2.2.2. Спектральные методы количественного определения белка

Для количественного определения белка в водных растворах широко используются методы УФ-спектроскопии, спектроскопии в видимой области и фотоэлектроколориметрии.

Количественный анализ белков в ближней УФ-области электронного спектра заключается в измерении собственного поглощен ия. Типичные УФ-спектры белков в ближней (кварцевой) области (200-350 нм) представлены на рис. 2.4. Максимум поглощения вблизи 280 нм обусловлен наличием в их структуре остатков ароматических аминокислот (Phe, Tyr, Trp, His). Резкое увеличение поглощения в направлении от 240 нм к 200 нм с максимумом в вакуумной области около 180 нм (на рисунке не показано) обусловлено возбуждением электронов атома азота пептидной группы (n→π* переход).

Поглощение в УФ-области количественно описывается законом Бера – Ламберта – Бугера:

D = − lgI/I_o = εLC,

где D – оптическая плотность; I – интенсивность света, прошедшего через образец; I_o – интенсивность падающего на образец света; ε – молярный коэффициент поглощения, л/моль∙см; L – толщина слоя, см; C – концентрация, моль/л. В том случае, если концентрация используется в размерности г/100 мл, коэффициент пропорциональности называется удельным коэффициентом поглощения и обозначается символом Е^1%_{1 см} .

Аналитической полосой при определении концентрации белка обычно является λ_{280 нм}, соответствующая максимуму поглощения. Исследуемый раствор готовят так, чтобы оптическая плотность фотометрируемого раствора лежала в зоне 0,1-1,0. Значения D₂₈₀ для большинства белков при концентрации 1 мг/мл находятся в диапазоне 0,5-2,0, хотя известно также довольно много белков, для которых D₂₈₀ не попадает в указанный диапазон. Молярный коэффициент поглощения тем больше, чем больше доля остатков аминокислот с ароматическими ядрами в молекуле белка. Для определения концентрации используются несколько методических приемов.

1. Расчет с использованием известного значения коэффициента поглощения:

C = D/ε∙L.

Это самый простой метод, однако применение его весьма ограничено по следующим причинам. Как видно из рис. 2.4, коэффициенты поглощения разных белков весьма отличаются друг от друга, иногда в несколько раз (сравни спектры рибонуклеазы и химотрипсиногена), поэтому рассматриваемый метод приемлем только для определения концентрации белка с известным значением ε в растворах, не содержащих других белков и аминокислот с ароматическими заместителями. Анализ раствора неизвестного белка или раствора, содержащего несколько белков, таким методом не возможен.

2. Расчеты в методах с использованием стандартных образцов. Использование стандартного образца исключает необходимость использования величины ε. Различают несколько методических подходов к определению концентрации с использованием стандартных образцов: метод стандартов, метод градуировочного графика и метод добавок.

Метод стандартов состоит в измерении оптической плотности раствора стандартного белка (D_ст.) известной концентрации (C_ст.) и измерении оптической плотности (D_ис.) исследуемого раствора белка в кюветах одинаковой толщины. В этих условиях имеем

D_ис. = εLC_ис; D_ст. = εLC_ст.

Поделив одно уравнение на другое, после преобразования имеем

С_ис. = D_ис.∙С_ст. / D_ст.

Метод градуировочного графика состоит в измерении оптических плотностей серии стандартных растворов (обычно 5-6) известной концентрации и построении градуировочного графика в координатах «оптическая плотность – концентрация белка в исследуемом растворе». Этот метод удобен при серийных испытаниях.

Метод добавок заключается в измерении оптической плотности исследуемого раствора, к которому после этого добавляют известное количество стандартного образца белка и вновь измеряют оптическую плотность.

Очевидно, что С_ис. = D_ис.∙С_ст. / D_ис.+ст. – D_ис.

Итак, анализ возможностей определения концентрации белка в растворах путем измерения непосредственного поглощения белка при одной аналитической длине волны в УФ-области показывает, что он приемлем лишь для анализа растворов индивидуальных известных белков.

Лучшим методом определения концентрации белка по его непосредственному поглощению является метод Варбурга^ и Кристиана, основанный на измерении оптической плотности при двух длинах волн – 280 и 260 нм. При этом не требуется использование стандартного образца и знание значения коэффициента поглощения. Метод базируется на том, что отношение D280/D260 для различных белков – величина маловариабельная и равна 1,75 (сравни с рис.2.4). Это позволяет определять обшую концентрацию белка при анализе смесей белков.

Расчет при этом проводится по простой формуле

С_{белка (мг/мл)} = 1,55D₂₈₀ − 0,76D_260.

Более того, метод позволяет определять белок в присутствии нуклеиновых кислот. При этом используются пересчетный множитель ƒ (табл. 2.2). В этом случае расчет производится по формуле

С_{белка (мг/мл)} = D₂₈₀ ∙ƒ.

Таблица 2.2