Декарбокси- лазы, редуктазы

Рис. 81. Схема путей образования и расходования унифицированных форм энергии!

Среди названных в таблице 31 представителей многие нашли применение в биотехнологии (аэробные и анаэробные виды), а ряд из них относится к числу перспективных для практического ис- пользования (метанобразующие бактерии, клеточные культуры лекарственных растений и животных).

Следует подчеркнуть, что в сравнительном плане экономически более выгодными являются анаэробные биотёхнологические про- цессы, когда резко сокращаются затраты, связанные с подачей стерильного воздуха в биореакторы (он здесь не нужен), с работой мешалок и барботеров и др. А с этим упрощаются конструкции аппаратов и происходит их удешевление.

6.6. Управление биотехнологическими процессами. -Все био- технологические процессы относят к числу управляемых, хотя уровень управления различен, и он изменяется со временем. Поэтому неуправляемые процессы могут быть в природных усло- виях (тогда они не относятся к разряду биотехнологических) или они осуществляются с расчетом на саморегулируемость биообъек- та. Абсолютно неуправляемых биотехнодогических процессов не существует. Например, микробиологические процессы характери- зуются рядом особенностей, которые необходимо учитывать при конструировании оборудования. К таким особенностям относятся:

275

1) необходимость обеспечения стерильности (см. раздел 6.3) в биореакторе, включая коммуникации, датчики, все продуктовые потоки, идущие в реактор;

2. проведение культивирования аэробов и анаэробов в системах "газ-жидкость-твердое тело" или анаэробов в системах "жидкость- твердое тело" при низких скоростях биохимических процессов и многокомпонентности состава питательных сред для выращивания биообъектов;

3. исключительная сложность механизмов регуляции биосинте- за БАВ (или выращивания биомассы клеток) при заметных изме- нениях физико-химических показателей культуральных жидко- стей;

4. заметная чувствительность биообъектов к воздействию фи- зико-механических факторов при перемешивании и других опе- рациях.

Чистота и стерильность — важнейшие составляющие благопо- лучно проведенного биотехнологического процесса. Это достига- ется при осуществлении подготовительных операций перед куль- тивированием биообъекта, в том числе — стерилизации питатель- ных сред, пеногасителей, различных жидких добавок, оборудова- ния и коммуникаций, фильтров для очистки воздуха, использова- ния высококачественного посевного материала.

Нарушение гарантированного "чистого" культивирования био- объекта согласно регламентным условиям сопровождается, как правило, его загрязнением контаминирующей микрофлорой. При этом выявление микробов-загрязнителей может быть трудным из-за присутствия единичных клеток, например, бактерий — кон- таминантов в бактериальных вакцинах, или грибов-контаминантов при культивировании грибов-продуцентов ферментов. В равной мере можно ожидать загрязнения на промежуточных стадиях или в конечном продукте бактериальных или грибных токсинов. К тому же, обнаружение микробов-контаминантов или их токсинов, как правило, возможно после завершения какой-то стадии биотехно- логического процесса, либо в готовом продукте. Следует еще подчеркнуть и тот факт, что методы выявления посторонней микрофлоры, к сожалению, в большинстве случаев низко чувст- вительны.

Биообъект (клетки, ткани), будучи сложной системой, не под- дается охвату единой математической моделью, а это исключает возможность описания процесса культивирования конечным чис- лом уравнений химической кинетики. Даже при гомогенно-непре- рывном процессе культивирования в околоклеточных областях

276

биосистема гетерогенна (различие в массообмене в многофазной среде — "газ-жидкость-твердое тело", "жидкость-твердое тело" при различии структур оболочек, клеточных стенок, мембран, их адге- зивной способности и пр.).

Биологические системы являются саморегулирующимися (включая способность к мутациям), что может привести к непред- виденному изменению биотехнологического процесса.

Утрата качеств биообъекта равноценна катастрофе. Здесь мож- но указать на автоселекцию биообъекта в биореакторе, например, какогоглибо микроба-продуцента вторичного метаболита. Если в ферментаторе объемом 50 м³ при коэффициенте заполнения 0,6 и длительности культивирования 4—5 суток будет содержаться 10¹²'¹⁵ и более клеток, то, учитывая частоту спонтанных мутаций 1 • 10~⁵ — 1 • Ю^-7, число мутантов может достичь величин 10³—10⁷ за генерацию. Поэтому не исключено, что процесс ферментации может протекать вопреки регламентным требованиям.

Иногда автоселекция приобретает положительное значение в том смысле, что, например, возврат к "дикому типу" в результате спонтанных мутаций сопровождается более высокой скоростью размножения культуры и тогда, стремясь к накоплению клеточной белковой массы, мы получаем желанный результат.

Квалифицированное управление любым биотехнологическим процессом основывается на глубине познания "поведенческих реакций" биообъекта в конкретных условиях культивирования при получении целевого продукта, когда с помощью соответствующего приборного оснащения необходимо непрерывно или периодически фиксировать контролируемые показатели (1°, рН, количество био- массы клеток, скорость потребления источников питания, количе- ство растворенного кислорода, количество образующегося мета- болита и др.). При размножении и развитии клеток происходит постоянное изменение отдельных параметров биотехнологическо- го процесса, и в каждый данный момент эти клетки функциони- руют в иных условиях.

Сложность биологических систем сказывается на необходимо- сти многопрофильного контроля за ними, например, в биореакто- рах (таблица 32). Указанные в таблице виды контроля в основном характерны для культивирования биообъектов в реакторах боль- шой емкости. На небольших биореакторах число контролируемых параметров заметно сокращается (например, чаще регистрируют лишь температуру, рН, подачу стерильного воздуха и количество клеток и/или метаболита).

В случаях накопления биомассы клеток в качестве антигенного вещества можно воспользоваться серологическими методами, включая иммуноферментные. Меченые радиоактивными изотопа- ми антитела рекомендуют применять для определения антигенных детерминант на поверхности клеток.

Контроль и управление биотехнологическими процессами, ре- ализуемыми в периодическом или непрерывном режимах (даже при использовании одних и тех же биообъектов), будут не одина- ковыми. Например, одноклеточные культуры в глубинных услови- ях в периодическом режиме проходят все фазы своего развития (скрытую — 1ад, экспоненциальную — 1од, стационарную — сопз!., отмирания— 1е1.). Поэтому продукция какого-либо вторичного метаболита будет далеко неравнозначной в ту или иную фазу развития продуцента. В непрерывном режиме клетки находятся, как правило, в одной определенной фазе.

Нитчатые грибы растут верхушками гиф, поэтому у них со временем изменяется не только масса грибницы, но и морфология клеток. Если у прокариот количество клеточной массы возрастает в течение 1од-фазы экспоненциально (в геометрической прогрес- сии) , то грибы растут медленнее и не экспоненциально, биомасса их клеток приблизительно пропорциональна третьей степени вре- мени. Так, в глубинных условиях продуцент антибиотика цефаЛос- порина С — Серпа1о8ропит асгетопшт имеет три морфологиче- ские формы: артроспоральную, фрагментарно-гифальную (набух- шую) и гифальную, способных превращаться друг в друга при изменении среды культивирования. Однако, антибиотик образу-

ется главным образом второй формой. Поэтому контроль и управ- ление таким биотехнологическим процессом должен проводиться с учетом указанных морфо-функциональных изменений продуцен- та.

Уровень управления различается также в зависимости от ре- жима проведения биотехнологического процесса: периодический, полунепрерывный и непрерывный. Периодические процессы чаще используются в случаях получения метаболитов (аминокислоты, этанол, уксусная кислота и др.), полунепрерывные и непрерывные — при наработке клеточной биомассы, например, дрожжей. Пол- унепрерывные процессы отличаются от непрерывных тем, что при их реализации периодически отбирают 25—75% культуральной жидкости и добавляют равный объем свежей питательной среды. Непрерывные процессы ведут в проточных реакторах-хемостатах или турбидостатах (по лат. шгЫсшв — мутный), в которые непре- рывно дозированно поступает свежая питательная среда и непре- рывно в таких же количествах отводится культуральная жидкость. Таким образом, содержимое биореактора тождественно содержи- мому отбираемой культуральной жидкости в каждый данный момент. Такие хемостаты или турбидостаты используют в лабора- торных условиях для изучения кинетики клеточного роста и мета- болизма с последующей экстраполяцией результатов при масшта- бировании процессов в крупногабаритных реакторах.

Различие хемостатов и турбидостатов заключается лишь в том, что контроль за процессом включает фотоэлектрические элементы за регуляцией подачи свежей питательной среды и отвода культу- ральной жидкости.

Если бы рост (Н) ограничился вследствие истощения питатель- ного вещества, то Н = КС, где К — константа, а С — начальная концентрация лимитирующегося питательного вещества. Следова- тельно, между С и Н существует прямая зависимость. Если какое-то питательное вещество изначально содержится в довольно низкой концентрации, то промежуточные метаболиты будут образовы- ваться с ограниченной скоростью, и общая скорость роста будет функцией концентрации названного выше вещества. Эксперимен- тально установлено, что в соответствии с уравнением С

Ну=Нук^, ₊^ получается кривая типа гиперболы. В этом уравнении

Нлг—скорость роста, Н^к—максимальная скорость роста, достигае- мая при повышении концентрации питательного вещества; С— концентрация лимитируемого питательного вещества; С1—величи-

280

на С, при которой Ну=1/2Ну\а. Общий рост (Н) и скорость роста (Ну) являются существенными критериями во многих биотехноло- гических процессах. Ими часто пользуются при выборе контроля, например, за ходом накопления клеточной биомассы в качестве целевого продукта. При периодических процессах с помощью контрольно-измерительных приборов и автоматики (таймеры, ре- ле, датчики и др.) управляли биотехнологическими процессами. Теперь пытаются заменять их ЭВМ, или компьютерами.

При непрерывных биотехнологических процессах управление ими не усложняется, так как биосистемы здесь работают в опре- деленных стационарных состояниях и на определенном этапе сходны с системами, функционирующими в периодических режи- мах. Однако биосистема изменяется на пути от начального (стар- тового) периода к стационарному, и чем этот путь .короче, тем лучше. Таким образом, в подобных случаях цель управления фокусируется на поддержании заданного стационарного состоя- ния, используя, например, микро-ЭВМ. На рис. 82 показана прин- ципиальная схема работы ЭВМ.

Рис. 82. Архитектура и принцип работы ЭВМ (по Л. В. Зудину, В. М. Кантере, Г. А. Угодчикову, 1987): 1 — уст- ройство управления, 2 — ввод, 3 — вывод, 4 — арифме- тическое устройство, 5 — ис- ходные числа, 6 — промежу- точный результат, 7 — очеред- ная команда, 8 — адресная команда, 9 — код операции, а—программа, в—запомина- ющее устройство, б—данные, г—результаты.

Некоторые микро-ЭВМ с количеством операций от 1000 до 500000 операций в секунду используются главным образом как вычислительные (управляющие) блоки в системе управления и регистрации.

Упомянутые ранее РО-статы (см. раздел 6.4), применяемые для контроля и поддержания необходимого уровня растворенного кислорода в питательных средах, обычно включают микрокомпь- ютер, интерфейс, расходомеры для воздуха и кислорода, и сенсоры для растворенного Ог.

Микрокомпьютеры используют также в комплексном контроле за ферментацией при получении некоторых вторичных метаболи- тов (например, этанола).

ЭВМ удобны в случаях одновременного контроля и учета многих параметров. Функционально-законченный программно-уп- равляемый малоразрядный блок, выполненный в виде одной или нескольких больших интегральных схем, называют микро- процессором (выполняет до нескольких миллионов операций в секунду). Его используют для управления ферментационными процессами. Микропроцессоры можно устанавливать непосредст- венно на обслуживаемых аппаратах.

заданное значение

регулируемого

параметра

Оптимизацию процессов биологической технологии можно расчленить на три уровня сложности. Первый — низший, решае- мый обычно с помощью микро-ЭВМ, связан с регулированием параметров биотехнологического процесса с помощью системы обратной связи (рис. 83).

Рис. 83. Главные элементы системы управления с обратной связью: (1 — регулятор, 2 — исполнительный механизм, 3 — процесс, 4 — измерительный прибор).

Второй (средний) уровень рассчитан на более подробный ана- лиз данных с последующим диалогом оператора с ЭВМ через терминал. Здесь допустима работа с мини-ЭВМ с числом операций от 100—300 тыс. до 1 млн. в секунду.

На третьем (наивысшем) уровне сложности применяют боль- шие и супер-ЭВМ с числом операций от десятков-сотен тысяч до 12 млн. операций в секунду. Информация, поступающая от первого и второго уровней, используется для решения сложных модельных уравнений в целях совершенствования режимов биотехнологиче- ского процесса в целом. Указанные три уровня сложности расчетов оптимизации условно представлены на рис. 84.

282

База ;

. _п

Последующее моделирование "^Д, %

Графическое изучение

Документирование )—

■| Помощь оператору г~*Ф

Автономная обработка данных (ана- лиза и.тт. д.)

_/-

-а ' I

Г

Изучение в реальном масштабе времени

Обработка данных в реаль- ном масштабе времени

Усложнение системы управления (в соответ- ствии с программой или алгоритмом)

Обычные системы "^ управления

Запись данных в аналоговой системе

Измерение, отображение и хранение данных

I

Микробиологический процесс

Рис. 84. Три уровня сложности расчетов оптимизации микробиологического процесса в биотехнологии (Л. Валентини, Ф. Андреони, М. Буволи, П. Пенелла, 1982).

В последнее десятилетие все больше расширяется применение различных ЭВМ и микропроцессоров для управления биотехноло- гическими процессами. Их конструкции постоянно совершенству- ются, цены снижаются, а программное обеспечение заметно убы- стряется. Тем не менее, многие существующие биотехнологиче- ские производства частично или полностью еще нельзя отнести к автоматизированным системам управления (АСУТП).

6. 7. Системы СХР и СМР в связи с качеством биотехнологи- ческих продуктов. В целях организации качественного проведения

283

доклинических испытаний лекарственных и других биологически активных веществ (пищевых добавок, агрохимикатов и др.) в промышленно развитых странах (Англия, Германия, США, Фран- ция, Япония и др.) утверждены единые правила системы С1Р (Сооа 1лЪога1огу Ргаснсе). Существует группа С1Р в Европейском Центре по экологии и токсикологии химической промышленности; в США система С1Р действует с июня 1979 г. Главными в такой системе являются следующие основные действия:

1. заблаговременная разработка стандартной методики прове- дения испытаний, или БОР (51апс1аг<1 ОрегаИпд Ргосейиге) приме- нительно ко всем ее этапам;

2. назначение руководителя и ответственных за каждый вид испытаний;

. 3) каждому ответственному исполнителю поручается строго выполнять все операции в отведенных ему пределах;

4. результаты выполнения операций должны быть внесены в специальный протокол, датированы и подписаны;

5. в. случае выполнения сложных операций, во избежание ошибок, рекомендуется прибегать к двойной проверке;

6. вустановленном порядке исполнитель докладывает руково- дителю о ходе испытаний. Руководитель должен быть компетент- ным во всех делах, связанных с испытанием;

7. фактические данные, записи и препараты (вещества) должны храниться в полном порядке таким образом, чтобы всегда можно было отыскать требуемое (необходимое);

8. окончательный отчет по своему содержанию должен отра- жать свежие и еще не обработанные данные, а также сопровож- даться обсуждением, составленным ответственным исполнителем; на отчете проставл^ютсядата и подписи (ответств^шюто-исподни- тел^р^л^ш^гюдтверждающих содержание отчета); ^

9. должна быть служба качественной оценки испытаний —ОАИ (СшаШу Азвиагапсе Шй). Лица, занятые в этой службе, обязаны стремиться к тому, чтобы свою внутреннюю инспекцию проводить в установленном порядке и по необходимости выдавать рекомен- дации,^аправленные на совершенствование процессов проведе- ния испытаний.

На систему СЬР опираются в случаях испытания веществ: на микробную обсемененность, на пирогенность; острую, пОдострую и хроническую токсичность, на Специфическую токсичность (кан- церогенность, антигенность, лекарственную зависимость, повреж-

284

дение зародышевых клеток; раздражение слизистых оболочек, кожи и в месте введения вещества; мутагенность, тератогенность — от греч. 1ега1о8 — чудовище, урод; цитотоксичность), на безопас- ность для макроорганизма при введении т лпуо (абсорбция, рас- пределение, скорость выведения, метаболизм); проводят фармако- логические испытания с оценкой фармакокинетики (действие изучаемого лекарственного вещества на организм) и фармакоди- намики (изучение силы действия лекарственного вещества).

В связи с необходимостью проведения названных испытаний создают специальные группы: общую (в том числе для контроля за гигиеной и санитарией личного состава), микробиологическую, метаболизма, общефармакологических испытаний, общих клини- ческих исследований, патологоанатомическую, проведения экспе- риментов на животных, обработки данных (с включением управ- ления ЭВМ), по приготовлению проб, аналитическую, по управле- нию исследованием и, при необходимости, другие. Во главе каждой группы утверждается руководитель, который не должен совмещать свои прямые обязанности с работой в группе инспекций.

Соблюдение требований системы СЬР должно быть подкреп- лено совершенством организации всех вспомогательных служб и достаточным материальным обеспечением. Желательно иметь от- дельное здание для проведения биологических испытаний, где экспериментальные животные размещались бы в помещениях соответствующих классов: для гнотобионтов, зараженных, конт- рольных, предназначенных для работы с радиоизотопами, для карантинизации и т. д.

В работе с животными должны учитываться все инфекционные заболевания, которые могут сказаться на результатах эксперимен- тов. При этом необходимо иметь в виду и тот факт, что отдельные возбудители инфекционных заболеваний могут передаваться от человека к животным и наоборот. К их числу относятся вирусы бешенства, лимфоцитарногохориоменингита, шигеллы, некоторые бруцеллы (ВгисеЦасашБ), сальмонеллы, микобактерий туберкулеза, токсоплазмы (Тохор1агта допсШ), дизентерийная амеба.

Одобренный препарат (вещество) после лабораторных пред- клинических испытаний по системе СЬР и последующей клиниче- ской проверки разрешается к выпуску в условиях промышленного производства. Для обеспечения изготовления высокого качества продукта Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) еще в 1968 г. утвердила "Требования для практики качественного произ-

285

водства при изготовлении и контроле качества лекарств и к специалистам в области фармации". Годом позже эти требования, вошедшие (с небольшими уточнениями й изменениями) в правила системы СМР (Соог! МапиГасШппд Ргасисе) были рекомендованы Ассамблеей ВОЗ для международной торговли, а в 1971 г. они были изданы в качестве приложения ко второму изданию Международ- ной Фармакопеи. ' * -

СМР — это единая система требований пЪ контролю качества - лекарственных средств с начала переработки сырья до производ- ства готовых препаратов, включая общие требования к помещени- ям, оборудованию и персоналу. С 1975 г. правила СМР расширены, и они касаются различных химических и биологических веществ в индивидуальном виде, ветеринарных препаратов, применяемых * в животноводстве; исходных материалов для использования в дозированных формах, если они включены в законодательства стран-экспортеров и стран-импортеров; и, наконец, информации о безопасности и эффективности перечисленных веществ, мате- риалов и препаратов.

С учетом издания в 1987 г. руководств Международной Орга- низации Стандартизации (130) серии 150 9000—9004 по системам качества возникла необходимость пересмотреть существовавшие требования СМР. В сентябре 1991 г. на специальной конференции по СМР в г. Москве представлен пересмотренный проект требо- ваний СМР, включающий три части:

1) "Управление качеством в промышленном производстве ле- карственных средств: философия и основные составляющие";

2) "Практика качественного производства и контроль качества";

3) "Дополнительные и вспомогательные направления". Первая часть содержит 12 разделов, касающихся организации

контроля за качеством производства, санитарии и гигиены, заклю- чения контрактов, стандартных рабочих методик, оформления необходимой документации и др.

Вторая часть содержит два раздела — производство и контроль качества. Применительно к производству лекарственных средств указано, что оно должно опираться на принцип четкого соблюдения методов ведения технологического процесса согласно норматив- но-технической документации с целью получения продукта требу- емого качества и в соответствии с разрешением на его изготовле- ние и продажу. По возможности избегать любых отклонений от методик или инструкций. При наличии таких отклонений необхо-

286

димо согласование, разрешение, утверждение и подпись назначен- ного ответственного лица, а при необходимости — привлечение службы отдела контроля качества.

Операции с различными продуктами не должны выполняться одновременно и последовательно в одном и том же помещении пока не устранен риск перемешивания или перекрестного загряз- нения.

Доступ в производственные помещения должен быть ограничен лишь определенным кругом лиц, занятых в производстве. Избегать изготовления немедицинской продукции в зонах и на оборудова- нии, предназначенных для изготовления фармацевтической про- дукции. При работе с сухими материалами и продуктами необхо- димы меры предосторожности для предупреждения возникнове- ния, накопления и распространения пыли, что может привести к перекрестному загрязнению изготавливаемых продуктов или к их микробному загрязнению. Микробы могут попадать в воздух и на частицы пыли из обсемененных ими материалов и продуктов при изготовлении, с загрязненных оборудования и одежды, кожи работающих людей. Перекрестное загрязнение может быть пред- отвращено изготовлением каждого целевого продукта в раздель- ных зонах (пенициллины, живые вакцины и другие БАБ) или, по крайней мере, разделением изготовления их по времени; обеспе- чением соответствующих воздушных шлюзов; ношением защит- ной технологической одежды; использованием средств эффектив- ной деконтаминации оборудования, стен, и пр.; использованием "закрытых систем" производства и т. д.

Необходимо проверять правильность и надежность сочленения трубопроводов и другое оборудование, используемое для транс- портировки продуктов (материалов) из одной зоны в другую. Дистиллированная или деионизированная вода, поступающая по трубам, должна соответствовать санитарно-микробиологическим нормативам. Операции по техническому обслуживанию или ре- монту не должны сказываться на качестве продукции.

Контроль качества продукции касается процесса забора проб, проведения исследований, документации и пр. Все исследования должны проводиться согласно утвержденным инструкциям для каждого материала или продукта.

Забор проб осуществляют таким образом, чтобы не загрязнить их или не подвергнуть нежелательному воздействию, сказываю- щемуся на качестве продукта или, напротив, чтобы отбираемый

287

материал не был токсичным (вредным) для здоровья оператора.

" Для каждой партии продукта до выпуска должна иметься лабораторная документация с подтверждением соответствия ко- нечного продукта спецификациям.

Из каждой партии целевого продукта оставляют пробы на хранение при рекомендуемых условиях сроком не менее года, превышающего срок годности. Пробы должны храниться в таком количестве, чтобы можно было при необходимости провести как минимум два повторных исследования.

Третья часть требований СМР включает разделы о стерильных фармацевтических продуктах и практике качественного производ- ства основной массы лекарственных субстанций.

Необходимо помнить о том, что лица, обладающие повышенной чувствительностью к конкретному веществу — действующему или вспомогательному, не должны включаться в группу исполнителей. Для них допустима работа в отделении или цехе упаковки, где исключен контакт с аллергеном.

В 1991 г. правила СМР утверждены.в нашей стране примени- тельно к производству и контролю качества лекарственных средств. Эти правила соответствуют Международной Системе СМР и включают следующие разделы: введение, терминология, персонал, здания и помещения, оборудование, процесс производ- ства, отдел технического контроля, аттестация и контроль произ- водства; выделены требования к стерильным лекарственным сред- ствам и описаны особенности их производства.

Соблюдение правил СМР обеспечивает выпуск качественных продуктов и гарантирует благополучие потребителей. В 1995 г. ВбЗ планирует утвердить СРР (Соой РЬаггпасу Ргасисе) по предложе- нию Международной Фармацевтической Федерации (Р1Р).