voronina

К+1 – константа швидкості утворення ES,

К-1 – константа швидкості оборотного розпаду ES на E та S, К+2 – константа швидкості розпаду ES з утворенням продукту Р.

Рівняння Міхаеліса є справедливим і без припущення того, що на стадії утворення ES установлюється рівновага, і що стадія розпа- ду ES з утворенням продукту Р є лімітуючою. У цьому разі Км може бути виражена через константи швидкостей окремих стадій:

Kм = К−1 + К+2 К+1

Величини Vмакс і Км можна визначити за графіком залежності V від [S] (див. рис.37,б); Vмакс знаходять за графіком як межу, до якої прямує V при збільшенні [S]. Із рівняння Міхаеліса випливає, що при достатньо високій концентрації субстрату (коли [S] >> Км)

V = Vмакс ,

тобто швидкість є сталою і максимальною, реакція протікає за кіне- тичним законом нульового порядку. Реакціями нульового порядку називають такі реакції, у яких кількість субстрату, що перетворюєть- ся за одиницю часу, залишається постійною незалежно від його кон- центрації. За низьких концентрацій субстрату V прямо пропорційна [S]; дійсно, при [S] << Км за рівнянням Міхаеліса виявляється, що

V = Vмакс [S]

Км

У таких умовах реакція протікає за кінетичним законом першого порядку. Реакції першого порядку – це такі реакції, у яких кількість субстрату, яка перетворюється за одиницю часу, пропорційна кілько- сті субстрату, що є на даний момент.

На графіку (рис. 37, б) це відповідає початковій лінійній ділянці. Для визначення величини Км знову необхідно звернутися до рівняння Міхаеліса; з нього випливає, що Км чисельно дорівнює концентрації субстрату, за якої швидкість реакції дорівнює половині максималь- ної. Дійсно, за умови, що

V = Vмакс

2

маємо:

Vмакс.	=	Vмакс [S]		та Км = [S]
2		Км + [S]

Дляграфічного визначенняКм спочатку необхідно знайти величину

V = Vмакс ,

2

131

а потім через відповідну точку на ординаті провести пряму, парале- льну осі абсцис до перетину з графіком; перпендикуляр, опущений з точки перетину на вісь абсцис, покаже величину [S], чисельно рівну

Км (рис.37,б).

Зручніше для розподілення величин Vмакс і Км використовувати графіки перетворених форм рівняння Міхаеліса. Прирівнюючи зво- ротні вирази правої і лівої частин рівняння Міхаеліса-Ментен, Г.Лайнуївер і Д.Берк одержали таку залежність:

	1	=	1	+	КМ		1		,
	V		Vмакс		Vмакс		[S]

який називають рівнянням Лайнуївера-Берка. Графік залежності –

1		від	1		(рис.38) – це пряма, яка має нахил Км/Vмакс, і відсікає на осі
	V		[S]
ординат відрізок, рівний						1	, а на осі абсцис відрізок, рівний	1	.
						Vмакс
								Kм

Pиc.38. Графік Лайнуївера-Берка

Більшість ферментів каталізують реакції за участю двох (або бі- льше) субстратів:

E

A + B C + D

Дослідження кінетики таких реакцій надає змогу визначити вели- чини Км і Vмакс для кожного із субстратів; для цього будують графіки залежності швидкості реакції від концентрації одного із субстратів у разі фіксованої (зазвичай такої, що насичує) концентрації іншого.

Залежність швидкості ферментативної реакції від температури. Згі-

дно з законом Я.Вант-Гофа, швидкість хімічних реакцій збільшується приблизно вдвічі у разі підвищення температури на кожні 10 С. Ця за-

кономірність є справедливою і для ферментів, однак тільки в обмеже-

132

ній зоні значень температур, в основному, в інтервалі від 0 до 50 С. За температури, яка не перевищує 35–50 С, швидкість більшості фермен-

тативних реакцій збільшується згідно з теорією хімічної кінетики. Це так званий температурний оптимум, у межах якого ферменти прояв- ляють найвищу активність. Підвищення температури вище за оптимум призводить дозниженняактивності ферменту і швидкості реакції, а при 80 С і вище фермент припиняє свою дію– він інактивується. Це пов'я-

зано з денатурацією ферментного білка. Водночас змінюється його вторинна і третинна структура, і структура активного центру змінюєть- сянастільки, щофермент неможе взаємодіяти із субстратом:

Однак знайдено ферменти (у мікроорганізмів гарячих джерел), які пристосувалися до навколишнього середовища і зберігають свою активність і за 70–90 °С.

Визначення активності ферментів рекомендують проводити при 25 С.

Певний інтерес викликають дані про вплив на швидкість ферме- нтативної реакції низьких температур. Зниження температури нижче оптимальної тимчасово уповільнює активність ферменту у результаті зменшення дифузії молекул. Якщо ж температуру знову підвищити до оптимальних величин, активність ферменту і швидкість реакції відно- влюються. Цю здатність ферментів широко використовують у народ- ному господарстві, наприклад, для збереження харчових продуктів, у медицині, зокрема у хірургічній практиці, у фармації – для збереження препаратів та лікарських форм, що швидко псуються (наприклад, біл- кових препаратів, відварів, настоїв, емульсій та ін.).

Графічна залежність швидкості більшості ферментативних реа- кцій від температури має дзвоникоподібну форму (pиc. 39).

Таким чином, термолабільність або чутливість до підвищення температури є однією із характерних властивостей ферментів, яка відрізняє їх від небіологічних каталізаторів. Варто відзначити, що на термолабільність ферментів певним чином впливають концентрація субстрату, рН середовища та інші фактори.

Залежність швидкості ферментативної реакції від рН середови-

ща. Ферменти є досить чутливими до змін рН середовища, в якому вони діють. Кожний фермент виявляє свою оптимальну активність лише за певного pН середовища, наприклад, пепсин – 1,5–2,0, аміла- за слини – 6,8–7,4, трипсин – 7,5–8,5, аргіназа – 9,5–10,0, тобто фер- мент має свій оптимум pН, за якого він є найактивнішим.

133

Рис.39. Вплив температури на швидкість реакції, яка каталізується ферме- нтом: а – підвищення швидкості реакції як функція температури;

б – зниження швидкості реакції як функція денатурації білка-ферменту; стрілка вказує на оптимум температури

Відхилення pН від оптимальних величин викликає зниження ак- тивності ферменту, тому що призводить до зміни ступеня іонізації іо- ногенних груп в активному центрі, а це впливає на спорідненість суб- страту із посадочною ділянкою активного центру ферменту і на ката- літичний механізм перетворення. Окрім того, зміна іонізації білка (не тільки в зоні активного центру) викликає конформаційні зміни моле- кули ферменту. Дзвоникоподібна форма кривої (рис.40) означає, що існує певний оптимальний стан іонізації ферменту, який забезпечує найліпше сполучення із субстратом і його каталіз. Оптимум рН для більшості ферментів лежить у межах вузької зони концентрації водне- вих іонів, які відповідають фізіологічним значенням рН середовища, – 6,0–8,0. У дуже кислому і лужному середовищах їхня активність не вияв- ляється через денатурацію білка-ферменту. Однак, є і винятки: напри- клад, пепсин єнайбільш активнимпри рН1,5–2,0, аргіназа9,5–10,0.

Рис. 40. Вплив pН на швидкість реакції, яка каталізується ферментом (стрілка вказує оптимум pН)

Відхилення рН у будь-який бік від оптимального значення при- зводить до зниження активності ферменту.

У багатьох випадках до іонізації здатні і певні групи субстрату, що також відбивається на оптимальному рН для дії ферментів. На-

134

приклад, пепсин діє на катіонну форму харчового білка, що утворю- ється сильнокислим середовищем у шлунку. Окрім того, pН може непрямо впливати на активність ферменту, дестабілізуючи його структуру, порушуючи міцність зв'язку апоферменту з кофактором. Зміна рН може також впливати на стан активаторів та інгібіторів ферментів (див.нижче). Значення рН, відповідне оптимальному, не завжди збігається зі значенням pН, характерним для внутрішньоклі- тинного середовища. Тому рН може бути одним із факторів, відпо- відальних за регулювання ферментативної активності у клітинах.

Під час визначення активності ферменту створюється оптима- льне значення рН середовища.

Специфічність дії ферментів

Ферменти мають високу специфічність дії. Ця властивість сут- тєво відрізняє їх від небіологічних каталізаторів. Фермент може ка- талізувати одну або декілька близьких за природою хімічних реакцій. Така специфічність ґрунтується на суворій відповідності стеричної структури субстрату та активного центру ферменту. Структура акти- вного центру ферменту відповідає структурі його субстрату, внаслі- док чого даний фермент із багатьох речовин, що знаходяться у клі- тині, приєднує тільки свій субстрат.

Кожний фермент каталізує не будь-яке з усіх можливих хімічних перетворень субстрату, а яке-небудь одне. Завдяки специфічності дії ферменти забезпечують протікання з величезною швидкістю лише певних реакцій із усього різноманіття можливих перетворень у мік- ропросторі клітин цілісного організму, тим самим беручи участь у ре- гуляції інтенсивності і спрямованості обміну речовин.

За ознакою специфічності ферменти можна розділити на дві групи: з абсолютною специфічністю і з відносною специфічністю.

Ферменти, які каталізують перетворення тільки одного субстрату з певною структурою, володіють абсолютною специфічністю. Будь-які модифікації (зміни) у структурі субстрату роблять його недоступним для дії ферменту. Прикладом може бути уреаза, яка розщеплює ли- ше сечовину, але не діє на модифікаційну форму – тіосечовину. Саха- раза гідролізує лише сахарозу, а на інші дисахариди не діє.

До абсолютної специфічності належить також і стереохімічна, яку мають ферменти, здатні діяти тільки на певні стереоізомери, наприклад, D- або L-форми, цис- або транс-ізомери тощо, тобто фе- рмент, який розщеплює або синтезує L-ізомер, діяти на D-ізомер не буде. Якщо сполука існує у формі цис- і транс-ізомерів, то тільки один із цих ізомерів може служити субстратом для дії ферменту. Наприклад, фумараза каталізує перетворення фумарової кислоти (транс-ізомер), але не діє на малеїнову кислоту (цис-ізомер):

135

Фермент лактатдегідрогеназа, наприклад, не тільки специфічно ка- талізує окислення молочної кислоти, але навіть розпізнає оптичні ізоме- риданоїсполуки. ВонакаталізуєокисленнялишеL-молочноїкислоти.

Стереоспецифічність виявляють ферменти, які каталізують і синтетичні реакції. Так, з аміаку і -кетоглутарової кислоти в живих організмах синтезується L-ізомер глутамінової кислоти, який вхо- дить до складу природних білків.

Поряд із ферментами, котрим властива абсолютна специфіч- ність дії, є велика група ферментів, з відносною (груповою) специфіч- ністю – вони діють на декілька (групу) речовин, які мають один і той самий певний тип зв'язку. До таких ферментів, зокрема, нале- жать естерази, які каталізують гідроліз складних ефірів.

Для естераз важливою є наявність складноефірного зв'язку, їх не лімітує природа груп R і R1. Існують ферменти, які діють більш вибір- ково, хоча і гідролізують один і той самий зв'язок. Так, протеїнази (пеп- син, трипсин, хімотрипсин) розщеплюють білки за кислотно-амідним (пептидним) зв'язком, алеутвореним різними залишкамиамінокислот.

Одиниці активності ферментів

Активність ферментів, як правило, виражають у міжнародних оди- ницях активності. Активність, що дорівнює одній міжнародній одиниці, має така кількість ферменту, яка каталізує перетворення 1 мікромоля субстрату в продукт за 1 хв у стандартних (оптимальних) умовах у роз- рахунку на 1 г тканини. Питома активність – це число одиниць фермен- тативної активності на 1 мг білка. Питома активність відображає сту- піньочисткиферменту, вона ємаксимальноюучистогоферменту.

Міжнародний біохімічний союз запропонував використовувати як одиницю активності «катал» (кат). Активність в 1 кат має така кі- лькість ферменту, яка каталізує перетворення 1 моля субстрату в продукт за 1 с. Отже, 1 кат = 60 · 106 = 6 · 107 міжнародних одиниць. Рекомендовано використовувати також одиницю значно меншого масштабу – нанокатал (нкат), яка дорівнює 10-9 кат.

Методи кількісного визначення активності ферментів

Про наявність ферменту в розчині ролять висновок за його дією на субстрат. Активність ферменту вимірюється непрямо: або визна- ченням кількості продукту, що з'явився під дією ферменту, або кіль- кістю субстрату, який зникає за одиницю часу в оптимальних умовах ферментативної реакції.

136

Як приклад можна розглянути принцип методу визначення ак- тивності -амілази. Амілаза каталізує гідролітичне розщеплення

крохмалю з утворенням у результаті мальтози. Активність амілази розраховують на основі кількості негідролізованого крохмалю або кількості утвореної мальтози. У клінічних лабораторіях частіше ви- користовують перший спосіб, визначаючи кількість крохмалю за ре- акцією з йодом, а у фармацевтичному аналізі –інший спосіб, визна- чаючи кількість утворюваної мальтози.

Для визначення активності ферментів застосовують такі основні методи: спектрофотометричні, манометричні, а також потенціометрію, хроматографію, електрофорезтаіншіфізичнііфізико-хімічніметоди.

Регуляція активності феpментів

Для живих організмів властива унікальна збалансованість ката- болічних і анаболічних процесів. При цьому в клітинах одночасно здійснюються процеси синтезу, розпаду і взаємоперетворення со- тень і тисяч різноманітних речовин, які регулюються численними регуляторними механізмами, що забезпечують постійність внутріш- нього середовища організму (гомеостаз).

Швидкості хімічних реакцій метаболізму змінюються (регулю- ються) у залежності від умов середовища і фізіологічного стану. Як уже зазначалося, ферменти, на відміну від інших каталізаторів, на- лежать до каталізаторів із регульованою активністю. За допомогою ферментів можна контролювати швидкість хімічних реакцій, які протікають в організмі. Звідси, їм належить найважливіша роль у про- цесі регуляції метаболізму. Існує декілька способів такої регуляції. Регуляція активності ферментів може здійснюватися шляхом взає- модії з ними різноманітних біологічних компонентів або сторонніх сполук (наприклад, лікарських засобів, отрут та ін.), які прийнято на- зивати модифікаторами або регуляторами ферментів. Під час дії модифікаторів на фермент хімічні реакції можуть прискорюватися, тоді модифікатори називаються активаторами, або уповільнювати- ся – у цьому разі їх називають інгібіторами.

Існує ряд інших механізмів, які контролюють швидкість метабо- лічних процесів і активність внутрішньоклітинних ферментів. Абсо- лютна кількість присутнього в клітині ферменту регулюється швид- кістю його синтезу і розпаду. До регулюючих механізмів може бути віднесено і явище так званої компартменталізації – просторове роз'- єднання за допомогою мембран ферментів зі своїми субстратами, що дозволяє протікати процесам із протилежною спрямованістю. Ці процеси, наприклад, синтез і розпад, просторово розділені і проті- кають у різних частинах клітини, у різних субклітинних утвореннях. Так, синтез жирних кислот протікає здебільшого в цитоплазмі, а шляхи розпаду їх зосереджені в мітохондріях.

Активування ферментів. Речовини, які підвищують активність ферментів, одержали назву активаторів. Присутність активатора вкрай важлива для ферменту. До активаторів належать кофактори, іони металів, різноманітні модифікатори тощо. Субстрат у певних

137

межах концентрацій є активатором – після досягнення насичених концентрацій субстрату активність ферменту не зростає. Субстрат полегшує формування потрібної конформації активного центру фе- рменту (індукція), підвищує його стабільність.

Досить часто роль активаторів виконують іони металів: вони можуть входити до складу каталітичної ділянки активного центру ферменту; сприяти зв'язуванню субстрату з посадочною ділянкою ферменту (зв'язуючий місток); іноді метали можуть сполучатися не з ферментом, а із субстратом, утворюючи металосубстратний ком- плекс, нa який краще діє фермент; вони можуть діяти непрямим шляхом, зв’язуючи присутній інгібітор тощо.

Активація деяких ферментів може здійснюватися шляхом при- єднання до алостеричного центру ферменту якої-небудь специфічної модифікуючої групи, що сприяє змінюванню конформації ферменту і його активного центру.

Прикладами можуть бути іони хлору, які є активаторами аміла- зи слини; іони водню, які підвищують активність пепсину; жовчні ки- слоти, які посилюють дію ліпази підшлункової залози; лужна фосфа- таза може активуватися катіонами Мg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+.

Активація деяких ферментів (особливо тих, що виробляються в шлунково-кишковому тракті) може відбуватися протеолітичним шляхом. Спочатку ферменти виробляються в неактивній формі у ви- гляді проферментів або зимогенів (попередників ферментів), у яких активний центр замаскований додатковою ділянкою пептидного ла- нцюга. Внаслідок цього субстрат не може з'єднатися з активним центром. Видалення такої додаткової ділянки може відбуватися різ- ними шляхами і сприяє звільненню активного центру та можливості утворення фермент-субстратного комплексу. Наприклад, профер- ментом пепсину є пепсиноген, який виробляється в стінках шлунка. Відщеплення від його молекули невеликого пептидного ланцюга за участю соляної кислоти в шлунку призводить до утворення пепсину і формування його активного центру. Профермент трипсиноген утворюється в підшлунковій залозі, до складу його поліпептидного ланцюга входить 229 амінокислотних залишків. У дванадцятипалій кишці під впливом ферменту ентерокінази розривається пептидний зв'язок між 6 і 7 амінокислотними залишками і відщеплюється гек- сапептид. Після відщеплення гексапептиду створюються умови, які сприяють утворенню активного центру ферменту, і трипсиноген пе- ретворюється в трипсин.

Цей же процес може здійснюватися аутокаталітично, тобто під впливом уже утворених трипсину і пепсину – у випадку пепсиногену.

Синтез ферментів-протеїназ у неактивній формі має певний біологічний сенс, попереджаючи руйнування (самоперетравлюван- ня) клітин органів, у яких утворюються проферменти.

Гальмування ферментів. Дія багатьох ферментів може бути за- гальмована, а в ряді випадків і повністю припинена під час дії певних хімічних речовин – інгібіторів. Інгібітори з тієї чи іншої причини час- тково або повністю перешкоджають утворенню продуктивного фе-

138

рмент-субстратного комплексу. Зокрема, токсичність багатьох отрут для живих організмів, лікувальні ефекти ряду лікарських засобів зу- мовлені їх інгібіторною дією на ферменти. Серед інгібіторів є як си- нтетичні речовини, так і природні метаболіти. Для інгібіторів харак- терна специфічність дії. Необоротну (і неспецифічну) денатурацію ферментів під впливом підвищеної температури, сильних кислот або будь-яких інших факторів зазвичай не розглядають як гальмування. Тому в разі дії денатуруючих факторів правильно говорити не про гальмування, а про інактивування.

За допомогою інгібіторів отримують цінну інформацію про спе- цифічність дії ферментів, природу функціональних груп їх активних центрів, про механізм дії і т.ін.

Процес гальмування ферментів може бути оборотним і необо- ротним. Якщо молекула інгібітора викликає стійкі зміни або моди- фікацію функціональних груп ферменту, то такий тип гальмування називається необоротним. Найчастіше, однак, має місце оборотне гальмування, яке піддається кількісному вивченню на основі рівнян- ня Міхаеліса-Ментен. Необоротне гальмування має місце в тому ви- падку, коли утворений комплекс фермент–інгібітор практично не дисоціює. Необоротні інгібітори хімічно модифікують важливі для активності функціональні групи ферменту. Звідси, після видалення вільного інгібітору шляхом діалізу, активність модифікованого фер- менту не відновлюється. У ряді випадків його активність можна від- новити, видаливши приєднаний необоротний інгібітор шляхом про- ведення відповідної хімічної реакції. Цей процес прийнято називати реактивацією. Прикладом необоротних інгібіторів є диізопропілф- торфосфат (ДІФФ), який інактивує ряд гідролаз (трипсин, хімотрип- син, ацетилхолінестераза та ін.), модифікуючи важливий для актив- ності цих ферментів залишок серину:

139

До інгібіторів синтетичного походження окрім ДІФФ належать, наприклад, фторид натрію, який гальмує фосфатази, фенапролін – металовмісні ферменти, n-хлормеркурібензоат – ферменти, що міс- тять сульфгідрильні (-SН) групи. Дія таких інгібіторів, як правило, є необоротною.

Оборотні інгібітори взаємодіють із ферментом без утворення ковалентних зв'язків. Після інкубації з утворенням комплексу фер- мент–інгібітор, активність ферменту відновлюється під час вида- лення вільного інгібітора шляхом діалізу. Прикладами оборотних ін- гібіторів є клітинні метаболіти та їх структурні аналоги, які знижу- ють активність ферментів.

За механізмом дії інгібітори ферментів розподіляються на ос- новні типи: конкурентні, неконкурентні, безконкурентні, субстратні або метаболітні, алостеричні.

Конкурентне гальмування. Конкурентні інгібітори за будовою по-

дібні до субстрату, вони конкурують із ним за зв'язування з активним центром ферменту. Характерною рисою конкурентного гальмування є те, що ефективність інгібітора залежить від співвідношення концен- трацій субстрату й інгібітора. Гальмування відбудеться тоді, коли концентрація інгібітора перевищить концентрацію субстрату. У цьому випадку інгібітор утворює з ферментом інгібітор-ферментний ком- плекс і виключає фермент із реакції. Але якщо концентрація субстрату буде вищою за концентрацію інгібітора, утворюється фермент- субстратний комплекс і дія інгібітора припиняється.

Прикладом конкурентного гальмування є дія малонової та де- яких інших дикарбонових кислот на фермент сукцинатдегідрогеназу (СДГ), яка каталізує в організмі перетворення янтарної кислоти (су- кцинату) у фумарову (фумарат).

Малонова кислота є інгібітором даної реакції; у структурному відношенні вона подібна до янтарної кислоти і може конкурувати з останньою за місце в активному центрі ферменту СДГ (рис.41). У цьому випадку СДГ ніби «обманута»: вона замість субстрату янтар- ної кислоти захоплює його «двійника» (малонову кислоту) і субстрат уже не може розташуватися на контактній ділянці ферменту. Якщо ж навколо ферменту з'явиться багато молекул субстрату (янтарної ки- слоти), то субстрат ніби витисне інгібітор з активного центру. Оскі- льки в комплексі фермент – інгібітор через специфічність дії ферме- нту хімічної реакції не відбувається, активність СДГ виявляється тільки відносно свого субстрату. Навпаки, якщо кількість молекул інгібітора є значною, то субстрату важче проникнути на контактну

140