Промислове виробництво гентаміцина сульфату

Гентаміцина сульфат – це антибіотик, що відноситься до групи аміноглікозидів, пригнічує розвиток грам негативних та грам позитивних бактерій, не діє на гриби. Ефективний для лікування інфекцій сечостатевої системи, респіраторних та шлунково-кишкових захворювань.

Продуцентом гентаміцину є Micromonospora purpurea . Штам ВНІІ-7 R , що спочатку вирощується лабораторних умовах на агаризованому середовище Гаузе-1. Підготовка посівного матеріалу дуже відповідальна операція усхемі отримання гентаміцину.

При отриманні вегетативного матеріалу другої генерації використовують вегетативний посівний матеріал першої генерації за умов дотримання певним вимогам:

Ø біомаса середньої густини від молочного до рожевого кольору, під час збовтування не розшаровується та не осаджується;

Ø під час мікроскопування зафарбованого препарату спостерігаються мікроколонії, гіфи довгі, хвилясті, протоплазма базофільна

Ø відсутність сторонньої мікрофлори.

Вирощування вегетативного матеріалу другої генерації проходить у посівному біореакторі для глибинного культивування, з обов’язковим перемішуванням, барботером для подання повітря, сорочкою.

Процес біосинтезу гентаміцину у апаратах БІОР-0,25 відбувається методом періодичного глибинного культивування. Посівний матеріал вносять в середовище ферментації не більше 10% від загального об’єму. Процес культивування триває 6-7 діб.

Попередня обробка та ультрафільтрація культуральної рідини наступний етап отримання гентаміцину сульфату. Культуральну рідину з біореактора завантажують у спеціальну ємкість де перемішують з додаванням розчинів щавлевої кислоти та цетилперидиній броміда для коагуляції білків та видалення полівалентних металів.

Процес ультрафільтрації дозволяє концентрувати високомолекулярні сполуки з одночасним очищенням антибіотиків від низькомолекулярних домішок.

Процес виділення та хімічного очищення гентаміцину на катіоніті КБ-2 включає:

Ø сорбцію гентаміцину з нативного розчину;

Ø вимивання мінорних компонентів;

Ø десорбція гентаміцину.

Отримання концентрату гентаміцина та перевод його у форму сульфату проводять за допомогою 20% сірчаної кислоти, яку додають до рН 6-6,5 з наступним введенням активованого вугілля з нагріванням до 45^оС (перемішують 30 хв) після чого вугілля фільтрують.

Висушування концентрату гентаміцину сульфату проводять у лабораторній сушці у асептичних умовах. Температура висушування становить 175-103^оС. Фасування порошку проводиться у стерильних умовах ламінарного боксу.

повернутися до змісту

Технологія отримання препаратів тетрацикліну

Тетрациклінові антибіотики це амфотерні сполуки, що здатні утворювати солі з кислотами та основами, погано розчинні у водних розчинах в інтервалі рН 4,5-7,5, добре розчинні при рН 2,0 та 8,0. Нестійкі до дії окислювачів та кисню.

Як промислові продуценти хлор тетрацикліну використовують штами гриба Actinomyces aurefasiens , Actinomyces rimosus .

Технології отримання кормових препаратів 7-хлортетрацикліну та 8-окситетрацикліну схожі. Для біосинтезу окситетрацикліну посівний матеріал використовується у вигляді спор зі строком збереження при температурі 4-6^оС до 3 міс. В умовах біофабрик його розмножують при температурі 26-28^оС у три генерації

Тривалість кожної з них складає 2-3 доби. Культуру продуцента спочатку двічі розмножують у колбах на 750 мл з 200 мл середовища на гойдалці. Потім переносять у посівний апарат. Міцеліальною масою, отриманною у колбах, засівають посівні апарати з розрахунку 700 мл на 1 м³ рідкої фази з аерацією (один об’єм повітря на один об’єм середовища за хвилину).

Склад середовища для вирощування продуцента є примітивним та складається з відходів інших виробництв:

Ø Кукурудзяне борошно -6%

Ø Кукурудзяний екстракт – 1,5%

Ø Амонію сульфат -0,6%

Ø Натрія хлорид -0,4%

Ø Крейда -0,8%

Ø Вода до 100%

На стадії основної ферментації використовують поживне середовище того ж складу, лише для підвищення виходу вітаміну В12 додають хлорид кобальту (1 г на 1 м³ середовища).

Отриманний посівний матеріал передають на стадію основної ферментації у кількості 10-15% від об’єму середовища основних ферментерів. Технологічні параметри проведення процесу виробничої ферментації залишаються практично такими же, що і на стадії культивування у біореакторі пілотному.

Під час біосинтезу спостерігається значне піноутворення, тому ступінь заповнення ферментеру не повинно перевищувати 50%. Тому потрібен піногасник. Для пінорегулювання під час культивування та попередження викиду піни з біореактору використовують різні методи:

1. Дія на піну фізико-хімічних засобів (використання середовищ з низькою піноутворюючою здатністю; додавання ПАР, які зменшують міцність плівок; речовини, які зв’язують піноутворювачі у поверхнево-неактивні комплекси).

2. Руйнування піни механічними, гідро- та аеродинамічними методами (ударна дія твердих поверхонь; струмені рідини чи газу; сепарування піни; різка зміна тиску газу у піні; руйнування піни потоками рідини, що перемішується).

3. Фізичні методи піногасіння (ультразвук, термічне гасіння гострим паром, електропіногасіння).

4. Стабілізація рівня піни шляхом тимчасового зменшення повітря, припинення перемішування, відбір надлишку піни.

5. Комбіновані методи.

Повний час біосинтезу окситетрацикліну при 26-28 ^оС складає 100-120 год.

У перший період спостерігається інтенсивний ріст міцелію, швидко використовуються джерела вуглецю, азоту та фосфору, необхідна підвищена аерація. Утворення антибіотика на цій стадії практично не відбувається. У культуральній рідині у невеликих кількостях накопичується піровиноградна та оцтова кислоти, які у подальшому клітина використовує у біосинтезі тетрацикліну.

У другому періоді спостерігається різке зниження швидкості росту клітин та споживання поживних речовин, накопичення піровиноградної та оцтової кислот не відбувається, йде активний біосинтез антибіотику.

Готову культуральну рідину, що містить до 4,5% сухих речовин, направляють на вакуум-випарювання. Концентрована культуральна рідина поступає у розпилювач-сушарку та висушується при температурах вхідного та вихідного теплоносія 160-200^оС – 70-80^оС. В деяких випадках культуральну рідину висушують разом з буряковим жомом (250 кг на 1 м³).

Кормові препарати тетрацикліну застосовуються як додаткові не лікарські препарати з метою стимуляції росту. Такі кормові препарати містять неконтрольовану кількість вітаміну В₁₂, мікроелементи, мікробний білок, жири та мінеральні солі. Такі препарати володіють широким антибактеріальним спектром дії по відношенню до грам позитивних та грам негативних мікроорганізмів, сприяють кращому росту та розвитку, профілактують шлунково-кишкові та легеневі захворювання.

Біосинтез хлор тетрацикліну в основних ферментерах відбувається на поживному середовищі (%):

Ø Зерно-картопляна барда -10,

Ø Борошно (крохмальність 51%) -5,

Ø Амонію нітрат – 0,7,

Ø Крейда -0,5,

Ø Натрія хлорид -0,3,

Ø Кобальта хлорид -0,0001,

Ø Піногасник до 0,2

Культивування відбувається при 27-28^оС 30-40 год з обов’язковим перемішуванням та аерацією.

Культуральну рідину переробляють двома способами.

ПЕРШИЙ СПОСОБ.

Ø Культуральну рідину концентрують у вакуумі. До отриманого концентрату додають консервант- піросульфат натрію та висушують у сушарці.

ДРУГИЙ СПОСОБ:

Ø Культуральну рідину обробляють розчином гашеного вапна з метою переведення розчинено у воді хлор тетрацикліну у осад у вигляді кальцієвої солі. Осад направляють на фільтр-прес.

Ø Осад вивантажують у бункер та за направляють на грануляцію та висушування.

Ø Висушені гранули збирають у окремий відсік, де подрібнюють. Отриманний продукт стандартизують за допомогою наповнювача.

По закінченню виготовлення антибіотиків їх перевіряють на активність по відношенню до тест-штамів. Тому визначають біологічну активність препарату – здатність гальмувати ріст і розвиток або вбивати мікроорганізм. Розрізняють цидну дію та статичну дію препарату.

Для кількісного визначення активності антибіотику застосовують показник одиниці дії. ОД – активність певної вагової кількості антибіотику, що прийнятий за еталон

ОД пеніциліну – мін. доза, яка пригнічує ріст тест-штаму золотистого стафілококу у 50 мл поживного бульйону.

Визначення біологічної активності антибіотику проводять за допомогою:

Ø Мікробіологічних методів;

Ø Хімічних методів;

Ø Фізико-хімічних методів.