

клеотидах є складноефірними, то вони можуть гідролізуватися як у кис- лому, так і в лужному середовищі. Хімічний гідроліз ДНK майже не ви- користовують через ускладнення його побічними процесами. Переваж- но використовують ферментативний гідроліз за участю ферментів нук- леаз. Нуклеази специфічні до типу нуклеїнових кислот, їх розділяють на рибонуклеази і дезоксирибонуклеази. Вилучення та ідентифікацію ком- понентів нуклеїнових кислот здійснюють за допомогою фізико-хімічних методів (хроматографія, електрофорез та ін.). Піримідинові і пуринові основи звичайноідентифікують за допомогою УФ-спектроскопії.

Крім визначення нуклеотидного складу, важливим завданням є також встановлення нуклеотидної послідовності, тобто порядку чергування нуклеотидів. Загальний підхід полягає у використанні блочного методу. Спочатку полінуклеотидний ланцюг спрямовано розщеплюють на дрібніші блоки – олігонуклеотиди – і визначають їхню нуклеотидну послідовність. Для розділення молекул ДНК на фрагменти використовують ферменти рестриктази, оскільки вони «розрізають» молекулу ДНК у визначених місцях, а саме там, де розташовані специфічні послідовності нуклеотидів у ДНК.

На даний час виділено і вивчено велику кількість рестриктаз і складено картотеки їх дії. Використовуючи рестриктази, можна розрізати молекулу ДНК на велику кількість фрагментів, кінцеві послідовності яких відомі, оскільки вони залежать від різновиду використаної рестриктази. Отримані фрагменти розділяють мето- дом електрофорезу в поліакриламідному гелі. Послідовність нук- леотидів у коротких фрагментах ДНК визначають за допомогою ряду методів. Проте необхідно знати, у якому порядку перебувають фрагменти в цілій молекулі ДНК. З цією метою ДНК розрізають за допомогою іншого набору рестриктаз, отримують інший набір фрагментів, а потім знову визначають послідовність нуклеотидів. Перекривання послідовностей, визначених за допомогою різних методів розрізання, дозволяє встановити за допомогою ЕОМ по- рядок розташування фрагментів. Цей метод визначення послідов- ності нуклеотидів у ДНК одержав назву секвенірування.

Дезоксирибонуклеїнові кислоти (ДНК)

Структура нуклеїнових кислот краще вивчена в найпростіших живих організмів – прокаріотів (бактерії, рікетсії, мікоплазми, синьо- зелені водорості). У клітинах прокаріотів міститься одна хромосома, яка складається з однієї молекули ДНК, не відокремленої від цито- плазми мембраною (немає оформленого ядра). У клітинах еукаріо- тів (тварини, рослини, гриби, більша частина різновидів водоростей) знаходиться ядро, оточене мембраною. Ядерний матеріал розподі- ляється між кількома хромосомами, основу яких складають ДНК, бі- лки (головним чином – гістони) і невелика кількість РНК.

ДНК, як і білки, мають первинну, вторинну і третинну структури. Первинна структура ДНК – кількість, якість і порядок розташу- вання залишків дезоксирибонуклеотидів у полінуклеотидному лан- цюзі. Великих успіхів у вивченні структури ДНК досягли Е.Чаргафф і співробітники його лабораторії (Англія), які, використовуючи метод

94

хроматографії, вперше в 1950 р. визначили нуклеотидний склад ДНК, виділеної з різних організмів. Вони встановили, що співвідно- шення азотистих основ у ДНК підпорядковується універсальним за- кономірностям, які одержали назву правил Чаргаффа:

1.Сума пуринових (Пур) нуклеотидів дорівнює сумі піримідино- вих (Пір) нуклеотидів (ΣПур = ΣПір, або Пур/Пір = 1).

2.Молярний вміст гуаніну дорівнює молярному вмісту цитозину

(Г = Ц, або Г/Ц = 1).

3.Молярний вміст аденіну дорівнює молярному вмісту тиміну

(А = Т, або А/Т = 1).

4.Кількістьаденінуіцитозинудорівнюєкількостігуанінуітиміну.

5.У ДНК, виділених з різних джерел (співвідношення нуклео- тидів неоднакове): в одних організмів переважає вміст аденіну

над гуаніном, тиміну над цитозином, а в інших – навпаки. У зв'яз- ку з цим Е.Чаргафф запропонував положення про видову специфі- чність ДНК залежно від нуклеотидного складу. Це положення бу- ло всебічно досліджене в лабораторії російського вченого А.М.Бі- лозерського. Його школою було створене унікальне, найповніше у світовій науковій літературі зведення нуклеотидного складу ДНК майже для всіх таксономічних груп організмів.

Вторинна структура ДНК – це просторова організація полінук- леотидних ланцюгів в її молекулі. З'ясування вторинної структури ДНК – одне з найважливіших досягнень у біології, оскільки при цьому одночасно було відкрито механізм передачі спадкової інфо- рмації в ряді поколінь. У 1953 р. Дж.Уотсон і Ф.Крік, узагальнюючи роботи багатьох учених (М.Уілкінс, Ф.Фраклін, Е.Чаргафф, А.Тодд, Р.Гослінг, Л.Полінг та ін.), описали вторинну структуру ДНК, зо- бразивши її у вигляді подвійної спіралі (рис.21).

а

б

в

Рис. 21. Схематичне зображення подвійної спіралі ДНК:

а– за Дж.Уотсоном і Ф.Кріком; б – А-форма ДНК, в – В-форма ДНК;

с– залишок дезоксирибози; р – залишок фосфорної кислоти.

95

Згідно з моделлю Дж.Уотсона та Ф.Кріка, молекула ДНК скла- дається із двох полінуклеотидних ланцюгів, правозакручених навко- ло спільної осі з утворенням подвійної спіралі, що має діаметр 1,8– 2,0 нм з періодом ідентичності (кроком) 3,4 нм та відстанню між пло- щинами основ 0,34 нм. Ці два полінуклеотидних ланцюги обвивають один одного, утворюючи праву спіраль, де вуглеводно-фосфатні гру- пи розташовуються ззовні, а нуклеотидні основи – всередині. На ко- жен виток спіралі припадає 10 пар основ. Азотисті основи двох лан- цюгів вибірково з'єднуються між собою водневими зв'язками, утво- рюючи специфічні пари: А-Т, Г-Ц. Аденін та тимін з'єднуються дво- ма водневими зв'язками, а гуанін та цитозин – трьома:

Аденін

Тимін

Гуанін

Цитозин

Такі азотисті основи називаються комплементарними. Специфі- чне спарювання азотистих основ зумовлює комплементарність, тобто доповнюваність і взаємозалежність ланцюгів ДНК один від одного. Так, якщо в одному ланцюзі ДНК знаходиться послідовність АТГЦ, то в другому ланцюзі йому відповідає послідовність ТАЦГ. Таким чи- ном, послідовність нуклеотидів в одному полінуклеотидному ланцюзі автоматично визначає послідовність нуклеотидів в другому, компле- ментарному ланцюзі. Водневі зв'язки між комплементарними осно- вами називають «поперечними» взаємодіями на відміну від «вертика- льної» взаємодії між площинами цих пар основ, розташованих одна над одною, ніби складених у стоси, звідси ще одна назва – стекінг- взаємодії (від англ. stacking – складання в стоси). Міжплощинні верти- кальні взаємодії визначаються ван-дер-ваальсовими силами.

Ланцюги ДНК спрямовані протилежно одне одному: в одному ланцюзі напрямок 5′→ 3′, в другому – 3′→ 5′.

Необхідно зауважити, що конфігурація подвійної спіралі ДНК сильно змінюється в залежності від кількісного вмісту води та іон- ної сили навколишнього середовища. Методами рентгенострукту- рного аналізу доведено існування не менше чотирьох форм ДНК,

96

які одержали назву А-, В-, С- і Т-форм. Конфігурації двох із них у най- простішій формі представлені на рис.21 (б і в), з якого видно, що в А-форми спостерігається деяке зміщення пар основ від осі молеку- ли до периферії, що відбивається на розмірах (2,8 нм – довжина од- ного витка, в якому замість 10 міститься 11 нуклеотидів; змінюєть- ся відстань між нуклеотидами та ін.).

На даний час відомо, що між А- і В-формами ДНК здійснюють- ся взаємні переходи. В-форма ДНК найбільше відповідає моделі Дж.Уотсона і Ф.Кріка. Ці переходи, які відбуваються під впливом розчинників або білків, очевидно, мають певний біологічний зміст. Вважається, що в А-формі ДНК виконує роль матриці в процесі транскрипції (синтез РНК на молекулі ДНК), а в В-формі – роль ма- триці в процесі реплікації (синтез ДНК на молекулі ДНК) (див. Пе- ренос генетичної інформації і біосинтез білка в клітинах).

Подвійна спіраль характерна для більшості молекул ДНК. Од- нак ДНК може мати й інші форми. Так, деякі віруси містять однола- нцюгову ДНК; зустрічаються також кільцеві форми ДНК (плазміди).

Третинна структура ДНК. Дослідження будови ДНК показало, що лінійні двоспіральні або кільцеві форми ДНК у просторі утворю- ють спіралізовані і суперспіралізовані форми, тобто утворюють тре- тинні структури. У частинках вірусів, клітинах бактерій, як і в ядрах вищих організмів, ДНК щільно «упакована» і утворює складні струк- тури. Наприклад, у хромосомі кишкової палички довжина ДНК дося- гає 1 мм й більше, а довжина клітини не перевищує 5 мкм. Одна з найменших молекул ДНК – вірусна, але якщо ж її розтягнути, то во- на буде в багато разів довша, ніж сам вірус. Отже, суперспіралізація в першу чергу необхідна для «упакування» величезної молекули ДНК у малому об'ємі ядра або клітини.

Третинна структура ДНК прокаріотів й еукаріотів має свої особ- ливості, пов'язані з будовою та функціями їх клітин. Для третинної структури ДНК вірусів і бактеріофагів характерною є наявність спе- цифічної суперспіралізації одно- або дволанцюжкових або кільцевих форм. Третинна структура ДНК еукаріотичних клітин утворюється за- вдяки багаторазовій суперспіралізації молекули, однак, на відміну від прокаріотів, вона реалізується у формі комплексів ДНК з білками.

ДНК еукаріотів майже вся знаходиться в хромосомах ядер, лише невелика її кількість міститься в мітохондріях, а в рослин – ще й у пластидах. Сумарний матеріал хромосом – хроматин – містить ДНК, гістонові і негістонові білки, невелику кількість РНК та іонів металів. Близько 50% хроматину складають прості білки гістони, котрі за вмістом залишків амінокислот аргініну і лізину, поділяються на п'ять груп: H1, Н2А, Н2В, Н3, Н4. Так, гістон H1 дуже багатий на лізин, а гістон Н4 – на аргінін. Гістони взаємодіють з ДНК головним чином через іонні зв'язки, котрі утворюються між негативно заря-

97

дженими фосфатними групами ДНК і позитивно зарядженими лізи- новими й аргініновими залишками гістонів. Усі гістони зазнають модифікацій: ацетилювання, метилювання, фосфорилювання та по- лі-АДФ-рибозилювання. При цьому в їх молекулах змінюється роз- поділ електронної щільності, що призводить до зміни їх здатності взаємодіяти з ДНК. У цьому, очевидно, полягає один з механізмів регуляції дії генів (див. Регуляція біосинтезу білків). Негістонові біл- ки містять велику кількість залишків кислих амінокислот (глутамі- нової й аспарагінової), тобто є поліаніонами. З цими білками пов'я- зують специфічну регуляцію активності хроматину.

В організації хромосом виділяють три рівні, які відображають і рівні третинної структури ДНК. Перший рівень – нуклеосомний. Ди- спергований хроматин виглядає в електронному мікроскопі як лан- цюжок намистинок-нуклеосом. Нуклеосома містить ДНК довжиною 160–240 пар нуклеотидів, одну молекулу гістону Н1 і по дві молекули інших груп гістонів (октет гістонів). Гістоновий октамер утворює ядро нуклеосоми, або нуклеосомний кор, який являє собою диск діа- метром 11 і товщиною 5,7 нм. На поверхню цього диска намотується ділянка ДНК довжиною 145–150 нуклеотидних пар (див. рис.22).

Рис.22. Схема структурної організації ДНК у хроматині хромосом

Між коровими частинками розташовані ділянки ДНК – лінкери, їхня довжина змінюється в залежності від типу клітин. Лінкерні ді- лянки ДНК або є вільними, або зв'язані з гістоном H1 і негістонови- ми білками. Близько 90% ДНК входить до складу нуклеосом, а реш- та ДНК – до складу лінкерних ділянок. Вважають, що нуклеосоми – це фрагменти неактивного хроматину, а лінкерні міжкорові ділян- ки – фрагменти активного хроматину.

98

Другий рівень організації хромосом– це утворення із нуклеосомної ниткитовстішихфібрил(20–25 нм). Вважають, щофібрилимаютьформу соленоїдів, якіутворюютьсявнаслідокскручуваннянуклеосомноїнитки.

Третій рівень організації хромосом вивчений недостатньо. Існує припущення, що соленоїди утворюють петлі, тобто додатково упа- ковуються, внаслідок чого зменшуються лінійні розміри ДНК при- близно в 200 разів. Суперспіралізовані петлі являють собою домени ДНК, які розцінюються як одиниці реплікації і транскрипції хрома- тину. Петлеподібна доменна організація сприяє укладці хроматину, при цьому лінійні розміри ДНК зменшуються в 104 разів.

Цитоплазматична ДНК. У цитоплазмі еукаріотів міститься не- велика кількість ДНК (менш ніж 1% усієї ДНК клітини). Вона одер- жала назву цитоплазматичної і відрізняється від ядерної ДНК нукле- отидним складом і молекулярною масою. Генетична інформація, що міститься в ній, обумовлює цитоплазматичну спадковість. Цитопла- зматичні гени знаходяться в мітохондріях і хлоропластах.

Бактеріальні плазміди. У цитоплазмі багатьох бактерій окрім хромосомної ДНК містяться додаткові маленькі кільцеві молекули ДНК, присутність котрих необов’язкова для життя клітини. Вони оде- ржали назву плазмід. Плазміди здатні автономно розмножуватися, стабільно успадковуються. Деякі плазміди можуть включатися в хромосому бактерій; вони називаються епісомами. Дрібні плазміди містять генетичну інформацію в середньому для двох білків, великі можуть кодувати приблизно 200 білків. Дрібних плазмід міститься в бактеріальній клітині декілька десятків, великих – одна-дві. Плазміди виконують як загальні, так і специфічні функції. Всім плазмідам влас- тива, наприклад, здатність до автономної реплікації (відтворення), а також несумісність – дві споріднені плазміди не можуть існувати в од- ній клітині. Біологічна роль плазмід велика: вони забезпечують бак- теріям селективні переваги під час зміни умов навколишнього сере- довища. Завдяки здатності до переносу й автономної реплікації плаз- міди широко використовуються в генетичній інженерії.

Мігруючі елементи ДНК. Останнім часом накопичились дані про іс- нування «стрибаючих генів», тобто таких ділянок ДНК, які можуть пе- реміщуватися з одних частин генома в інші. Ці мігруючі елементи ДНК беруть участь у регуляції дії генів та індукції хромосомних перебудов. Вони сприяють здійсненню незвичайних рекомбінаційних перебудов. Є два типи мігруючих елементів прокаріотів: ІS-елементи і транспозо- ни. ІS-елементи, інсерційні сегменти (від англ. insertion sequences) або вставні послідовності містять лише ті гени, що необхідні для вбудову- вання в ДНК. Їх розмір у більшості випадків від 800 до 1400 нуклеотид- них пар. IS-елементи впливають як позитивно, так і негативно на екс- пресію(роботу) сусідніх генів, тобтонаїх функціонування.

99

Транспозони– це більш складні мігруючі елементи, до складу яких входить 3000–25000 нуклеотидних пар. Вони подібні до IS-елементів, але крім генів, відповідальних за здатність до переміщення, містять та- кож додаткові гени, наприклад, генистійкості долікарськихпрепаратів.

Елементи, подібні до ІS-елементів і транспозонів прокаріотів, відкриті й у ссавців. Мобільні дисперговані гени (МДГ) еукаріотичних організмів нараховують 5000–10000 нуклеотидних пар, які обмежують- ся паліндромами. Встановлено, що МДГ впливають на структуру і ро- боту інших генів. Останнім часом виявлено значну подібність будови транспозонів прокаріотів, МДГ еукаріотів і онкогенних провірусів.

Таким чином, зміни в геномі еукаріотів не обмежуються лише рід- кісними мутаціями і генетичними рекомбінаціями. Наявність транспо- зуючих елементів може виступати як фактор регуляції диференціюван- ня клітин і генної активності, спричиняти мутації. Особливо важливим є те, що висока частота мінливості зумовлюється не лише зазначеними, а й іншими механізмами, аніж тими, які відповідають за мутації, що ви- никли під впливом екзогенних чинників. Проте у звичайних умовах не- стабільні генетичні елементи в переважній більшості заблоковані; то- му, хоча уявлення про стабільність еукаріотів і зазнали деяких змін, за- садиїх залишаються незмінними.

Рибонуклеїнові кислоти (РНК)

Первинна структура РНК – кількість, якість і послідовність роз- ташування залишків рибонуклеотидів у полінуклеотидному ланцюзі. Дослідження первинної структури різних видів РНК свідчать про те, що для них характерна в основному така ж закономірність у співвід- ношенні нуклеотидів, як і для ДНК (див. рис.19 і 20). При цьому необ- хідно мати на увазі, що молекула РНК відрізняється від молекули ДНК: замість тиміну в ДНК у РНК присутній урацил: дезоксирибоза замінена на рибозу; молекула РНК на відміну від ДНК складається (окрім незначної кількості винятків) із одного полінуклеотидного ла- нцюга; сума пуринових основ у РНК не відповідає сумі піримідинових; молекула РНК менша за молекулу ДНК; але кількість РНК у клітині більша, аніж ДНК; РНК представлена декількома різновидами моле- кул , які синтезуються на матриці ДНК.

Вторинна структура – це частково спіралізований одинарний по- лінуклеотидний ланцюг РНК (форма і ступінь спіралізації полінуклео- тидного ланцюга РНК у просторі). Полінуклеотидному ланцюгу РНК властива своєрідна спіралізація: ланцюг закручується сам на себе, утворюючи короткі двоспіральні «шпильки», «петлі», у яких між азо- тистими основами виникають водневі зв'язки, утворюючи комплеме- нтарні пари аденіну з урацилом (А-У), гуаніну з цитозином (Г-Ц) (див. рис. 23, 24). Характерною особливістю вторинної структури РНК є те, що полінуклеотидний ланцюг її спіралізований не повністю (для різ-

100