voronina

steros – просторовий, структурний) він називається тому, що є моле- кули, але не субстрати, які зв'язуються із цим центром (так звані мо- дулятори або алостеричні ефектори), за будовою (стерично) не схожі на субстрат, і, зв’язуючись з алостеричним центром, змінюють кон- формацію молекули ферменту, формуючи активний центр або роз'- єднуючи його. Відповідно алостеричні ефектори називаються пози- тивними (активатори) або негативними (інгібітори). Алостерични- ми ефекторами можуть бути гормони та їх похідні, різноманітні ме- таболіти (нормальні продукти обміну речовин), медіатори тощо. Молекула ферменту може мати декілька алостеричних центрів.

Будова і функції окремих коферментів і простетичних груп:

1.Небілкові частини нуклеотидного типу будови (див. розділи Омін речовин і енергії, Вітаміни).

2.Нуклеозидтрифосфати і нуклеозиддифосфатсахари (НДФС).

АТФ та інші нуклеозидтрифосфати (УТФ, ЦТФ, ГТФ) є коферме-

нтами фосфотрансфераз, які каталізують перенос фосфатного за- лишку від нуклеозидтрифосфатів на інші сполуки з активацією останніх. НДФС беруть участь як коферменти глікозилтрансфераз у реакціях переносу моносахаридних залишків під час біосинтезу оліго- і полісахаридів.

3.Вітамінні коферменти (див. Вітаміни).

4.Метали і металовмісні небілкові частини. За міцністю зв'язку металу з білками їх умовно розділяють на справжні металофермен- ти і ферменти, що активуються металами. Справжні металоферме- нти містять міцно зв'язаний метал, який не відокремлюється від бі- лка при очищенні і характеризуються специфічністю стосовно до металу. У ферментах, що активуються металами, метал неміцно зв'язаний із білком, легко відокремлюється від нього частково або повністю у процесі очищення; специфічність до металу, як правило, погано виражена. Найчастіше до складу ферментів входять Zn2+, Cu2+, Fe2+, Mo2+. Іони металів, які знаходяться в активних центрах

ферментів, можуть брати участь в акті каталізу, служити сполучним місточком між ферментом і субстратом, брати участь в утворенні фермент-субстратного комплексу. Якщо іон металу знаходиться по- за активним центром, то він підтримує третинну і четвертинну стру- ктуру ферменту. Іони металів у справжніх металоферментах зв'язані з певними групами білка (лігандами) координаційними зв'язками, утворюючи комплекси. Міцні комплекси з азотовмісними лігандами дають іони Сu2+, Со2+, Ni2+, Fе2+. Окрім атомів азоту іони перехідних металів добре зв'язуються і з сіркою (Zn2+, Сu2+, Fe2+ та ін.). Іони Са2+ і Mg2+ зв'язуються в білках із такими лігандами, як фосфатні і карбоксилатні іони. Передбачають наявність у білкових молекулах специфічних ділянок і для приєднання лужних металів К+ и Na+, хоча в клітині вони в основному присутні у вільному стані. Залізовмісни- ми ферментами є, в основному, так звані залізопорфірини, тобто бі- лки, в яких залізо міститься в складі гему. До таких ферментів нале- жать каталаза, пероксидаза, цитохроми та ін.

121

5. Пептидні коферменти. До них належить, наприклад, глутатіон – трипептид -глутамінілцистеїлгліцин. Глутатіон – це кофермент ряду оксидоредуктаз. Його функціональною групою є SН-група цистеїну, яка здатна до оборотних окислювально-відновних перетворень.

Механізм дії ферментів

Розкриття за допомогою рентгеноструктурного аналізу просто- рової будови ряду ферментів стало головним для побудови раціона- льних схем механізму їх дії. У одних випадках ці схеми обґрунтову- ються майже цілком у процесі аналізу структури фермент-субстрат- них комплексів у кристалі, в інших – використовуються результати досліджень з хімічної модифікації ферментів, кінетики реакцій, що каталізуються та інші дані. Встановлення механізму дії ферментів має ключове значення для розкриття структурно-функціональних зв'язків у безлічі біологічно активних систем.

На початку XX ст. спершу англійський хімік А.Браун, а потім французький учений В.Анрі висловили припущення, що дія фермен- тів ґрунтується на утворенні фермент-субстратного комплексу, який далі розпадається з утворенням продуктів реакції і вивільненням ви- хідного ферменту.

Велику роль у розвитку уявлень про механізм дії ферментів зі- грали класичні роботи Л.Міхаеліса і М.Ментена, які розвивали по- ложення про фермент-субстратні комплекси (1913 р.). Згідно з їх уявленнями, увесь процес ферментативного каталізу описується простим рівнянням (рис.31).

Рис.31. Схема стадій ферментативного каталізу (Е – фермент, S – суб- страт, Р – продукт)

У процесі ферментативного каталізу можна умовно виділити три стадії, кожна з яких має свої особливості.

Перша стадія – дифузія субстрату до ферменту і стеричне зв'язу-

вання його з активним центром ферменту з утворенням фермент- субстратного комплексу (ФСК). При цьому субстрат з'єднується з по- садочною ділянкою активного центру ферменту. Утворення ФСК стає можливим завдяки певній спорідненості ферментів зі своїми субстратами за типом «замок-ключ». Найчіткіше погляди щодо та- кої відповідності були висловлені Е.Фішером (1890 р.) під час пояс-

122

нення специфічності дії ферментів. Нині не викликає сумніву, що між просторовою структурою субстрату й активним центром існує стерична відповідність, але вона не є абсолютною. Американський учений Д.Кошленд висунув теорію індукованої відповідності ферме- нту і субстрату, згідно з якою в багатьох ферментів за умов відсутно- сті субстратів функціональні групи активних центрів орієнтовані та- ким чином, що їх оптимальної взаємодії із комплементарними гру- пами субстрату не відбувається. До взаємодії просторова структура субстрату й активного центру лише приблизно відповідають одна одній; сувора комплементарність виникає в процесі взаємодії унаслі- док змін конформації (індукована відповідність). Конформація мо- лекули ферменту й активного центру може змінюватися під впли- вом субстрату і коферменту. Доказом конформаційних змін ферме- нту під час зв'язування субстрату є відмінність рентгенограм вільно- го ферменту й у присутності специфічного інгібітора. На рис.32 схе- матично показано молекулу ферменту з її функціональними групами А, В і С. Приєднання субстрату до ферменту змінює структуру акти- вного центру, і його функціональні групи розміщуються так, що мо- же відбуватися реакція.

Рис.32. Зміна конформації активного центру ферменту під дією субстрату

Перша стадія протікає, як правило, недовго – це залежить від концентрації субстрату і швидкості його дифузії до активного центру ферменту. Утворення ФСК відбувається майже миттєво. Енергія ак- тивації цієї стадії змінюється незначно. Встановлено, що при утво- ренні ФСК молекули ферменту і субстрату не тільки наближаються, але і певним чином орієнтуються одні відносно інших (ефект збли- ження й орієнтації), займаючи оптимальне положення відносно ка- талітичної ділянки активного центру ферменту. В утворенні ФСК беруть участь іонні, водневі зв'язки і гідрофобні взаємодії. ФСК дуже лабільні, існують лише частки секунди, однак, незважаючи на це, на сьогодні вдалося отримати ряд ФСК. Так, у 1962 р. японські вчені

123

К.Ячі і Т.Озава одержали ФСК оксидази D-амінокислот і аланіну в кристалічному стані.

Друга стадія – перетворення первинного ФСК в один або декі- лька активованих фермент-субстратних комплексів, позначених у рі- внянні ESх і ЕSxx. Ця стадія конформаційних змін є найповільнішою і викликає більш різке зниження енергії активації. Тут відбуваються взаємодії субстрату з каталітичною ділянкою активного центру фе- рменту. У цьому разі розхитуються зв'язки в молекулі субстрату, спо- стерігається його дестабілізація і деформація у зв'язку з напружен- ням, вигином або натягом молекули – так званий ефект «диби». Конформаційні зміни сприяють розриву зв'язку або, навпаки, збли- женню молекул під час реакцій синтезу і цим роблять свій внесок у прискорення реакції. Чим більша довжина «розтягування» міжатом- ного зв'язку в субстраті, тим менша енергія його розриву, тобто знижується енергія активації. Місця деформації легше атакуються, наприклад, молекулами води.

Третя стадія – вихід продуктів реакції з активного центру в ото- чуюче середовище. Утворювані в процесі реакції продукти мають іншу стеричну конформацію, ніж субстрати, і легко залишають активний центр. Ця стадія є нетривалою і визначається швидкістю дифузії.

Важливою особливістю ферментативної реакції є й те, що пере- творення субстрату протікає як поліфункціональний каталіз. Полі- функціональність забезпечується різноманітністю амінокислотних радикалів білкової частини ферменту і груп кофакторів в активному центрі. На хімічний зв'язок субстрату впливають декілька груп фер- менту. У результаті цього відбувається поляризація перетворювано- го зв'язку, а потім його розрив. Багато груп в активних центрах фер- ментів функціонують як узагальнені кислоти (донори протонів) або основи (акцептори протонів). Особливо ефективним є узагальнений кислотно-основний каталіз. Він дає збільшення швидкості в 10–100 разів. До активного центру узагальнених кислотно-основних каталі- заторів входять бічні радикали таких амінокислот, як асп, глу, гіс, ліз, тир та ін. У протонованій формі вони є кислотними каталізаторами, непротонованій – основними. Узагальнений кислотно-основний ка- таліз є неможливим для звичайних каталізаторів. Для ферментатив- них реакцій велике значення має електрофільно-нуклеофільний ка- таліз. В активному центрі є електрофільні (акцептори електронної пари) і нуклеофільні групи (донори електронної пари), які беруть участь в акті каталізу. Нуклеофільні групи ферментів вступають у реакцію нуклеофільного заміщення, що призводить до утворення ковалентних нестійких проміжних сполук. Нуклеофільна група стає на місце замінюваної групи, утворюючи ковалентний інтермедіат. Він нестійкий і легко розпадається на продукти реакції.

Сильним нуклеофілом є імідазольна група гістидину, тому модифікація гіс у складі активного центру призводить до інакти- вації ферментів. До нуклеофілів належать також гідроксигрупа сер, SН-група цис. Прикладами електрофільних груп є іони мета- лів – Fe3+, Zn2+ та ін.

124

Ковалентний каталіз спостерігається у ферментів, які утворю- ють ковалентні зв'язки між каталітичними групами активного центру і субстратом. Ці проміжні комплекси дуже нестійкі і легко розпадаються, звільнюючи продукти реакції.

Одним із прикладів ферментативного каталізу може служити реакція гідролізу ацетилхоліну (АХ) у разі дії на нього ферменту ацетилхолінестерази (АХЕ).

Активний центр АХЕ утворюється в процесі формування третинної структури ферменту шляхом унікального згину поліпе- птидного ланцюга в просторі. Він містить у зближеному стані за- лишки радикалів амінокислот (в основному, серину, гістидину, тирозину і глутамінової кислоти), які забезпечують безпосередню взаємодію з молекулою субстрату (посадочна ділянка), і пряму участь в акті каталізу (каталітична ділянка). Субстратом АХЕ є ацетилхолін, який виконує важливу роль у передачі нервового ім- пульсу з нейрона на нейрон або робочий орган (м'язове волокно), тобто АХЕ є нейромедіатором.

Відомо, що нервовим волокном передається збудження (різ- ниця потенціалів). Нервове волокно складається з нервових клі- тин, які контактують між собою в зоні синапсу. Електричний ім- пульс передається з однієї клітини на іншу за допомогою хімічних посередників, що отримали назву медіаторів. Коли перший ім- пульс досягає пресинаптичної мембрани, у ній зі спеціальних бу- льбашок (везикул) виділяється ацетилхолін, який надходить до синаптичної щілини. Ацетилхолін діє на постсинаптичну мембра- ну, де розташовані холінорецептори, з якими взаємодіє утворений ацетилхолін, що викликає в ній новий нервовий імпульс, який по- ширюється далі:

Тут використані такі позначки: 1 – пресинаптична мембрана; 2 – постсинаптична мембрана; 3 – синаптична щілина; 4 – везикули з ацетилхоліном.

Аналогічно відбувається процес на стику нервових клітин із м'я- зовою тканиною.

Надлишок ацетилхоліну, що не прореагував з ацетилхоліно- вими рецепторами, розщеплюється ферментом АХЕ, і передача нервового імпульсу припиняється. Синапс повертається до почат- кового стану і знову здатний до сприйняття наступного імпульсу. Якщо цей процес не відбудеться, ацетилхолін буде накопичувати- ся, що може призвести до надлишкового збуждення нервової сис- теми і загибелі організму.

Ацетилхолін – це складний ефір оцтової кислоти і холіну, який утворюється з амінокислоти серину.

125

Механізм дії АХЕ. Перша стадія: утворення фермент-субстрат- ного комплексу між АХЕ й ацетилхоліном за рахунок електростати- чної взаємодії між негативно зарядженою іонізованою карбоксиль- ною групою радикала глутамінової кислоти та позитивно зарядже- ним атомом азоту молекули ацетилхоліну (рис. 33, 34).

Рис.33. Активний центр АХЕ

126

Рис.34. Фермент-субстратний комплекс

Друга стадія: хімічні взаємодії між радикалами амінокислот ак- тивного центру АХЕ й ацетилхоліном:

1.У першу чергу замикається зв'язок між вуглецем поляризова- ної карбонільної групи ацетильного радикала ацетилхоліну і киснем гідроксильної групи залишку серину (див. пункт 1, рис. 35).

2.Потім виникає водневий зв'язок між ефірним киснем ацетилхо- ліну і гідроксильною групою радикала тирозину (див. пункт 2, рис.35).

Рис.35. Основні хімічні реакції між залишками амінокислот в активному центрі і субстратом

127

3. Молекула ацетилхоліну і радикали серину та тирозину в акти- вному центрі ферменту розташовані таким чином, що утворення згаданих зв'язків послаблює (розтягує) зв'язок між карбонільною групою й ефірним атомом кисню в молекулі ацетилхоліну (ефект «диби»). Унаслідок для його розриву необхідно набагато менше ене- ргії, тобто енергетичний бар'єр знижується внаслідок активації мо-

лекули ацетилхоліну (ES1-комплекс).

4. Далі під впливом радикала гістидину, який відтягує на себе протон від гідроксильної групи серину (див. пункт 3, рис.35) зміцню- ється складноефірний зв'язок між радикалом серину та ацетильною групою ацетилхоліну (див. пункт 1, рис.35) з одночасним розривом складноефірного зв'язку в молекулі ацетилхоліну (див. пункт 4, рис. 35) і переходом протона від радикала тирозину до залишку холіну.

Третя стадія: вивільнення продуктів реакції з активного центру АХЕ. У результаті зазначених вище взаємодій холін вивільнюється з ак- тивного центру, а його місце займає молекула води, яка утворює зв'язок із карбонільним киснем ацетильної групи і киснем тирозину, після чого протон від залишку гістидину повертається до кисню гідроксильної групи серину, протон води– до радикала тирозину. Одночасно виділя- ється другий продукт реакції– оцтова кислота і відновлюється вільний активнийцентрАХЕ, здатний до нового акту каталізу(рис. 36).

Рис.36. Роз'єднання молекули ацетилхоліну: I – залишок оцтової кислоти; ІІ – залишок холіну

Отже, у процесі утворення фермент-субстратного комплексу і на наступних фазах ферментативного каталізу відбуваються неодноразо- ві зміни третинної структури ферменту, що призводить до послідов- ного зближення із субстратом і орієнтації в просторі тих активних груп, котрі взаємодіють між собою на різних етапах перетворення субстрату. Зміни третинної структури білка-ферменту неможливі без участі всього або майже всього поліпептидного ланцюга, який утво- рює білкову молекулу. Отже, у каталітичному акті бере участь власне

128

вся молекула ферменту. Розгляд тонкого механізму ферментативного каталізу надає можливість зрозуміти специфіку дії ферменту.

Унікальна структура і взаємодія активного й алостеричного центрів ферменту забезпечують кооперативне здійснення багатостадійних про- цесів. Саме впорядкованість реакцій у просторі і часі, їхній кооператив- ний характер відрізняють дію біокаталізаторів, забезпечуючи високу спе- цифічністьіучастьурегуляторнихпроцесахжиттєдіяльності.

Кінетика ферментативних реакцій

Визначенням швидкостей ферментативних реакцій і досліджен- ням впливу на них різних факторів займається ферментативна кіне- тика. Кінетичні дослідження широко використовуються для визна- чення спорідненості субстратів та інгібіторів з ферментами, для встановлення механізму їхньої дії.

До числа головних факторів, які впливають на швидкість фермен- тативних реакцій, належать: концентрація ферменту, концентрація суб- страту, присутність активаторів абоінгібіторів, рН, температура.

Вплив концентрації ферменту і субстрату на початкову швидкість реакції

У переважній більшості випадків швидкість ферментативної ре- акції прямо пропорційна концентрації ферменту – [Е] і носить ліній- ний характер: V = K [Е] (рис. 37,a).

Рис.37. Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрацій фе- рменту (а) і субстрату (б)

Одним із найважливіших факторів, що визначають швидкість ферментативної реакції, є концентрація cубcтpaту [S]. Майже в усіх

129

випадках графік залежності початкової швидкості реакції від конце- нтрації субстрату має вигляд гіперболи (рис.37,б). За дуже низьких концентрацій субстрату швидкість реакції є дуже малою, але посту- пово зростає в міру підвищення концентрації субстрату. Якщо ми будемо вимірювати початкову швидкість каталітичної реакції при різних підвищеннях концентрації субстрату, то виявимо, що швид- кість з кожним разом зростає все повільніше. Нарешті, надійде мо- мент, коли будь-яке збільшення концентрації субстрату викликатиме нескінченно мале прискорення реакції. І як би не збільшувалась кон- центрація субстрату, швидкість реакції може лише наближатися до плато, проте ніколи його не досягне. Під час дослідження залежності швидкості реакції від концентрації субстрату [S] у багатьох випадках спостерігається така характерна картина (рис.37, б).

При відносно невеликому значенні [S] величина V пропорційна [S], а в разі досягнення достатньо великих значень [S] величина V наближається до певного сталого значення, що називається макси- мальною швидкістю (Vмакс).

На основі аналізу залежності V від [S] Л.Міхаеліс і М.Ментен сформулювали в 1913 р. загальну теорію кінетики дії ферментів. Вони постулювали, зокрема, що ферментативна реакція є двостадійною. На першій стадії фермент вступає до швидкої оборотної взаємодії з суб- стратом з утворенням фермент-субстратного комплексу (ФСК; ES):

E + S ES

На другій стадії ES розпадається з утворенням продукту реакції Р:

ES K E + P

→

Друга стадія повільніша, вона лімітує швидкість процесу; остан- ня визначається концентрацією ES і константою швидкості його розпаду К. Це стало обґрунтуванням для рівняння, яке зв'язує V і [S], відомого під назвою рівняння Міхаеліса:

V= V макс [S] , де

Км + [S]

V – початкова швидкість реакції, тобто швидкість, яка реєструється де- який час, протягом якого рівень субстрату не перевищує ~10%. У цей період швидкість реакції можна вважати приблизно сталою, оскільки, по-перше, витрата субстрату є невеликою, а по-друге, концентрація продукту, який у ряді випадківможевиявлятигальмівнудію, незначна.

У рівняння входять дві сталі величини: Vмакс – максимальна швид- кість, тобто швидкість реакції в умовах насичення ферменту субстра- том, і Км – константа Міхаеліса для досліджуваної пари фермент-суб- страт. Легкопоказати, щоодносубстратна реакція протікає за схемою:

130