7.2. Некоторые особенности культивирования биообъектов.

При периодическом культивировании целесообразно создать ис- кусственно такое установившееся состояние, при котором концен- трация клеток, удельная скорость роста и окружающая клетки среда не изменялись бы со временем. Такие условия возможны при непрерывном культивировании, когда клетки продуцента раз- множаются со скоростью, зависящей от притока питательных веществ и некоторых других условий. Часть объема культуральной жидкости постоянно вытекает с той же скоростью, с какой подается среда в аппарат. Метод проточного культивирования может быть организован как процесс полного вытеснения и как процесс полного смешения. Осуществление первого возможно для культи- вирования анаэробных микроорганизмов в ферментаторе, пред- ставляющем собой трубу, в которую с одного конца непрерывно подают питательную среду и посевной материал, а из другого конца отбирают культуральную жидкость. Процесс происходит без пе- ремешивания и аэрации. Когда среда и посевной материал попа- дают в ферментатор, популяция находится в лаг-фазе, а на выходе из ферментатора культура может находиться в любой фазе в зависимости от скорости подачи среды. В ферментаторе воспро- изводится полная кривая размножения, но не во времени, а в пространстве.

В процессе полного смешения размножение культуры происхо- дит в ферментаторе при интенсивном перемешивании и аэрации. Во всем объеме культуральной жидкости условия должны быть одинаковыми. При этом в ферментаторе могут быть созданы условия, соответствующие любой точке кривой размножения куль- туры, выращиваемой периодическим способом. Процесс полного смешения может быть организован по типу системы "турбидостат" и "хемостат".

В системе "турбидостат" в ферментаторе поддерживают плот- ность популяции постоянной, и при быстром протоке среды созда- ются условия, близкие к тем, которые соответствуют логарифми- ческой фазе, при медленном — приближаются к условиям, соот- ветствующим стационарной фазе. В установившемся режиме ра- боты ферментатора удельная скорость протока среды равна удель- ной скорости размножения культуры. Повышение скорости про- тока или воздействие, замедляющее рост, приводят к тому, что скорость размножения оказывается меньше скорости протока и клетки культуры будут "вымыты" из ферментатора.

В системе "хемостат" величину клеточной популяции контроли- руют с помощью отдельных компонентов питательной среды.

зоб

Среду составляют так, чтобы один из компонентов, необходимый для роста биомассы клеток, был в недостатке или лимитировал рост, поддерживая тем самым культуру в нужном состоянии. Используя батарею ферментаторов, можно в каждом аппарате постоянно поддерживать продуцент в определенной фазе размно- жения.

В настоящее время непрерывное культивирование применяют для получения белково-витаминных концентратов (БВК), кормовых дрожжей, лимонной кислоты, лизина.

Культивирование м'акромицетов в специально подобранных условиях характеризуется некоторыми особенностями. Во-первых, в стационарных условиях базидиомицеты формируют плотные пленки на поверхности жидких питательных сред; во-вторых, в глубинных культурах они образуют агломераты. Поэтому, напри- мер, при выращивании вешенки обыкновенной (Р1еигоги5 ойгеагив) соблюдают следующую очередность этапов: культивирование грибного мицелия в колбах на качалке, дезинтеграция мицелиаль- ных агрегатов да частиц размером 100—200 мкм (инокулят), засев ферментационной среды (0,4—0,5 г/л' по сухой массе гриба) и выращивание гриба в течение 5 суток на специальной синтетиче- ской питательной среде до получения примерно 6 г/л биомассы клеток по. сухой массе (рис. 94).

Рис. 94. Схема получения мицелия вешенки обыкновенной для пищевых целей (периодическое культивирование): 1 — семисуточная культура Р.ови'еагив в пробир- ке на сусло-агаре, 2 — шестисуточная стационарная культура на жидкой среде в колбе с отбойниками и периодическим встряхиванием в течение 5 мин., 3 — четырехсуточная культура в колбах на качалке, 4 — дезинтеграция грибных агломератов до частиц размером 100—200 мкм, 5 — инокулят 0,4—0,5 г/л, 6 — культивирование в ферментаторе в течение 5 сут., 7—отделение конечного продукта (мицелия).

В производстве антибиотиков, наряду с периодическим куль- тивированием, все чаще начинают использовать методы, занима- ющие промежуточное положение между периодическим и непре- рывным культивированием, то есть полунепрерывный отъемно-до- ливной метод. Таким способом удается в 2-3 раза увеличить время

307

пребывания продуцента в активной фазе. Недостаток состоит в том, что доливы осуществляют питательной средой полного соста- ва. Этого недостатка лишен метод полунепрерывной регулируемой ферментации. Суть этого метода состоит в том, что в определенное время, начиная с логарифмической фазы размножения, по специ- ально разработанной программе, в культуральную жидкость до- бавляют отдельные компоненты питательной среды (раствор Саха- ров, аммония сульфат, жир и т. д.), поддерживая их концентрацию на постоянном благоприятном уровне — вначале для роста био- массы клеток, а затем — для синтеза целевого продукта.

Периодически из ферментатора отбирают определенные объ- ' емы культуральной жидкости со все возрастающей концентрацией целевого продукта. Ферментацию прекращают после того как активность продукта достигла максимума. Этим способом удается не только продлить активную фазу, в которой находится продуцент, но и повысить степень использования им субстрата, а в конечном итоге — продуктивность процесса, то есть увеличить выход конеч- ного продукта в расчете на потребленный субстрат.

Из всего разнообразия способов проведения процессов био- технологии наиболее сложными являются регулируемые фермен- тации с соблюдением условий асептики. Реализация таких процес- сов рассчитана на использование ЭВМ при соответствующем программном обеспечении. Кроме того для проведения процесса в асептичных условиях необходимо введение дополнительных стадий, обеспечивающих стерилизацию питательных сред и пода- ваемого в ферментаторы воздуха.

Стерильную питательную среду в инокуляторе — посевном аппарате первой ступени (рис. 95) засевают с соблюдением правил асептики через специальное устройство посевным материалом, который предварительно был выращен в колбах (в лаборатории)..

Технологи создают и поддерживают необходимые режимы в аппарате для размножения клеток продуцента (температуру, аэра- цию и перемешивание), а микробиологи контролируют и оцени- вают развитие культуры. При достижении требуемых стадий раз- вития и количества биомассы посевной материал передавливают стерильным сжатым воздухом по посевному коллектору в посевной аппарат большей вместимости. На этой второй ступени выращи- вания посевного материала стремятся получить больше биомассы клеток, чтобы в ферментаторе можно было создать необходимую для данного штамма продуцента исходную плотность популяции.

Рис. 95. Инокулятор: 1 — кор- пус, 2.— лаз, 3 — смотровое окно, 4 — аэратор, 5 — труба для пере- пуска посевной культуры в фер- ментатор, б — диффузор, 7 — ру- башка, 8 —.гильза для термометра, 9 — розетка аэратора, 10—12 — штуцера для манометра, гильзы •термометра и трубы для передав- ливания, 13—17 — штуцера для загрузки среды, аэратора, выхода воздуха, отбора проб и выхода во- ды, 18 — штуцер для спуска жид- кости.

Если это требование выполнимо без второй ступени, то фермен- тационную среду засевают непосредственно из инокулятора.

Биосинтез целевого продукта в ферментаторе происходит при заданных температурном режиме, аэрации, перемешивании и рН культуральной жидкости; величину рН обычно регулируют пери- одической подачей аммиачной воды через барботер ферментатора. В случае пенообразования подают стерильный пеногаситель из специального аппарата по сигналу датчика уровня Пены.

Для поддержания постоянства концентраций отдельных ком-

309

понентов питательной среды их подают в виде стерильных раство- ров по команде ЭВМ с определенной скоростью и периодичностью в ферментатор из специальных аппаратов.

Все ферментаторы цеха соединены между собой несколькими коллекторами: 1 — посевным, благодаря которому можно засевать среду в любом ферментаторе из любого посевного аппарата; 2 — коллектором подачи стерильной питательной среды; 3 — коллек- тором подвода стерильного сжатого воздуха к индивидуальным фильтрам; 4 — коллектором отработанного воздуха, выходящего из ферментатора; 5 — коллектором перекачивания культуральной жидкости из ферментатора (рис. 96).

Рис. 96. Агшаратурно -технологическое оформление процесса ферментации в производстве пенициллина: 1 — сборник нативного раствора, 2, 3, 7, 11, 13, 15, 16 — эмульгаторы, 4 — сборник серной кислоты, 5 — сборник бутилацетата, 6, 9, 12,' 14,17 — экстракторы-сепараторы, 8 •— сборник обессоленной воды, 10 — сборник I бутилацетатного экстракта, 18—сборник бикарбонатного раствора, 19—аппарат для вымораживания и обработки углем, 20, 24, 25, 28 — фильтры, 21 — реактор для получения калиевой соли бензилпенициллина, 22 — сборник раствора калия карбоната, 23 — сборник раствора калия ацетата, 26 — вакуум-выпарной аппарат, 27 — теплообменник, 29 — сборник бутанола.

В случаях проведения ферментации заведомо в нестерильных условиях питательную среду и воздух для аэрации не стерилизуют, но посевной материал всегда выращивают на стерильных пита- тельных средах в асептических условиях.

7.2.1. Приготовление и стерилизаций питательных сред. В статьях расходов в производстве продуктов микробного синтеза одно из первых мест занимает сырье. При производстве 1 • 10⁹. ЕД

пенициллина, например, необходимо израсходовать 6,7 кг сырья.

Для проведения ферментационных процессов, наряду с очень дорогим пищевым сырьем, таким как мука кукурузная, соевая, пшеничная, крахмал, пищевой сахар, глюкоза, лактоза, раститель- ные масла, лярд, применяют и значительно более дешевые, явля- ющиеся отходами пищевой промышленности — гидрол, меласса, зеленая патока, молочная сыворотка, кукурузный экстракт, рыб- но-костная мука, гидролизаты кукурузных кочерыжек, соломы, подсолнечной мезги, а также специально получаемые продукты — гидролизаты древесины и торфа, парафины нефти, метан, этанол и др.

Жидкие компоненты питательных сред (кукурузный экстракт, зеленую патоку, мелассу, гидрол, растительные масла, рыбий жир) доставляют в железнодорожных цистернах и хранят в специальных сборниках на складах заводов и транспортируют по коммуника- циям с помощью вакуума, сжатого воздуха или перекачивают насосами. Дозировку жидких компонентов осуществляют по массе или по объему в соответствии с прописью среды и контрольными показателями каждой партии этого нестандартного вида сырья.

Сыпучие компоненты сред из транспортной тары забирают или в специальные бункеры или хранят на складах в исходной упаков- ке. Для транспортировки сыпучих компонентов используют лен- точные и винтовые конвейры, элеваторы, пневматический транс- порт.

Процесс приготовления питательных сред независимо от того, сложен он технологически или прост, всегда очень ответственен, так как от качества питательной среды во многом зависит результат проведения ферментации.

Жидкие питательные среды приготовляют в аппаратах-смеси- телях с мешалкой, куда загружают отдельные компоненты в опре- деленной последовательности, установленной по регламенту (рис. 97).

Приготовление сложных комплексных сред, в состав которых, кроме минеральных компонентов и Сахаров, входит мука, крахмал, кукурузный экстракт, проводят в нескольких смесителях. Куку- рузный экстракт обычно кипятят с мелом для нейтрализации содержащихся в нем аминокислот и органических кислот. Муку, крахмал предварительно заваривают и тщательно перемешивают, чтобы не допустить образования крупных комков, которые могут быть причиной нестерильных операций, поэтому реакторы должны быть снабжены барботерами для подачи пара.

311

Часто для снижения вязкости питательной среды, содержащей достаточно большую концентрацию кукурузной муки или крахма- ла, проводят их частичный гидролиз амилолитическим ферментом — оризином (продуцент — АзрегдШив огугае) с последующей его инактивацией нагреванием. Иногда необходимость проведения такой операции обусловлена физиологией продуцента, для кото- рого предназначается среда.

В связи с тем, что в большинстве своем питательные среды имеют жидкую и твердую фазы, возникает необходимость тонкого измельчения твердых компонентов — отрубей, муки грубого по- мола, рыбно-костной муки, соевого жмыха. В этих целях с большой эффективностью используют роторно-ггульсационный аппарат, или РПА, через который пропускают суспензию компонента перед завариванием или после него. Благодаря этой процедуре не только избавляются от комков, образовавшихся при заваривании, но и повышают степень использования сырья, равно как и получают возможность применять отдельные виды сырья (например, среды с рыбно-костной мукой, плохо подд^аюЩи^еся стерилизации из-за большого количества рыбьих глаз).

Растворы Сахаров, нуждающиеся в более щадящих режимах стерилизации, рекомендуют готовить и стерилизовать отдельно, смешивая с основной средой только в ферментаторе.

Некоторые виды сырья, например, соевая мука, вызывают повышенное вспенивание среды, поэтому для снижения пенооб- разования при стерилизации в такие среды добавляют жир в качестве пеногасителя. Подобная мера вызвана технологической необходимостью, в принципе, добавление жира в среду повышает устойчивость спор к тепловому воздействию и поэтому крайне нежелательно. Все жировые компоненты сред необходимо стери- лизовать отдельно. Для этого, как правило, предварительно готовят водно-масляную или водно-жировую эмульсию с хозяйственным мылом, повышающим ее стойкость.

Качество используемой воды зависит от назначения питатель- ной среды. Чаще всего применяют артезианскую, реже — водо- проводную воду. В крупнотоннажных производствах кормовых дрожжей и белкововитаминных концентратов (БВК) используют воду, полученную по замкнутому циклу этого производства, то есть прошедшую очистные сооружения. В производстве кровезамени- телей используют только апирогенную воду (бидистиллят).

Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воз- действия, обеспечивающий удаление из них микробов — конта-

313

минантов или разрушение последних. Наиболее распространен- ным и универсальным среди возможных методов, вызывающих деструкцию микроорганизмов, является метод, основанный на использовании влажного тепла. Характерной особенностью, отли- чающей действие влажного тепла на микроорганизмы и химиче- ские вещества, является высокая энергия активации р, которая характерна для микробов (таблица 35).

Таблица 35. Значение энергии активации бактериальных спор и некоторых витаминов

Объект	Энергия активизации р., Дж/моль
ВассШиз киЫШв -" - 8(еаго1ЬегторЫ1иа С1св(хкиит ЪоиШпит Тиамин гидрохлорид Фолиевая кислота	318440 266903 343580 92180 70392

По разнице значений энергии активации можно говорить о том, что одинаковое приращение температуры оказывает разное влияние на гибель спор и термическую деструкцию химических соединений. Как видно из таблицы 35, споры палочки ботулизма наиболее чувствительны к воздействию влажного тепла, а фолие- вая кислота меньше подвержена деструкции по сравнению с тиамином. На практике главная цель стерилизации — достижение стерильности, но сохранение качества питательной среды также имеет важное значение, так как непосредственно от этого будет зависеть результат процесса ферментации. Благодаря различиям в энергии активации отмирание термостойких спор при высоких температурах происходит значительно быстрее, чем скорость хи- мической реакции. Длительность экспозиции, или время вы- держки — это тот временной интервал, в пределах которого погибают микроорганизмы. Гибель последних спор в среде явля- ется случайным процессом, поэтому введено понятие "критерий стерильности" (Ы) — отношение числа операций стерилизации, в результате которых выжили по одной термостойкой споре, к общему числу проведенных операций. Для стерилизации сред принимают критерий стерильности, равный 0,01 ± 0,001. Если исходное количество спор в среде принять N0, то получим соотно- шение N/N0 — уровень стерильности или коэффициент выжива- ния, который означает, что для достижения заданного критерия

314

стерильности (например 0,01) среда должна выдерживаться при температуре стерилизации строго определенное время, чтобы "по^ пуляция" спор снизилась от исходного значения N0 до N/N0 (например, до 10"¹⁶).

Тепловую стерилизацию сред (по способу ее проведения) под- разделяют на периодическую и непрерывную. При периоди- ческом способе стерилизации процессы: нагрев, выдержка и охлаждение среды (рис. 98) протекают последовательно во време-

концептрат

Рис. 98. Установка непрерывной стерилизации питательной среды: 1 —приемник концентрата питательной среды, 2 — фильтр для отделения комков среды, 3 — насос, 4 — паровой инжектор, 5 — выдерживатель трубчатого типа, свернутый в виде плоской спирали, 6 — теплообменник.

ни в одном аппарате. Это может быть ферментатор, посевной аппарат или специальный стерилизатор. Весь объем среды нагре- вают в аппарате до заранее выбранной температуры, выдерживают при этой температуре строго определенное время и охлаждают водой, подаваемой в рубашку аппарата или змеевик. Метод отли- чается простотой и надежностью, однако имеет и свои недостатки. В частности, ухудшается качество питательной среды из-за дли- тельного воздействия высокой температуры, при этом происходит карамелизация Сахаров (образование ангидридов Сахаров), де- струкция витаминов; излишне длительный нагрев приводит не только к разрушению питательных веществ, но и к образованию в среде потенциальных ингибиторов процесса ферментации, таких как аминосахара. Второй недостаток связан с тем, что требуется повышенный расход пара за короткий период нагрева. Третий недостаток обусловлен невозможностью регенерировать тепло. Последний, четвертый, недостаток касается трудности автомати- зации процесса периодической стерилизации по сравнению с непрерывным.

концентрат

вода

При непрерывном способе стерилизации каждый элементарный процесс — нагрев, выдержка, охлаждение (рис. 99) осуществляется в специально предназначенных для этого аппара- тах: нагревателе, выдерживателе, теплообменнике, которые со-

Рис. 99. Установка непрерывной стерилизации питательной среды с рекупера- цией тепла: 1 — приемник концентрата среды, 2 — фильтр, 3 — насос, 4 — пластинчатый теплообменник-рекуператор, 5 — теплообменник-доохладитель, 6 — паровой эжектор, 7 — выдерживатель трубчатого типа, разделенный на две секции.

ставляют систему аппаратов для непрерывной стерилизации — установку непрерывной стерилизации (УНС). Непрерывная стери- лизация имеет следующие преимущества по сравнению с перио- дической:

1. при непрерывном методе стерилизации каждый элементар- ный объем среды (бесконечно малый объем, содержащий одну спору) находится при высокой температуре короткое время;

2. благодаря более высоким температурам стерилизации и короткой экспозиции деструкция компонентов питательной среды минимальна;

3. процесс стерилизации всего объема питательной среды растянут во времени, этим обеспечивается более равномерная загрузка котельной;

4) процесс легко контролируем и управляем;

5) возможна частичная регенерация тепла. Непрерывное нагревание среды может быть осуществлено без

прямого контакта с теплоносителем в трубчатом, пластинчатом или спиральном теплообменнике. Но чаще всего среда нагревается до нужной температуры в течение нескольких секунд прямым инжек-

Л 2

_^1

тированием пара в паровых контактных нагревателях. Наиболее распространены те конструкции теплового инжектора, в который подают вихревым насосом нестерильную питательную среду и пар под давлением — 0,3—0,6 МПа. Производительность нагревателей 5, 10, 15, 20, 25, 50 м³/ч стерильной среды. Подбирают нагреватель в зависимости от объема стерилизуемой среды так, чтобы время операции стерилизации всего объема среды составляло 40—120 минут. После этого среду подают в выдерживатель — проточный аппарат непрерывного действия, работающий по принципу вытес- нения вновь поступающими объемами среды предыдущих. За время прохождения через выдерживатель элементарного объема питательной среды содержащаяся в этом объеме спора погибает. Следовательно принцип работы выдерживателя может быть запи- сан в следующем виде: т выдержки = т отмирания термостойких спор = т заполнения. По конструктивным особенностям выдер- живатели подразделяют на два типа — емкостные и трубчатые. Чтобы приблизить течение жидкости в емкостном выдерживателе к поршневому, снизить скорость потока по центральной оси и уменьшить застойные зоны у корпуса, необходимо предусматри- вать специальные устройства для ввода среды, обеспечивающие равномерное распределение потока, и для вывода среды, где надо равномерно ^— собрать поток со всего сечения.

\

\±

Наиболее простым по конструкции и надежным является емкостной выдержи- ватель, вместимостью не менее 2 м³ с подачей среды сверху по трубе, опущен- ной до днища аппарата; днище при этом играет роль отбойника, разбивающего струю жидкости, а сбор стерильной сре- ды осуществляется через перфорирован- ное кольцо, расположенное в верхней части выдерживателя (рис. 100). Но в процессе работы емкостного выдержива- теля ВОЗМОЖНО возникновение пульса- Риг. 100. Выдерживатель с ций, вызывающих выбросы нестериль- перфорированным кольцом в ных объемоя спелм верхней части: 1 — труба вво-

ных ооъемов среды. _{да нестерильной сре}ды, 2 —

Практически идеальный поршневой кольцевой коллектор вывода

поток осуществить невозможно. При ла- стерильной среды, 3 — шту- - цер слива конденсата после

минарном и турбулентном потоке сред- стерилизации системы. 4 -

НЯЯ СКОРОСТЬ ЖИДКОСТИ ЯВЛЯетСЯ фуНК- корпус аппарата.

цией распределения скоростей отдельных объемов -жидкости по сечению потока. Средняя скорость ламинарного потока вязкой жидкости в трубе составляет 50% максимальной скорости по оси трубы, а турбулентного — 82%. Степень отклонения от поршневого течения может быть выражена безразмерным критерием Пекле (Ре):

Ре = , где УУср — средняя скорость потока, 1 - длина

трубы, Ль — коэффициент продольного перемешивания. Для иде- ального течения в поршневом режиме критерий Ре равен беско- нечности, а при полном смешении — нулю.

Расчетными данными показано, что из различных по длине и диаметру трубчатых выдерживателей, дающих один и тот же уровень стерильности, экономически наивыгоднейшим является тот, который характеризуется потоком с критерием Ре = 50. Такие трубчатые выдерживатели получили название оптимальных.

Трубчатые выдерживатели большого диаметра и длины разде- ляют на секции и укрепляют вертикально как колонные аппараты. Выдерживатели с диаметром трубы 150—200 мм сворачивают в виде объемной или плоской спирали и устанавливают над нагре- вателем. Все выдерживатели должны быть покрыты слоем изоля- ции для предотвращения теплопотерь.

При высокой температуре среда находится в выдерживателе строго определенное расчетное время, а затем ее необходимо очень быстро охладить до температуры ферментации, иначе в среде пойдут деструктивные процессы. Теплообменник, в котором воз- можен подобный процесс, должен обладать не только высокими теплообменными характеристиками, но и конструктивным совер- шенством, обеспечивающим поддержание среды в стерильном виде, следовательно, он должен быть герметичен.

Наиболее широкое распространение в нашей стране получили теплообменники типа "труба в трубе", тогда как за рубежом применяют более эффективные пластинчатые и спиральные теп- лообменники. Использование пластинчатых теплообменников ог- раничивается невозможностью их применения для охлаждения вязких сред, содержащих твердую фазу.

В настоящее время наиболее часто используют УНС, схема которой представлена на рис. 98. Но в такой схеме не реализуется одно из преимуществ непрерывного способа стерилизации — возможность рекуперации тепла.

До 70% тепла можно вернуть, если дополнительно установить

318

теплообменник —рекуператор, в котором стерильная среда, про- шедшая через выдерживатель и имеющая температуру 130—140°С, нагревает нестерильную питательную среду до 115—125°С, а затем доохлаждается в теплообменнике-доохладителе до температуры ферментации (см. рис. 99). При этом сокращается расход пара на нагрев нестерильной среды до температуры стерилизации и расход воды на охлаждение стерильной среды.

Все аппараты УНС выполняют из нержавеющей стали, а наи- более надежной арматурой является сильфонная нержавеющая. Перед началом операции стерилизации всю систему УНС стери- лизуют водяным паром, после чего стерилизуют концентрат пита- тельной среды. Для удаления остатков среды из системы и для разбавления концентрата через УНС пропускают воду. Перед отключением УНС ее вновь стерилизуют.

Сыпучие среды, используемые в настоящее время для получе- ния ферментов поверхностным методом и кормовых добавок, стерилизуют паром, инфракрасными лучами, а также используют другие губительные факторы. Компонентами таких сред являются отруби, биошрот, свекловичный жом, древесные опилки, солома. Компоненты предварительно тщательно измельчают и смешивают в оптимальных соотношениях.

В промышленности наиболее широко применяют обработку сред глухим и острым паром, которую условно можно назвать стерилизацией. В действительности деструкция спор происходит только на поверхности твердых комков среды. Споры, находящи- еся в глубине комка, могут выжить. Уровень стерильности таких сред относительно невысок, но достаточен для проведения фер- ментации на твердой сыпучей среде.

7.2.2. Подготовка стерильного сжатого воздуха и очистка отработанного воздуха. Одной из важных задач биотехнологии является получение большого количества стерильного воздуха. В наибольших масштабах стерильный воздух применяется в процес- сах ферментации для аэрации. Его также используют для венти- ляции участков цехов так называемой стерильной зоны, где в асептических условиях проводят, например, последние стадии очистки готового продукта. В атмосферном воздухе, наряду с инертными газами, азотом, кислородом, диоксидом углерода, со- держатся пары воды и мелкодисперсные частицы. Более 30% массы частицы имеют размер 1—2 мкм и около 50% — меньше 0,5 мкм. В состав дисперсных частиц, наряду с частицами пыли, копоти, входят клетки и споры микроорганизмов как в свободном, так и в

319

сорбированном на пылевых частицах виде. Результаты анализа технологического воздуха на содержание микробов-контаминан- тов представлены в таблице 36.

Таблица 36. Типы микробов и частота их обнаружения в технологическом воздухе

Микробы	Размеры клеток микробов, мкм	Частота обнаружения, %
Актиномицеты Кокки Палочки Плесневые грибы Споры бацилл	0,8 - 1,2 (диаметр клеток) 0,47 - 1,7 0,77 - 0,98 х 2,0 - 5.8 0,8 - 12,0 (диаметр нитей) 0,55 - 1,2 х 2,3 - 7,1	4,5 33,5 22,5 8,1 18,7

Температура и влажность наружного воздуха, количество в нем пылинок и микроорганизмов непостоянны и зависят от времени года (микроорганизмов летом в 10 раз больше, чем зимой), погод- ных условий — наибольшее количество пыли и, соответственно, микроорганизмов приходится на сухую ветреную погоду, геогра- фического расположения предприятия, высоты забора воздуха и т. д. Особенно много микробов у поверхности земли, с высотой концентрация их убывает и становится постоянной на уровне около 30 м над землей.

7.2.2.1. Способы очистки воздуха. Очистку воздуха можно осуществить принципиально разными методами, основанными либо на уничтожении микроорганизмов, либо на удалении их. Одним из самых эффективных способов стерилизации воздуха является облучение ультрафиолетовыми лучами. Этот метод ис- пользуется для обеззараживания воздуха в боксах.

Отечественным и зарубежным опытом показано, что техноло- гически и экономически оправданным в промышленности является способ очистки воздуха с помощью волокнистых, и пористых материалов. Таким путем удается получить воздух со степенью чистоты 99,9999%. Взвешенные в воздухе частицы задерживаются волокнистым материалом благодаря инерционному и диффузион- ному механизмам осаждения. В общих чертах механизм инерци- онного осаждения основан на том, что когда воздушный поток начинает обтекать нить волокна на своем пути, взвешенные в этом потоке частицы движутся по инерции, отклоня ются от потока воздуха и осаждаются на волокне. Эффект инерционного осажде- ния высок на сравнительно грубых волокнах для относительно крупных частиц и высоких скоростей воздуха. Малые частицы

320

способны к броуновскому движению. Движущиеся вблизи волокна частицы диффундируют в случайных направлениях и могут задер- живаться на поверхности волокон. Этот эффект осаждения увели- чивается с уменьшением диаметра волокна фильтрующего мате- риала, диаметра частицы и скорости воздуха.

Качество фильтрующего материала характеризуется коэффи- циентом осаждения (Ъ):

С_^^о-СN _

п = —-= , где Са/₀ — начальная концен-

трация микробов в воздухе до фильтра, может быть принята из расчета максимального содержания 5000 клеток в 1 м³; СN = 0,001 — конечная концентрация микробов в воздухе после фильтра, выбранная, исходя из вероятности проскока одной клетки на 1000 операций. Фильтрующий материал тем лучше, чем выше коэффи- циент осаждения.

Качество аэрозольных фильтров для очистки воздуха характе- ризуется коэффициентом -проскока (Кпр):

Чем меньше Кпр, тем качество фильтра выше.

7.2.2.2. Характеристика фильтрующих материалов, применяе- мых в промышленности для стерилизации воздуха. Поскольку отдельные механизмы осаждения имеют различную природу и обычно один из них преобладает над другим, необходимо приме- нять фильтрующий материал различной структуры для полноцен- ной очистки воздуха. Так называемые головные фильтры заполня- ют более грубым волокном, на этих фильтрах удаляется около 98% микробов-контаминантов, а следующую ступень — индивидуаль- ные фильтры заправляют супертонким волокном или мембранами. На этой последней ступени удаляют остальные 2% контаминантов.

Кроме высокой пылеемкости фильтрующие волокна должны обладать еще одним свойством —- работать при малых перепадах давления так, чтобы их разность до и после фильтра были как можно меньше.

В головных фильтрах для грубой очистки используют следую- щие фильтрующие материалы:

а) грубое базальтовое волокно ВРВ (вертикальный раздув воз- духом) с диаметром волокна 16 мкм и 26 мкм, толщина слоя 1000 мм; волокно обладает высокой паростойкостью, не теряет своих свойств при нагревании до 1100°С, отличается механической проч- ностью и высокой пылеемкостыо; 11т. 8524 321

б) высокообъемный нетканый фильтрующий материал (ВНФМ), или ткань Каминской с диаметром волокна 16,9 мкм, выпускают в виде слоев (матов) толщиной 20—23 мм; особенностью этого материала является то, что в прядильный раствор при его изготовлении вводят антисептик гексахлорофен, поэтому фильтры, заполненные такой тканью, не подвергают стерилизации;

в) стеклосрезы с диаметром волокна 6 мкм, толщиной слоя 600 мм, термостойкость 300°С.

В индивидуальных фильтрах для тонкой очистки воздуха ис- пользуют фильтры Петрянова (ФП) с тканью Петрянова, состоя- щую из ультратонких полимерных волокон, сформированных в виде ткани на.марлевой подложке. В настоящее время изготавли- вают много видов ФП. Так ФПП из перхлорвинила и фторполиме- ров обладают устойчивостью к кислотам и щелочам. ФПП из полиакрилонитрила стойкие к органическим растворителям. Но эти ФПП выдерживают температуру только до 60°С и поэтому их стерилизуют формалином с последующей нейтрализацией амми- аком. В последние годы разработаны ФП, стойкие к высоким температурам. ФПАР (полиакрилатные) и ФПФС (полифторстиро- ловые) выдерживают температуру до 250—270°С; их стерилизуют острым паром.

Базальтовое суперволокно (БСТВ) диаметром 1,0—1,5 мкм вы- пускают в виде матов толщиной 30—40 мм. Недостатком этих волокон является небольшая механическая прочность. Этого недо- статка лишены базальтовые бумаги и картон, разработанные Ук- раинским НИИ бумаги. Базальтовые картон и бумаги имеют, кроме того, высокие коэффициенты осаждения, что позволяет уменьшить габариты фильтров. В 1989 г. Украинский НИИ химического машиностроения (НИИХИММАШ) и Пензенский филиал Всерос- сийского НИИ антибиотиков (ВНИИА) разработали конструкции фильтров с гофрированными элементами из базальтовой бумаги ФГ-5 и ФГ-160 производительностью 5 и 160 м³/мин.

В последние годы для тонкой очистки воздуха используют жесткие пористые перегородки из пластмасс и металлокерамики. Преимуществом этих материалов по сравнению с волокнистыми является стабильность структуры, устойчивость к повышенным температурам, простота конструктивного оформения, легкость обслуживания фильтров. Существенный недостаток — высокий перепад давления.

Наибольшее применение находят фильтрующие материалы из фторопласта и металлокерамики в виде втулок ФЭП — фильтру- ющий элемент патронного типа (таблица 37).

Т а б л и ц а 37. Характеристика фильтрующих элементов, применяемых в про- мышленности

Фторопластовый элемент	Размеры мм	Шощадъ,	Производи- тельность, м^3/ч	Срок службы, мес.
ФЭП-46 ФЭП-120	46x38x110 120x96x170	0,015 0,06	60 230	10-11 10-11

Для стерилизации воздуха рекомендуют также мембраны с диаметром пор 0,45 мкм. • Пористость мембран достигает 80%. Удаление микроорганизмов с помощью мембраны основано на ситовом эффекте. В основном фильтрующие мембраны поставляет фирма "Миллипор" (США), в нашей стране (г. Владимир) налажен выпуск мембраны "Владипор". Мембранам не требуются высокие перепады давления, но для их надежной работы необходимо точное выполнение условий стерилизации. Стерилизовать мембраны можно только насыщенным водяным паром, от перегретого пара в мембранах появляются трещины, и они выходят из строя.

Высокоэффективную фильтрацию воздуха (и жидкостей) обес- печивают также фильтры, изготавливаемые фирмами Ооттск Ншиег (Англия), ЭОЗ-Ое Оапвке ЗискегГаЬпкег (Дания) и др. (рис. 101а).

7.2.3. Технологическая схема сжатия и очистки воздуха. Сис- тема производства, сжатого, очищенного от микроорганизмов, воздуха, имеющего определенную температуру, является сложной технологической системой (рис. 1016).

Она состоит их трех последовательно соединенных подсистем: очистки- от пыли и сжатия; приведения воздуха к термодинамиче- скому состоянию, благоприятному по влажности и температуре для разделения аэрозоля; разделение аэрозоля в фильтрах грубой и тонкой очистки.

Первая подсистема. Атмосферный воздух забирают турбоком- прессором через заборную шахту высотой 20—30 м, где концент- рация микроорганизмов стабилизирована. Прежде всего воздух попадает в предфильтры, где он освобождается от грубого аэрозоля — пыли. Предфильтры не только предохраняют компрессоры от

323

Рис. 101а, рис. 1016. Фильтр тонкой очистки воздуха в разрезе (а), схема очистки воздуха в масляном циклофильтре (б): 1 - циклофильтр, 2 - ванна с маслом. 3 - отбойный козырек, 4 - направляющий короб.

загрязнения, но и существенно снижают количество контаминан- тов, которые могли бы попасть во 2-ю подсистему.

За рубежом в настоящее время в предфильтрах применяют рулонные пористые материалы. В нашей стране успешно испытан пенополиуретан, который обеспыливается пылесосом или теплой водой с мылом. Срок службы материала 1,5—2 года. Однако до сих пор на большинстве заводов используют масляные фильтры (см. рис. 1016). После этого воздух сжимают в турбокомпрессоре до 0,35—0,5 МПа. Давление сжатия воздуха в компрессоре определя- ют из расчета давления на преодоление сопротивления в системе воздухоподготовки, давления столба жидкости в ферментаторе и создания в нем давления 0,13—0,14 МПа. Сжатие воздуха в комп- рессоре приводит к повышению его температуры до 120^250°С и увеличению влагос одержания в единице объема.

Вторая подсистема. В случае высокого содержания влаги в исходном атмосферном воздухе конденсируется еще большее ко- личество влаги при его охлаждении. Выпадение влаги на фильтрах

324

недопустимо, так как это приводит к слипанию волокон и образо- ванию каналов, и тогда эффекты, осаждения частиц на волокне не проявляются. Кроме того, на увлажненных волокнах фильтров возможно размножение осевших микроорганизмов, что приводит к дополнительному обсеменению воздуха;

Чтобы обеспечить выпадение влаги в каплёуловителе, воздух "переохлаждают" до температуры 25-40°С в теплообменном аппа- рате. Затем, для обеспечения надежной работы фильтров 2-й и 3-й ступеней, воздух нагревают до температуры 70—90°С. При таких температурах исключается конденсация паров воды на волокнах фильтра. С этой целью воздух после брызгоуловителя подогревают в теплообменнике, при этом допускается частичное подмешивание горячего воздуха после компрессора. Количество подмешиваемого воздуха определяется условиями относительной влажности, кото- рая не должна быть больше 40%.

Третья подсистема состоит из двух фильтров второй и третьей ступеней очистки. Фильтр второй ступени, или головной фильтр обычно расположен на территории завода рядом с цехом. На головном фильтре очищают воздух для всех ферментаторов цеха. Из головного фильтра воздух по коллектору подается в индивиду- альные фильтры третьей ступени, установленные у каждого фер- ментатора, независимо от его вместимости.

Конструкция индивидуального фильтра зависит от типа исполь- зуемого фильтрующего материала. Для ткани Петрянова применя- ют конструкцию, представленную на рис. 102а. В цилиндрический корпус монтируют прямоугольный пакет, собранный из П-образ- ных алюминиевых рамок, между которыми зажимается лента из ткани Петрянова.

Для фильтрующего материала, уложенного в виде матов, ис- пользуют конструкцию, представленную на рис. 102(6), а на рис. 102(в) изображена конструкция, предназначенная для установки фторопластовых фильтрующих элементов.

При эксплуатации фильтров необходима их стерилизация. Наиболее эффективным методом является нагревание влажным паром и выдержка в течение определенного времени при темпе- ратуре 125—130°С. Применение более высокой температуры вы- зывает деструкцию герметизирующих прокладок в фильтрах. По- сле стерилизации фильтрующий материал высушивают горячим воздухом.

В зарубежных системах очистки воздуха значительно повыше- на надежность работы за счет установки дополнительной ступени очистки и дублирования основного оборудования. Кроме того, для крупных ферментаторов применяют автономные системы очистки воздуха, что облегчает задачу поддержания термодинамического режима, так как не требуется большой протяженности трубопро- водов; наконец, в фильтрах используют стандартные фильтрующие элементы, изготовленные промышленным способом.

7.2.4. Очистка отработанного воздуха. В процессе фермента- ции в качестве отхода производства образуется большое количе- ство отработанного воздуха, выбрасываемого в атмосферу. Уста- новлено, что такой воздух на заводах антибиотиков содержит от 2 до 4 мг/м³ веществ с неприятным запахом.

С отработанным воздухом выбрасывается в атмосферу несколь- ко десятков органических соединений: амины, альдегиды, жирные

326

кислоты, кетоны, спирты, эфиры и т. д. Относительная влажность воздуха, выходящего из ферментатора, приближается к 100%; кроме того он включает культуральную жидкость в виде мелких брызг, а содержание клеток продуцента зависит от вида его, времени ферментации, и составляет от 1 • 10³ до 1 • 10⁵ клеток в 1 м³.

В настоящее время применяют несколько принципиально раз- личающихся методов очистки отработанного воздуха. Метод ката- литического дожигания относится к разряду энергоемких. Суть его состоит в том, что отработанный воздух прокачивают при темпе- ратуре 320-350°С через комбинированный катализатор, состоящий из слоя пиролюзита и слоя палладиевого катализатора. Степень обезвреживания воздуха 87—98,5%.

Менее энергоемким является метод жидкофазного окисления с применением в качестве окислителей перманганата калия или гипохлорита натрия. Отработанный воздух по мере прохождения скруббера орошается раствором натрия гипохлорита, 20% раство- ром едкого натра, водой и выбрасывается в атмосферу. Орошаю- щие растворы обращаются в замкнутом цикле. Смену отработан- ных растворов проводят 1 раз в неделю. Эффективность очистки 90—95%. Недостатком метода является то, что при его реализации накапливаются в небольшом количестве сточные воды, которые нужно утилизировать. Такие установки успешно работают, напри- мер, в Италии в производстве пенициллина, цефалоспорина С и других антибиотиков.

Известен также метод с применением сетчатых фильтров (ФС); конструкция ФС разработана во ВНИ проектно-конструкторском институте прикладной биохимии. Фильтр состоит из цилиндриче- ского корпуса с крышкой и днищем, внутри помещен фильтрую- щий элемент, изготовленный из металлических сеток трикотажно- го плетения с диаметром проволоки 0,28 мм из нержавеющей стали (рис. 103).

Воздух, проходя через фильтр, освобождается от капелек куль- туральной жидкости с микроорганизмами. Эффективность очист- ки 99,6%. Для повышения эффективности очистки на ряде заводов осуществлена схема, состоящая из циклона и сетчатого фильтра "Ц-ФС". Эффективность этой системы составляет 99,97%.

Рис. 103. Схема сетчатого фильтра для очистки отработанного воздуха: 1 — крышка, 2 — корпус, 3 — фильтрующий элемент.

7.3. Тепловые процессы в ферментаторах. Интерес к проблемам выделения тепла в процессе ферментации связан, прежде всего, с необходимостью его отведения охлаждающей водой, а также с возможностью использования интенсивности тепловыделения в качестве индикатора метаболической деятельности продуцента. Около 40—50% всего тепла, выделяющегося в процессе фермента- ции, приходится на тепло, образующееся в результате жизнедея- тельности продуцента и, прежде всего, за счет энергетического обмена. Накопленные макроэргические структуры (преимущест- венно — АТФ) расходуются в реакциях биосинтеза. Так, напри- мер, на образование одной эфирной связи в молекуле какого- либо метаболита требуется 12570 Дж. При этом в реакции: АТФ-»АДФ+50280Дж из одной молекулы АТФ высвобождается столько энергии, что большая часть ее (37710 Дж) превращается в тепло. Это тепло выделяется неравномерно — с максимумом, приходящимся на период максимальной интенсивности дыхания и наивысшей скорости потребления углеводов в период активного размножения клеток (рис. 104).

даооо

"*25000 ^^ис" Соотношение скорости

потребления углевода, интенсивно- Шщоо с™ дыхания и тепловыделения: 1 — накопление антибиотика, 2 — выде- | «ООО ление диоксида углерода, 3 — тепло биосинтеза, А — потребление углево- дов.

Тепло также образуется в результате работы мешалки, переме- шивающей культуральную жидкость — "тепло перемешивания" (ОперемО-

Оперем- = Иг'Тф'ЗбОО, (Дж), где И_г(Вт) — мощность, затрачи- ваемая на перемешивание газожидкостной смеси, Хф (час) — время ферментации.

Тепловой эффект перемешивания при одном и том же числе • оборотов мешалки будет тем выше, чем больше вязкость культу- ральной жидкости. Поэтому в процессе ферментации, по мере накопления биомассы, тепловой эффект перемешивания возраста- ет, если не уменьшать интенсивность перемешивания, снижая число оборотов мешалки.

Третий источник тепла —хорячий стерильный воздух, .подава- емый в ферментатор для аэробных организмов; при барботаже он мгновенно •охлаждается культуральной жидкостью и отдает при- внесенное тепло (Овозд-): Овозд- = Увозд. • Рвозд. • Своза- (*возд- 1ф), где Увозд., рвозд., Своза-, чюзд. •— соответственно объем, плотность, теплоемкость и температура подаваемого воздуха, 1ф — темпера- тура, при которой проводят ферментацию.

Чаще всего воздух расходуют в процессе ферментации ступен- чато, с максимумом, приходящимся на период лагарифмической фазы размножения, например одноклеточных микроорганизмов; к концу, ферментации расход воздуха снова снижают. Следова- тельно, количество тепла, привносимое с воздухом, различно в разные периоды ферментации.

В процессе ферментации происходит унос влаги из аппарата с отработанным воздухом за счет испарения, а, следовательно, и части тепла, затраченного на этот процесс (Оисп.):

Оисп. — Швлаги. • г, где твлаги — масса испарений влаги, г (Дж/кг) — удельная теплота парообразования.

По абсолютному значению Оисп. — величина небольшая, поэтому ее колебания, пропорциональные количеству подаваемого воздуха, не оказывают заметного влияния на общее количество тепла, образующегося в процессе ферментации.

Как правило, тепловой режим в процессе ферментации поддер- живается на определенном уров- не и строго контролируется. Все образующееся тепло должно быть отведено охлаждающей водой.

В общем виде тепловой ба- ланс процесса ферментации мо- жет быть представлен следую- щим уравнением: Ож+ Оп + Овозд.—Оисп.⁼ Оохл.,

где Оохл. — тепло, отводимое ох- лаждающей водой, подаваемой в теплообменные устройства; Оохл- = Шводы * Своды (12—11), где гпводы — масса охлаждающей во- ды, Своды — теплоемкость ох- лаждающей воды, и и 1г — тем- пература воды соответственно на входе и выходе из теплоотводя- щих устройств.

Для поддержания теплового ре- жима в ферментаторе в настоя- щее время чаще всего используют артезианскую воду 12—15°С или смесь артезианской и оборотной воды 15—16°С; отработанная вода, выходящая из теплообменных ус- тройств с температурой 18—20°С, в этом случае поступает в линию оборотной воды и может быть ис- пользована в качестве охлаждаю- щего агента в тепловых процессах с высокими температурными ре- жимами (рис. 105). 330

Наиболее эффективно использование так называемой "захоло- женной" воды (Ю°С), получаемой для цеха ферментации на спе- циальных установках. В теплоотводящих устройствах ферментато- ра она нагревается до 15—16°С и по коллектору возвращается на станцию получения "захоложенной" воды.

Таким образом, применительно к тепловым процессам, проис- ходящим в ферментаторе, можно сказать, что все они (тепловой эффект жизнедеятельности, перемешивания, тепло, привносимое воздухом, тепло испарения, теплопередача при охлаждении водой) протекают одновременно с разной интенсивностью и динамично- стью, отсюда понятны высокие требования к конструктивным характеристикам теплообменных устройств.

7.4. Аппаратурное оформление процессов выделения и очист- ки некоторых продуктов микробного синтеза. Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, непотреблен- ные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира, пузырьки воздуха, как правило, мел. В свою очередь водная фаза культуральной жидкости (нативный раствор) включает большое число органических и неорганических веществ, коллоидных фрак^: ций белков, сухой остаток культуральной жидкости — до 17% и более; содержание биомассы в культуральной жидкости достигает 8—10%. Концентрация целевого продукта чаще всего не превышает 1.5%, что составляет менее 10% сухого остатка.

В зависимости от целевого назначения конечного продукта (для здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и т. д.) реализуют различной степени сложности схемы производства, при этом учитывают и место накопления целевого продукта — внут- риклеточно или внеклеточно.

Если способы выделения целевых продуктов можно разделить на несколько типовых групп (рис. 106), то очистка каждого из них практически индивидуальна, поскольку зависит от физико-хими- ческих свойств конкретного вещества.

Примером наиболее простой схемы может служить производ- ство биовита, базирующегося на использовании продуцента анти- биотика хлортетрациклина. Кальциевый комплекс хлортетрацик- лина осажадают из культуральной жидкости при рН выше 7,0. Формирующийся при этом осадок увлекает с собой и клетки продуцента. Так в осадке вместе с биомассой оказываются внекле- точный антибиотик и внутриклеточный витамин В12. Осадок филь-

331

труют, высушивают, размельчают, добавляют отруби в качестве наполнителя и фасуют. Этот комплекс используют в качестве Добавки к корму для скота. ..

Кулътуральиая жидкость

Предварительная обработка

I

1ТИВПЫИ

раствор

| _ Фильтрация

Биомасса

(отходы 1о5 произвол- Г ства) , 1

| Экстракция |

фракционирование |

Ионный об Ш

|Оацкден1

Рис. 106. Возможные способы выделения целевого продукта.

Если целевым продуктом является биомасса клеток, например, кормовые или пекарские дрожжи, необходимо их концентрирова- ние (сгущение). При этом широко применяют флотацию, с по- . мощью которой увеличивают концентрацию дрожжей в 4—6 раз. Основной движущей силой флотации являются всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы дрожжи. Процесс проводят в специально предназначенных для этой цели .емкостных аппаратах — флотаторах, в которые нагне- тают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят в специальной части аппарата с помощью пеногасителя и выводят сконцентрированную суспензию дрожжей.

Для последующего концентрирования дрожжей широко приме- няют сепарирование, например, с помощью сепаратора—сгусти- теля, непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501 К-3. Для сгущения суспензии дрожжей от 20—30 г/л до 550—600 г/л необходимо последовательное сепарирование в 2—3 ступени.

Методы извлечения целевых продуктов из клеток зависят от свойств изолируемых веществ. Полиеновые антибиотики, напри- мер, экстрагируют органическими растворителями из нативных клеток, тогда как эндоферменты получают из разрушенных (дез-

332

интегрированных) клеток. На рис. 107 представлена схема процес- са выделения Ь-аспарагиназы. Клетки отделяют на дисковой цен- трифуге (позиция 4), позволяющей концентрировать от 6 г/л до 120 г/л по массе сухих веществ. Разрушение клеток проводят в. гомогенизаторе (позиция 5) при двукратном пропускании высво- бождается до 97% фермента. От остатков клеток освобождаются после добавления этанола (позиция 9) до 30% концентрации с последующей фильтрацией на ротационном фильтре (позиция 10). Затем фермент осаждают метанолом при его концентрации в. маточнике 50% (позиция 11), фильтруют (позиция 12).-.растворяют в воде и переосаждают (позиция 13) при концентрации метанола 60%. Осадок центрифугируют (позиция 12), снова растворяют в воде (позиция .14) и концентрируют ультрафильтрацией (позиция 16), затем выделяют с помощью*еефадексаДЕАЕ-А50 (позиция 19), осажадют этанолом (0,6 объема) прирН 5,0 (позиция 27) й собирают в корзинчатой центрифуге (позиция 28). Осадок еще раз раство- ряют.в воде (позиция 29), стерилизуют фильтрацией через мемб- рану [позиция 30), разливают (позиция 32) и подвергают сублима- ционной сушке (позиция 34).

_[к

_1к

32 34

Выделение большей части продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости начинают при их содержании около 1,5%. Чтобы иметь возможность выделить вещество, используя осажде- ние, кристаллизацию или высушивание, необходимо оперировать с растворами, содержащими 15—20% целевого продукта. Вот по- чему приходится применять разномасштабное оборудование по ходу процесса: вначале необходимы емкости в несколько десятков м³, высокопроизводительное оборудование непрерывного или по- лунепрерывного действия, а завершают процесс небольшими ап- паратами вместимостью порядка нескольких сотен и даже десятков литров с периодической загрузкой и выгрузкой, или лабораторное оборудование.

Технологические показатели фильтрации культуральных жид- костей определяются свойствами их как дисперсных систем. Клет- ки микробов-продуцентов, например, грибов чаще всего образуют микроколонии различной плотности размером 16—600 мкм. Филь- трационные свойства жидкости обусловлены размерами отдель- ных гиф, типом микроколоний, характером роста мицелия. Эти факторы зависят от вида и штамма биообъекта, условий его культивирования.

Пенициллы и аспергиллы образуют легко фильтруемую био- массу, поэтому для получения нативного раствора в этом случае применяют барабанные вакуум-фильтры — аппарат непрерывного действия с фильтрующим основанием, расположенным на наруж- ной цилиндрической поверхности горизонтального вращающегося барабана, частично погруженного в суспензию.

Культуральные жидкости после ферментации проактиномице- тов представляют собой густые суспензии с относительной вязко- стью 50—1000 и с высоким содержанием твердой фазы. Они практически не расслаиваются при стоянии. Характерной особен- ностью и других бактериальных суспензий является изменчивость их фильтрационных свойств как во времени, так и от одной операции до другой.

Необходимо также отметить, что образуемые осадки заметно сжимаемы (показатель сжимаемости 0,9), значит процесс фильт- рации не может быть интенсифицирован повышением разности давления из-за соответственно возрастающего удельного сопро- тивления осадка. Такие суспензии без предварительной обработки культуральной жидкости отфильтровать практически невозможно. Предварительную обработку культуральной жидкости проводят с целью максимального перевода конечного продукта в ту фазу, из

334

которой предполагают его выделить, а также для коагуляции коллоидных примесей и, следовательно, улучшения процесса филь- трации, для удаления или связывания в растворимые комплексы тех побочных веществ, которые затрудняют последующий процесс химической очистки. К тому же при коагуляции изменяется струк- тура твердой фазы культуральной жидкости.

Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кис- лотами, термической обработкой, добавлением веществ, образую- щих наполнители. Например, при добавлении к культуральной жидкости раствора жидкого стекла (ЫагЗЮзКи натрия моногидро- фрсфата, в результате взаимодействия с ионами кальция, находя- щимися в культуральной жидкости, образуется осадок наполните- лей:

Са⁺⁺ + Ка25Юз->Са51СЫ- + 2Ка⁺ Са⁺⁺ + ^2НР04->СаНР0₄4 + 2Ма⁺

Процесс образования хлопьевидного осадка наполнителя про- текает с большой скоростью, осадок захватывает гифы мицелия и молекулы белка.

Процесс коагуляции улучшается при использовании комбини- рованных методов таких, как кислотная и тепловая, электролитная и тепловая коагуляции.

Эффективным методом коагуляции дисперсных систем явля- ется обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами — ф л о к к у л я н т а м и. При этом в отличие от обычной коагуляции, образуются флоккулы или осадки рыхлой структуры, что значи- тельно улучшает процесс фильтрации.

Для получения нативного раствора из труднофильтруемых культуральных жидкостей после коагуляции применяют вакуум- барабанный фильтр с намывным слоем — аппарат полунепрерыв- ного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность ба- рабана намывают дренажный слой наполнителя. В качестве напол- нителя используют суспензию порошков целлюлозы, перлита, древесной муки. Особенность работы такого фильтра (в отличие от вакуум-барабанного) состоит в том, что нож, предназначенный для съема осадка с барабана, имеет специальную микрометриче- скую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру, срезая нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа, обновляя таким образом фильтрующую поверхность; поэтому скорость фильтрации не снижается. На рис. 108 представлена схема аппаратурного оформления процесса фильтрации культу-

335

ральной жидкости на вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем.

промьшная оода А

древесная мука

2

ГТ~1

культуральная

1

_X

®ч2

Рис. 108. Схема аппаратурного оформления процесса фильтрации на вакуум- барабанном фильтре с намывным слоем: Г — аппарат для суспензии вспомогатель- ного материала, 2, 4, 7 — насосы, 3 — коагулятор, 5 — вакуум-барабанный фильтр с намывным слоем, 6 — ресивер. _

Названный выше перлит представляет собой стекловидную горную породу вулканического происхождения, в состав его входят окислы кремния, калия и кальция. Для получения вспомогательного .вещества природный перлит нагревают до начала плавления (1000°С). Образуются небольшие бусинки неправильной формы, состоящие из очень большого числа полых ячеек. Для получения вспомогательного фильтрующего материала бусинки измельчают- ся. Получают порошок с пористостью 85—90% и объемной массой 500—1000 кг/м³.

Экстракционный метод выделения целевого вещества из на- тивного раствора основан на различной растворимости разных химических форм этого вещества в воде и органическом раство- рителе, не смешивающимся с водой. Основной закон экстракции

— закон распределения Нернста: К = , где К — коэффициент

Со

распределения, Со — концентрация компонента в экстрагируе- мой жидкрети, Со —концентрация компонента в экстракте. Коэф-

336

фициент распределения — величина, определяемая опытным пу- тем, показывает во сколько раз равновесная концентрация веще- ства в экстракте больше, чем в обработанном растворе. Например, в случае экстракции пенициллина из нативного раствора бутила- цетатом при температуре 0°С и рН 2,5 коэффициент распределения К=35. Это значит, что при остаточном содержании пенициллина в нативном растворе 200 ЕД/мл, равновесная активность бутила- цетатного экстракта составит 7000 ЕД/мл. Это позволяет одновре- менно и концентрировать целевой продукт и очищать его от сопутствующих примесей.

Классическим примером применения экстракционного метода в системе "жидкость-жидкесть" для выделения й очистки продук- тов микробного синеза является схема получения пенициллина, представленная на рис. 96.

Нативный раствор, содержащий бензилпенициллин, из сборни- ка (1) поступает на первую экстракцию бутилацетатом. Экстракция —массообменный процесс, и он протекает тем быстрее, чем юг- тенсивнее входят в соприкосновение друг с другом несмешиваю- щиеся жидкости. Поэтому очень важно провести эмульгирование (3), нб при этом эмульсия должна хорошо разделяться^ сепараторе (6). В связи с тем, что нативный раствор содержит большое количество поверхностно-активных веществ белковой природы, в процессе экстракции образуются весьма стойкие, трудноразделя- емые эмульсии. Это "требует применения специальных дезэмуль- гаторов, например, поверхностно-активное вещество — авироль. Действие "авироля основано на том, что он вытесняет белковые вещества из межфазовой поверхности, образуя пленку на границе раздела фаз (между водой и бутилацетатом). Пленки, образованные- ПАВ, обладают незначительной прочностью по сравнению с плен- ками из белка, поэтому эмульсии легко разрушаются под влиянием центробежных сил, развиваемых в сепараторах. Для разделения эмульсий достаточно добавить к нативному раствору 0,05—0,1% ПАВ.

Экстракцию проводят при рН 2,8±3,0 и температуре 10°С. Подкислением нативного раствора серной кислотой (2) подавляют диссоциацию карбоксильной группы молекулы пенициллина, в недиссоциированном состоянии он переходит вг органическую фазу (бутилацетат). Высокая селективность экстракции достигает- ся благодаря тому, что в области рН 2,8± 3,0 более сильные кислоты, чем пенициллин, находятся в диссоциированном состоянии и поэтому не растворяются в бутилацетате; в водной фазе остаются

337 • '

минеральные компоненты (загрязнения), большая часть азотистых соединений и других органических веществ, так что в результате экстракции чистота продукта увеличивается в 4—5 раз.

Первый бутилацетатный экстракт пенициллина промывают обессоленной водой в эмульгаторе (7) и сепараторе (9), затем подают на бикарбонатную экстракцию-двухступенчатую. На пер- вой ступени экстракцию проводят в эмульгаторе (11) и экстракторе — сепараторе (12) обедненным бикарбонатным экстрактом со второй ступени бикарбонатной экстракции. Обедненный бикар- бонатный экстракт пенициллина поступает на новую ступень бикарбонатной экстракции в эмульгатор (13) и экстрактор-сепара- тор (14). Экстракцию бикарбонатом натрия проводят при рН 7,3-5-7,8. При этих условиях пенициллин находится в диссоцииро- ванном состоянии и поэтому хорошо растворяется в водной фазе, но не растворяется в органической фазе. На данной стадии удается освободиться от примесей, являющихся более слабыми кислотами, чем бензилпенициллин, и сконцентрировать раствор в 2 раза.

Из бикарбонатного экстракта антибиотик вторично экстраги- руют бутилацетатом при рН 2,2 - 2,5 в эмульгаторах (15,16) и экстракторе-сепараторе (17).

Второй бутилацетатный экстракт бензилпенициллина поступает на осветление углем и на вымораживание (19). С помощью угля освобождаются от оставшихся пигментов. При вымораживании (—5°С) вместе с замерзающей водой удаляются сульфаты.

Освобождение от угля и льда осуществляют с помощью филь- трации (20), затем второй бутилацетатный экстракт поступает в реактор (21) для получения калиевой соли бензилпенициллина. В реактор добавляют насыщенный раствор калия уксуснокислого и раствор калия углекислого (донор ионов калия).

_{✓ ч}

С,Н,-СК-СО-ЫН-СН-СН С(СК),

^{а л} | | | ³ + сн/ххж —>

ОС N СН-СООК

5

у \

—> С-Н,-СН,-СО-ЫН-СН-СН С(СН,),

^{6 5 2} || | ² + сн₃соон ОС N СН-СООК

2сн₃СООН+К₂с0^2сн₃СООК+Н₂0+с0₂

Образовавшаяся калиевая соль бензилпенициллина переходит снова в водную фазу. Водный слой и бутилацетат разделяют при отстаивании (контроль за разделением проводят визуально через смотровое стекло, установленное на трубопроводе).

Водный концентрат калиевой соли бензилпенициллина после фильтрации (24) передают на вакуум-упаривание (26) и кристал- лизацию. Этот процесс является процессом кристаллизации со сменой растворителя. Калиевая соль бензилпенициллина кристал- лизуется в бутаноле после выпаривания воды. В случае проведения процесса при пониженной температуре к водному раствору добав- ляют бутанол. Образовавшуюся азеотропную смесь "бутанол-вода" отгоняют при 20°С. Кристаллы отфильтровывают от маточника (28), промывают безводным бутанолом и высушивают.

Выделение и очистка канамицина из нативных растворов ос- нована на ионообменных методах. Канамицин — антибиотик основного характера, его выделяют из нативных растворов сорб- ционным методом. Для удаления ионов кальция культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. После отделения осадка нативный раствор,(рН 6,8+7,2), содержащий канамицин поступает на ионообменные колонны (рис. 109). При этих условиях канамицин представляет собой шестивалентный катион.

Антибиотик сорбируется на карбоксильном катионите КБ-2 в натриевой форме, так как активные центры этого сорбента заняты ионом натрия. Процесс сорбции идет по схеме:

6КСООНа+Кан.⁺⁶ -> (КСОО)₆ Кан.+ 6Иа⁺

Нативный раствор канамицина проходит через батарею после- довательно соединенных колонн (5—7). Раствор подают снизу, так как сорбция протекает во взвешенном слое сорбента. Здесь важ- ным является выбор рабочей скорости (\Л/_раб.), которая должна быть больше критической скорости (Шкрит.), определяющей про- цесс псевдоожижения, и меньше скорости уноса (\/Уун.) — скорость, при которой сорбент уносится с раствором из колонны,

Сорбцию ведут до тех пор, пока в отработанном растворе не останется порядка 5—6% концентрации антибиотика от исходной.

Каждую колонну в батарее отключают после полного насыще- ния, промывают обессоленной водой (1) и подвергают десорбции. Десорбцию канамицина проводят Ш раствором аммиака (2) или элюатом третьей фракции (10), укрепленным 25% раствором ам- миака. Процесс проводят в соответствии с реакцией (при подаче раствора сверху):

* * *

Рис. 109-Принципйальнак схема получения. каНамйцинЪ: 1 ^сборник обессо- ленной воды, 2— сборник 1'н, р-ра ГЧН4ОН , 3.-^- сборник 1 н. р-наНСЬ, 4 — сборник 1 н. р-на КаОН, 5, 6, 7 — колонны с катионитом КБ-2, 8, 9, 10 — сборник элюата. I, II и III фракций соответственно, 11,12 — кОлоннью анионитом АВ- 1-7-2П. 13:—сборник осветленного элюата, 14*— ватсууй-выпарной аппарат, 15 — реактор для подкисления и обработки углем, 16,21 — фильтры, 17 — сборник осветленного концентрата, 18, 19 — колонны с катионитом КУ-2-"20, 20 — реактор для подщела- чивания,- 22 — аппарат для кристаллизации, 23 ■— центрифуга.

(КСОО)б Кан + 6КСООНН4 + Кан⁺⁶

Ионы N1-14 в растворе аммиака не вытесняют катионы со смолы, поэтому элюаты содержат незначительные количества при- месей минеральных солей. При этом образуются 3 фракции, из которых первая с небольшим содержанием канамицина (8) посту- пает на очистку стоков; вторую фракцию — основную собирают в сборнике (9); третью фракцию из сборника (10) возвращают для десорбции канамицина с сорбента.

Сорбент КБ-2 в колонне после трехкратного использования подвергают регенерации, которую последовательно проводят Ш

340

раствором НСЬ (3), обессоленной водой, Ш раствором N8014(4) и повторно — обессоленной водой. Все отработанные растворы сливают в специальную "кислотно-щелочную канализацию".

Таким образом, на каждой колонне с сорбентом КБ-2 много- кратно повторяются процессы сорбции, десорбции, регенерации. Дальнейшей очистке подвергают вторую фракцию элюата кана- мицина. Эта фракция поступает на осветление на колонны с анионитом АВ—Л7—2П в ОН" форме (11, 12). Данный анионит избирательно поглощает пигментные вещества и не сорбирует антибиотик. Раствор подают сверху; он проходит через две после- довательно соединенные колонны. Осветленный раствор канами- цина собирают в сборнике (13), а сорбент регенерируют последо- вательным пропусканием растворов -НСЬ, обессоленной воды, ИаОН и вновь — обессоленной воды. -Из сборника (13) раствор подают для концентрирования в вакуум-выпарной" аппарат (14), представляющий собой вертикальный кожухотрубчатый испари- тель пленочного типа. Испарение протекает При 80°С под вакуумом. Концентрат направляют в реактор (15) для обработки углем. Про-" цесс осуществляют при рН 4,2—5,2. В качестве подкисляющего агента используют 25% раствор НгЗОф После фильтрации (16) прозрачный, осветленный концентрат канамицина (17) поступает . на обеззоливание, которое проводят на колоннах с катионитом КУ-2-20 в Н⁺ форме. "

После пропускания раствора канамицина сорбент регенериру- - ют с - помощью 114 .раствора НСЬ е последующей промывкой обессоленной водой. - -

Обессоленный концентрат канамицина (20) После фильтрации. (21) поступает на кристаллизацию (22). Кристаллизацию моносуль- фата канамицина проводят при добавлении двойного объема 98% метанола при рН 9,3 — 9,7. Кристаллы отделяют на центрифуге (23) и передают" на высушивание. *'"."_

7.5. Аппаратурное оснащение фитобиотехнологических про- изводств. Особенностями растительных клеток. являются; их склонность к объединению в тканевые' структуры, которые .в целостном организме '"омываются" жидкостями определенного состава, содержащими многие регуляторные вещества, оказываю- щие заметное влияние на функцию тканей; малые скорости роста и развития растительных клеток, а некоторые из них вообще не культивируются в глубинных условиях на жидких питательных средах; хемогетеротрофизм (а не фотоавтотрофизм) растущих клеток в культуре; синтез целевого продукта лишь агломератами

341

клеток в одних случаях (не отдельными клетками) — здесь сказы- вается позитивная роль дифференциации в клеточных агломера- тах, и, напротив, недифференцирован- ное состояние клеток в культуре может быть более предпочтительным — в дру- гих случаях.

|.г—

Рис. 110. Биореакторы для вы- ращивания растительных клеток: а — ферментатор с подачей сте- рильного воздуха снизу, б—фер- ментатор с продувкой стериль- ным воздухом и отводной трубой.

В зависимости от вида и потребно- стей клеток их культивируют в разных биореакторах (с механическим переме- шиванием,, колонного типа с переме- шиванием (рис. ПО)). Фирма "51дта" (США) выпускает мембранные наборы (ЯаЙз) для растительных культур тка- ней, что помогает исключить ингибито- ры, нередко присутствующие в агар- агаре и других желирующих агентах. Мембранные наборы (Капа) предназна- чены для выращивания протопласти- рованных и других культур, которые могут поддерживаться длительное время без смены культурального кон- тейнера.

Мембранные наборы (Ыапв) име- ют квадратную (60x60 мм и др.) или круглую (73 мм в диаметре и др.) форму. Их изготавливают из поли- пропилена с размером пор, в среднем, 0,075x0,25 мкм (площадь ^асех пор за- нимает порядка 45% мембраны), тол- щиной 25 мкм; они пригодны для про- тока воды 288 л/м²/час. Мембраны ус- тойчивы к действию сильных кислот, оснований и к органическим раствори- телям (за исключением галогенизиро- ванных углеводородов) . На рис. 111,112 представлены мембрана и мембранный контейнер.

Та же фирма "31дта" предлагает так

называемый фитатрей (от англ. ггау — , _

. Рис. 112. Мембранный кон-

поднос) для растительных клеточных _тейнер ^ _{вырашивания расти}.

культур (рис. 113); размеры его тельных культур тканей.

342

92x114x89 мм. Каждый фитатрей упако- рвывают в ящики по 100 кювет и крышек |наящик. Составные части фитатрея сте- Ррилизутот гамма-облучением, после чего Мони готовы к применению по назначе- |нию.

Для культивирования растительных рклеток разработаны специальные био- 1реакторы различной емкости. Принци- пиальная схема одного из них показана на рис. 85. Здесь также можно исполь- зовать ферментатор Био-Фло III (см. раз- дел 7.1.).

7.6. Аппаратурное оснащение зообиотехнологических произ- водств. К зообиотехнологическим относятся производства: вакцин, моноклональных антител, лимфокинов (медиаторов иммунокомпе- тентных клеток), других белков (в том числе — ферментов), гормонов и пр. Ряд биологически активных веществ образуется эукариотическими клетками лишь в результате посттрансляцион- ной модификации. К этому неспособны прокариотические клетки.

Клетки млекопитающих не имеют клеточной стенки и их протоплазматическое содержимое защищено лишь тонкой клеточ- ной мембраной. Они всегда представляют собой часть какой-то специализированной ткани и, следовательно, зависят от жизнеде- ятельности других клеток. Поэтому существование животных кле- ток в изолированном состоянии весьма ограничено и, порой, исключительно трудно воспроизводимо в ла- бораторных и, тем более, в производствен- ных условиях. К тому же и растут они срав- нительно медленно (см. рис. 89). Тем не менее, успехи в зообиотехнологии весьма ощутимы и этому способствовали приемле- мые методы культивирования их в подходя- щих условиях (рис. 114).

Выращивание животных клеток условно можно подразделить на следующие этапы: I — механическая и ферментативная дезин- теграция ткани животного до получения сме- си клеток или их агломератов;

II — перенос клеток или их агломератов стиковом культуральном в питательную среду во флаконах; сосуде (увеличение хщ.

3. — отделение клеток от дна флакона с помощью фермента и перенос их в другой флакон со свежей питательной средой для размножения;

4. — перенос клеток в биореактор и накопление целевого продукта;

V — выделение целевого продукта.

Первый этап исключают в случае использования клеток крови, лимфы, опухолей и некоторых других трансформированных кле- ток, поскольку они растут в виде суспензионных культур. Все другие животные клетки прикрепляются к какой-то поверхности. Поэтому ткани, из которых получают такие клетки, дезинтегриру- ют в тканевых-гомогенизаторах и обрабатывают протеазой, цент- рифугируют при небольших скоростях ротора во избежание трав- . мирования клеток.

На втором и третьем этапах осуществляют выращивание и наращивание клеток во флаконах или в горизонтально располо- женных и медленно вращающихся (порядка одного оборота в мин.) бутылях. Самые большие бутыли имеют пло-

С

щадь около 1600 см-. Отделение клеток от доньев флаконов после П-го этапа также осуществляют с помощью протеолитиче- ских ферментов.

Используемые при этом питательные среды весьма сложные и дорогие (см. спе- циальную часть книги), обычно содержащие антибиотик и сыворотку животных (от 5 до 20%). К сожалению, сыворотки могут высту- пать источником заражения (загрязнения) культуры животных клеток бактериями, ви- русами, микоплазмами, или какими-либо ингибиторами. Поэтому синтетические сре- ды представляются более удобными и вы- годными с экономической точки зрения.

На IV этапе клетки переносят в биоре- актор большого объема. Биореакторы для культур животных клеток считают больши- ми, начиная с объема 10 литров, а если имеются 100—200тлитровые биореакторы, то это исключительно большие аппараты. Они отчасти напоминают биореакторы, применяемые в промышленной микробио-

344

Рис 115. Мешалки в би- ореакторах для выращива- ния клеток: микроорганиз- мов (1 — турбинная) и жи- вотных' (2 — пропеллер- ная, 3 — вибромешалка).

логии, так как в обоих случаях принципиальные подходы к выра- щиванию клеток во многом сходны (хотя животные клетки нежнее и во много раз крупнее бактериальных или многих других микро- бных клеток).

Чтобы меньше повреждать клетки, турбинные мешалки заменяют на пропел- лерные (винтовые) или на вибромешалки (рис. 115). При использовании мешалок 2 среда перемешивается, а биореактор ос- тается неподвижным. В других случаях Р™- ^11е- Роллерный био- среда остается неподвижной или мало по- \ _ Д¹^^™^

движной, а перемещению подвергается вход и 4 — выход газа-возду- биореактор (рис. 116). ха.

Увеличение отношения площади по- верхности биореактора (5) к его объему (V) (во благо возрастания объемной плотности растущих адгезированных клеток) возможно либо за счет увеличения числа реакторов, или за счет его конст- рукционных модификаций. Последнее оказалось предпочтитель- нее со всех точек зрения. Были предложены способы выращивания клеток на гранулированных микроносителях, на губчатых полиме- рах, на стопках тонких пластинок, на тонких нитях и пористых трубочках. В подобных реакторах удается в 10 и более раз повысить плотность клеток на 1 см² поверхности (рис. 117).

Впервые культивирование клеток животных на микроносите- лях осуществил А. Ван-Везель (Голландия) в 1967 г. Гранулирован- ные микроносители изготавливают из альгината, декстрана, син- тетических полимеров размером, в среднем, 50—200 мкм в диамет- ре. Клетки прикрепляются к поверхности гранул и образующаяся

система представляет собой монослойную и суспензионную куль- туру одновременно. В проточном реакторе с мешалкой, несущей гибкие лопасти (перемешивание по типу движения рыбьего хвоста) удается создавать высокую концентрацию гранул (12 г/л) без заметного повреждения растущих на них клеток.

В компании Мопзапхо (США) созданы биореакторы для массо- вого культивирования клеток млекопитающих, в том числе — проточные. Впервые проточная система была разработана Ф. Химмельфарбом и Ф. Тейером в 1969 г. Она и была положена в основу биореактора, предложенного Дж. Фидером и У. Р. Толбер- том в начале 80-х годов (рис. 118). В таком биореакторе осущест- вляется комбинация выращивания культур с высокой плотностью клеток и переноса их в реактор большего объема. Здесь демонст-

Рис. 118. Проточный реактор с гибкими лопастными мешалками (по Дж. Фидеру и У. Толберту, 1983).

ративен следующий пример: в 4-литровом проточном реакторе получено 40 млрд. фибробластов человека (если их выращивать в роллерных сосудах); после отделения фибробластов от гранул микроносителя и переноса их в 44-литровый биореактор с 400 г новых гранул с общей площадью их поверхности 188 м² удается получить 340 млрд. клеток, то есть в 8,5 раза больше (для накопления такого числа клеток в роллерных сосудах потребовалось бы 11000 вращающихся бутылей).

Известны и другие типы биореакторов, принципы работы которых во многом сходны. К их числу можно отнести биореактор СеПСеп, предложенный фирмой Ие\у Вшпзтласк ЗаепШк Со., 1пс. (США). Его особенности: 1) многоцелевое назначение (для суспен- зионного культивирования, в том числе, на микроносителях, для проточного культивирования); 2) при малых скоростях перемеши-

346

вания достигается эффективная массопе- редача Ог; 3) надежность контроля темпе- ратуры с исключением возможности ло- кального перегрева; 4) обеспечение на- дежного контроля за рН и растворенным кислородом (рис. 119); 5) взаимозаменяе- мость реакторов емкостью 1,5; 2,5 и 5,0 литров; 6) оснащенность биореактора мик- ропроцессором. В таком биореакторе за- метно повышается выход конечных про- дуктов, а жизнеспособность клеток пре- вышает 90%. Применительно к гибридом- ным клеткам показана возможность их выращивания в так называемой проточ- ной или перфузионной системе, состоя- щей из биореактора и фильтрационного устройства с тангенциальным потоком жидкости (рис. 120). Клеточную культуру удается поддерживать до 1,5 месяцев и более (с числовым показателем, достигающим 1,8 • 10⁷ клеток/мл и максимальной концентрацией моноклональных анти- тел до 800 мкг/мл, обеспечивая их продуктивность 504 мг/день).

В целях реализации крупномасштабного культивирования кле- ток млекопитающих предложена так называемая система ГуИсго- ЫЙ, функционирующая совмещение с многоканальным процессо- ром МЬ-4100.

Во всех случаях культивирования животных клеток в больших реакторах технологический процесс ведут- ступенчато, начиная с сосудов малого объема:

поверхностная культура суспензионная культура

1. чистая культура клеток 1. чистая культура клеток

в жидком азоте в жидком азоте - -.

2. культура во флаконах 2. культура во флаконах (3«10⁵ клеток /см²) . /(5—10) • 10⁶ клеток/мл/

3. культура в сосудах 3. культура в роллерных сосудах (8 • 10⁸ клеток/см²) (7 • 10⁹ клеток/см²)

4. культура в роллерных 4. культура в биореакторе сосудах (5 • 10⁹ клеток/см²) на 20 л (7,5 • 10^й клеток/см²)

5. культура в аппаратах 5. культура в биореакторе с пластинами на 500 л

(2 • Ю'^еток/см²) (3,7 • 10¹² клеток/см²)

6. культура в аппарате с микроносителем (3,7 • 10" /см²).

Из-за повышенной чувствительности животных клеток к раз- личным внешним воздействиям важно исключить не только по- вреждающее действие перемешивающих систем в биореакторах, но и заметные колебания температуры, поскольку ниже 37°С клетки растут очень медленно, а выше 37°С они теряют жизнеспо- собность. Температурный контроль при этом осложняется тем, что скорость перемешивания среды с микроносителем малая и, следо- вательно, эффективность теплопередачи заметно снижается. Од- нако в отличие от микробных ферментации, здесь нет проблемы с отводом тепла, образующегося в процессе метаболизма клеточной культуры. Определено, что теплоемкость должна быть 712»10³ Дж/час/л культуры, содержащей 10⁹ клеток.

К настоящему времени сделаны базисные разработки для выращивания клеток млекопитающих и есть все основания наде- яться на то, что аппаратурное оформление биотехнологических процессов будет постоянно совершенствоваться. Как пример ска- занному можно назвать геновый ассемблер, с помощью которого синтезируют олигонуклеотидные последовательности ДНК длиной около 200 оснований. Олигонуклеотиды "растут" на твердых бу- синках, помещенных в специальные кассеты, имеющие цветовой код (А/О Фармация, ЛКБ-приборы, Швеция). С применением уникальной кассетной системы (объемом 0, 2, 1,3 или 10 микро- молей) исключается необходимость взвешивания матрицы перед

348

ее применением, равно как и работа с незакрепленными бусинка- ми.

Перед началом синтеза соответствующую кассету вставляют в один из реакторов колонки, а после окончания еинтеза ее выни- мают й выделяют олигонуклеотиды. При этом колоночный реактор пригоден для повторного использования. Работа оператора-состоит лишь в передаче геновому ассемблеру желаемой информации о синтезе олигонуклеотида с заданной последовательностью: Подо- бные приборы обеспечивают потребности в генно-инженерных разработках для биотехнологии в целом.