§ 4.2. Выделение и идентификация белка

Принцип метода. Выделение казеина. В молоке казеин находится в виде растворимой кальциевой соли, т.е. в виде анионов. Свободный же казеиноген в форме электронейтральных молекул отличается весьма малой устойчивостью в воде. Поэтому при подкислении молока до рН 4,7 (изоэлектрическая точка казеиногена) казеиноген выпадает в осадок, т.е. молоко свертывается.

Биуретова реакция. В щелочной среде в присутствии солей меди растворы белка приобретают фиолетовый цвет с красным или синим оттенком, зависящим от количества пептидных связей в молекуле белка. Такую реакцию дают все белки, а также продукты их неполного гидролиза – пептоны и полипептиды, содержащие не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция обусловлена наличием в белке пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с сернокислой медью окрашенные комплексы.

Группа, образующая пептидную связь (-СО-NH-), в щелочной среде присутствует в своей таутомерной енольной форме:

При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд, с помощью которого кислород взаимодействует с медью, возникает солеобразная связь; кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их неподеленных электронных пар. Возникающий таким образом комплекс очень стабилен. Схематически реакцию можно представить так:

Полипептид

Енольная форма полипептида

Биуретовый комплекс

Интенсивность окраски комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе.

Реакция Миллона. При добавлении к раствору белка реактива Миллона (раствор ртути в азотной кислоте, содержащей азотистую кислоту) белок выпадает в осадок, который при нагревании приобретает красно-коричневый цвет.

Реакция обусловлена наличием в белке аминокислоты тирозина, имеющей фенольное ядро, которое при взаимодействии с реактивом Миллона образует окрашенную соль своего нитропроизводного:

Тирозин Ртутная соль нитротирозина

(красно-коричневого цвета)

Рекцию Миллона дают все белки, за исключением тех, молекулы которых не содержат тирозина (желатин, клупеин и др.).

Свободный тирозин реагирует с реактивом Миллона аналогично, но при этом не образует осадка, а раствор приобретает красный цвет.

Реакция Фоля. При добавлении к раствору белка крепкой едкой щелочи, уксуснокислого свинца и последующем кипячении раствор начинает темнеть. Реакция обусловлена присутствием в белке серусодержащих аминокислот: цистина, цистеина и метионина. Эти аминокислоты при нагревании в присутствии крепкой щелочи разрушаются, образуя сернистый натрий:

Цистеин Серин

Уксуснокислый свинец реагирует со щелочью с образованием плюмбита натрия:

(СН₃СОО)₂Рb + 2NaOH → Pb(ONa)₂ + 2CH₃COOH

Сернистый натрий при взаимодействии с плюмбитом образует черный осадок сернистого свинца:

Na₂S + Pb(ONa)₂ + 2H₂O → PbS↓ + 4NaOH.

Черный осадок

Нингидриновая реакция. Белки, полипептиды, а также свободные α-аминокислоты дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином (трикетогидриндегидратом). Реакция характерна для аминогрупп в α-положении и обусловлена наличием α-аминокислот в молекуле белка.

При нагревании белка с водным раствором нингидрина аминокислоты окисляются и распадаются, образуя двуокись углерода, аммиак и соответствующий альдегид:

Аминокислота Нингидрин Альдегид Восстановленный

нингидрин

Восстановленый нингидрин конденсируется с аммиаком и окисленной молекулой нингидрина, образуя краситель типа мурексида фиолетово-синего цвета:

Окисленный Восстановленный Окрашеный продукт конденсации

нингидрин нингидрин (фиолетово-синего цвета)

Ксантопротеиновая реакция. При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты белок сничала выпадает в осадок, а затем при нагревании растворяется и жидкость окрашивается в желтый цвет. Эта реакция указывает на присутствие в белке ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот.

Реакция характерна для бензольного ядра циклических аминокислот, которые при обработке концентрированной азотной кислотой подвергаются нитрованию:

Тирозин Динитротирозин

(желтого цвета)

Нитропроизводные аминокислот в щелочной среде образуют соли хиноидной структуры, окращенные в оранжевый цвет.

Динитротирозин Аммонийная соль динитротирозина

(оранжевого цвета)

Аналогично протекает реакция нитрования триптофана и фенилаланина (поледняя нитруется труднее). Ксантопротеиновую реакцию дают почти все белки; исключение составляют клупеин и сальмин (из группы протаминов) и желатин, в молекуле которых почти полностью отсутствуют ароматические аминокислоты.

Реакция Сакагучи. Белки в присутствии щелочи дают красное окрашивание с гипобромитом и α-нафтолом. Реакция обусловлена наличием в белке аминокислоты аргинина, имеющей в своем составе гуанидиновую группировку.

Вероятно, гуанидиновая группировка окисляется гипобромидом и окисленный аргинин, соединяясь с α-нафтолом, образует продукт конденсации красного цвета:

Аргинин α-Нафтол Продукт конденсации

α-нафтола с окисленным аргинином

(красного цвета)

Реакция Адамкевича. При добавлении к раствору белка незначительных количеств глиоксиловой кислоты в присутствии крепкой серной кислоты получается красно-фиолетовое окрашивание. Эта реакция связана с присутствием в молекуле белка аминокислоты триптофана и основана на способности триптофана в кислой среде вступать в реакцию с альдегидами, образуя при этом окрашенные продукты конденсации.

Глиоксиловая кислота всегда присутствует в небольших количествах в ледяной уксусной кислоте, поэтому последнюю используют как источник глиокиловой кислоты:

Триптофан Глиоксиловая кислота

Продукт конденсации триптофана с глиоксловой кислотой

(красного цвета)

Цель: овладеть методикой выделения белка и освоить качественные реакции на белки.

Задачи:

1. Овладеть методикой выделения белка;

2. Освоить качественные реакции на белки:

• биуретову реакцию;

• рекцию Миллона;

• рекцию Фоля;

• нингидриновую реакцию;

• ксантопротеиновую реакцию;

• реакцию Сакагучи;

• реакцию Адамкевича.

Реактивы и растворы:

1. Молоко свежее;

2. Куриное яйцо;

3. Уксусная кислота, ч.д.а., 10% раствор;

4. Натр едкий, ч.д.а., 10% раствор;

5. Меди сульфат, ч.д.а., 1% раствор;

6. Нингидрин, 0,5% раствор;

7. Азотная кислота, ч.д.а., концентрированная;

8. Аммиак, ч.д.а. концентрированный;

9. Натр едкий, ч.д.а., 30% раствор;

10. Реактив Миллона: 100 г ртути растворяют в 143 мл концентрированной азотной кислоты (относительная плотность 1,4) сначала при комнатной температуре, затем на водяной бане; раствор разводят двумя объемами воды с небольшим количеством 1% раствора KNO₂ или NaNO₂; через некоторое время жидкость сливают с отстоявшегося осадка; при длительном хранении реактив окисляется;

11. -Нафтол, 0,1% спиртовой раствор; 0,1 г нафтола растворяют в 100 мл 70% этилового спирта;

12. Натрий бромоватистокислый (натрия гипобромит), 2% раствор; 2 г брома (0,65 мл) растворяют в 100 мл 5% раствора едкого натра при охлаждении льдом (относительная плотность брома 3,12) ; растворение производят под тягой;

13. Уксусная кислота, ч.д.а., ледяная;

14. Серная кислота, ч.д.а., концентрированная;

15. Свинецуксуснокислый, ч.д.а., 5% растор.

Порядок работы:

1.Выделение белка.

1.1.Выделение казеина из молока. К 2 мл молока добавляют 2 мл дистиллированной воды и 2 капли 10% уксусной кислоты. Образуется осадок казеина, который отфильтровывают. Фильтрат отбрасывают, а осадок казеина остородно снимают с фильтра стеклянной палочной и помещают в чистые пробирки.

1.2.Выделение яичного белка. У куриного яйца отделяют белок от желтка. Белок куриного яйца фильтруют через марлю. Профильтрованный белок разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:10.

2.Качественные реакции на белок.

2.1. Реакция Миллона. К 10 каплям 1% раствора белка добавляют 1 – 2 кали реактива Миллона и осторожно нагревают. Появляется красновато-коричневая окраска.

2.2.Реакция Фоли. К 5 каплям 1% раствора белка добавляют 5 капель 30% раствора едкого натра и 1 каплю 5% раствора уксуснокислого свинца. При интенсивном кипячении жидкость темнеет, образуя черный осадок сернистого свинца.

2.3.Биуретовая реакция. К 5 каплям 1% раствора белка добавляют 10 капель 10% раствора едкого натра и 1 каплю 1% раствора сульфата меди. Появляется красно-фиолетовое (или сине-фиолетовое) окрашивание.

2.4.Нингидриновая реакция. К 5 каплям 1% раствора белка добавляют 3 капли 0,5% раствора нингидрина и нагревают до кипения. Через 2–3 мин появляется розовое, красное, а затем сине-фиолетовое окрашивание.

2.5.Ксантопротеиновая реакция. К 5 каплям 1% раствора белкадобавляют 3 капли концентрированной азотной кислоты и (осторожно!) нагревают. Появляется желтое окрашивание. После охлаждения осторожно добавляют 10 капель канцентрированного раствора аммиака или 30% раствор едкого натра. Желтая окраска переходит в оранжевую.

2.6.Реакция Сакагучи. К 5 каплям 1% раствора белка добавляют 5 капель 10% раствора едкого натра, 3 капли 0,1 спиртового раствора нафтола и по каплям (всего 1–5 капель) 2% раствора гипобромата натрия. Жидкость становиться красного цвета.

2.7.Реакция Адамкевича. К 5 каплям 1% раствора белкадобавляют 5 капель концентрированной уксусной кислоты. Раствор сначала слегка нагревают, затем охлаждают и по осторожно, чтобы жидкости не смешались (подслаивание), приливают 10 капель концентрированной серной кислоты. На границе двух слоев жидкости наблюдается красно-фиолетовое окрашивание в виде кольца. Появление окраски можно ускорить нагреванием.