Часть III.

Процессы и аппараты в биотехнологии

Глава 6,

ПРОЦЕССЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Биотехнология как наука базируется на использовании биоло- гических процессов в технике и промышленном производстве (см. главу 1). Эти процессы (от лат. ргосеввиа — продвижение) — как совокупность последовательных действий специалистов направле- ны на достижение соответствующих результатов при эксплуатации биообъекта(-ов). Говоря о процессах в биологической технологии, нельзя путать их с процессами в химической технологии. Так, главным компонентом первых является какой-либо биообъект (вирус, бактерия, гриб, растительные или животные клетки, био- молекулы). Такие объекты отсутствуют в химической технологии. Другой пример с высокими температурами, которые, как правило, неприемлемы в биотехнологии, но часто используются в химиче- ской технологии. Наконец, многостадийность и высокие давления также являются атрибутами (от лат. аглЬиио — придаю, наделяю) химической технологии, а не биотехнологии. Однако биохимиче- ские и химические реакции следуют принципу ле Шателье, соглас- но которому равновесие системы смещается в направлении умень- шения эффекта произведенного воздействия.

Ингредиенты питательной среды		Приготовление питательной среды	« Вода |

Упаковка, хранение (транспортировка)

Целевой продукт

Обезвреживание, утилизация

Рис. 75. Примерная обобщенная схема процессов в биотехнологии.

Исходя из обобщенной схемы, нельзя учесть все виды и разно- видности биотехнологических процессов (сравнить данные на рис. 75 и в таблице 24). В основу подразделения биотехнологических процессов могут быть положены различные принципы, например, оценка: принадлежности биообъектов к надцарствам живых су- ществ (процессы на основе использования акариот, прокариот, эукариот), функциональной активности биообъекта (биосинтез, биотрансформация), возможности вычленения отдельных этапов из биотехнологических схем производства в виде самостоятельных процессов (подготовка питательных сред и оборудования; стери- лизация питательных сред оборудования, воздуха, ферментация (культивирование) биообъекта; выделение, очистка и упаковка готового продукта и т. д.

Классификационные схемы подобного рода оправданы и ими можно пользоваться как равноправными.

Биотёхнологические процессы условно можно подразделить на биологические, биохимические и биоаналогичные. К первым от- носят те из них, которые основываются на использовании акариот, прокариот и эукариот, вторые — на использовании ферментов, и третьи (биоаналогичные) — на химическом синтезе или полусин- тезе веществ, функционально близких или эквивалентных первич- ным или вторичным метаболитам живых организмов (получение производных пенициллина и цефалоспорина, тетрациклина, нук- леиновых оснований и др.).

_{Л /}^СН_з

к-со-ын-сн-сн-к I I

С,Н,-СН,-СО-ЫН-СН-СН с____гн

К —N—СН-СООН —50₃Н

о °

бензилпенициппин монобактам

В полусинтетических ампициллине, метициллине, оксациллине К представлены соответственно: а 7 О - (-) - аминобензилом СбНз—С|Н—гШа2,6 - диметоксифенилом СбНз(ОСНз)2—, 5 - метил - 3 - фенил - 4 - изоксиазолилом

° СН,

о=с-м+-сн-сн сн \ III

(СН,), С—N с-сн,-о-со-сн, / ²³ II ^ сн-ын₃ о I I ² соон соон

цефалоспорин

В полусинтетическом цефалоглицине радикал К представлен аминобензилом СбН5—СН—ЫН2, в цепорине (цефалоридине) при- соединены два радикала в позициях 3 и 7

_О

О-С-ЫН-СН-СН СН_Л

_О

сну с—м^с-сн-к

о '

соон

цепорин

В полусинтетических производных тетрациклина - доксицик- лине и метациклине (рондомицине) К.1—Ш представлены соответ- ственно: —ОН, —СНз, —Н, —Ни — ОЩК.1), —СНг—(Кг и Кз), —Н(К4).

• ?(СНз)2 Полусинтетическим аналогом

^он урацила является противораковый

препарат 5 - фторурацил и т. д. сомн₂ Многие процессы биологиче- ской технологии являются общими, например на стадии ферментации, поэтому можно выделять общие основы о »

биологической технологии. Это особен- тг⁴* ^мн"'тг'^Р

но показательно на аппаратурном офор- 1^ ^ ^|

млении отдельных стадий биопроиз- ° V ° V водств и, в частности, на выборе биоре- ^{н н}

акторов, сепарирующего оборудования; сушилок и т. д. (см. главу 7).

Специальные биотехнологические процессы связаны в большей степени с особенностями биообъектов. Достаточно сравнить здесь культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах для при- готовления вакцин и выращивание пеницилла — продуцента ан- тибиотика бензилпенициллина в биореакторах емкостью до 100 м³ и более; другой пример с гибридомными клетками млекопитаю- щих, продуцирующих моноклональные антитела, и с лейконосто- ком — продуцентом полисахарида декстрана.

В каждом из этих процессов имеются свои специфические особенности, благодаря которым выделяют биотехнологический процесс в самостоятельный. С учетом сказанного мы группируем все специальные биотехнологические процессы на микробиологи- ческие, фито- и зообиотехнологические. Другими словами, мы выделяем микробную биотехнологию, фитобиотехнологию и зоо- биотехнологию.^- Общие процессы изложены в первой части учеб- ника, специальные - во второй.

6.1. Взаимосвязь процессов и биообъектов. Биообъекты харак- теризуются такими показателями, как уровень структурной орга- низации, способность к размножению (или репродукции), наличие или отсутствие собственного метаболизма при культивировании в подходящих условиях. Что касается характера биообъектов, то под этим следует понимать их структурную организацию. В таком случае биообъекты могут быть представлены молекулами (фермен- ты, иммуномодуляторы, нуклеозиды, олиго- и полипептиды, и т. д.), организованными частицами (вирусы, фаги, вироиды), одно- клеточными (бактерии,' дрожжи) и многоклеточными особями (нитчатые высшие грибы, растительные каллусы, однослойные

культуры клеток млекопитающих), целыми организмами растений и животных.

Молекулярные биообъекты накладывают свой отпечаток на организацию и аппаратурное оформление соответствующих био- технологических процессов.

Вирусы и фаги как облигатные паразиты могут культивиро- ваться только на живых клетках и тканях, то есть фактически биотехнологические процессы здесь основываются на использова- нии клеток, зараженных вирусами или несущих вирус(-ы),

Одноклеточные виды прокариот и эукариот могут использо- ваться в биотехнологических процессах в виде монокультур или в ассоциациях. Для сравнения можно назвать производство какого- либо антибиотика (пенициллина, рифамицина и др.) с помощью чистой культуры соответствующего продуцента, а также производ- ство кефира с помощью кефирных "зерен" ("грибков"), в состав которых входят лактобактерии и дрожжи. Следовательно, в по- следнем случае применяют природную ассоциацию микроорганиз- мов, и кефир является продуктом смешанного брожения — молоч- нокислого и спиртового. Пировиноградная кислота как ключевой продукт, возникающий из моносахаридов (моноз) после гидролиза лактозы, трансформируется лактобактериями до молочной кисло- ты, а дрожжи "доводят" тот же пируват до этанола.

ир

12 22 11

-»2С_йН,₂О_в-

глюкоза и галактоза

лактобактерии и дрожжи

+12Н

» 6СН_зСОСООН пируват

дрожжи

6СН₃СН(ОН)СООН

лактобактерии

6СН₃СОН-

->бен₃сн₂он

лактат

В природных условиях микроорганизмы, как правило, находят- ся в ассоциативных взаимоотношениях, часть из которых несом- ненно может быть привнесена в производство в виде самостоя- тельных биотехнологических процессов. Сегодня такие процессы немногочисленны, так как природные ассоциации изучены крайне

234

недостаточно с точки зрения биологической технологии. К тому же такие ассоциации складываются не только между микробами

• микробоценозы, но и другими организмами — микробами и растениями, микробами и животными, между растениями, и т. д.; в таких случаях говорят о биоценозах (от греч. Ыов — жизнь, сотов

• община). Если организмы выживают, но не размножаются в данных конкретных условиях, то под этим подразумевают их нахождение в состоянии анабиоза (от греч. апа — назад, обратное действие, подобно, соответственно). Если же организмы растут, развиваются и размножаются в среде обитания, то под этим понимают их нахождение в состоянии метабиоза (от греч. те1а -— между, посредине, изменение, следование в пространстве и вре- мени). Наконец, гибель организма(-ов) в ассоциации или вне ее можно охарактеризовать понятием абиоз (от греч. ап — нет, Ъюв

• жизнь). В биотехнологии приходится постоянно встречаться с такими явлениями как метабиоз, абиоз и анабиоз. Имеются и такие ассоциации организмов, когда один (или более) из ассоциантов может расцениваться хищником. Например, гриб АЛпгоЪоггув оНдоврога формирует сеть из мицелиальных петель — ловушек нематод, в частности, относящихся к числу вредителей растений (лука, клевера и др.). Такой нематодой является ОИу1епспив сИрваа

• стеблевая нематода. В сельском хозяйстве заметен вред от картофельной нематоды — Не1;егос1ега гов1:осЫепБ±8. Поэтому гри- бы-хищники оказываются союзниками человека в борьбе за уро- жаи ряда ценных культур растений, повреждающихся нематодами.

Растением-хищником является росянка (насекомоядное расте- ние). У нее на листьях имеются железистые волоски, выделяющие ферментативно активную липкую жидкость, с помощью которой схваченные насекомые прочнее адгезируются и перевариваются.

Среди микробов хищником является миксомицет 01с1уов1:е]шт ёксошеит, а его жертвой — кишечная палочка.

При хищничестве, присущем только эукариотическим организ- мам, жизнь партнера-жертвы ограничена во времени, то есть здесь ассоциация организмов кратковременная.

Таким образом, анабиоз, метабиоз, абиоз и хищничество отно- сятся к разряду понятий об уровнях жизнедеятельности организ- мов. При метабиозе всегда предполагается наличие организмов- партнеров, вступающих или вступивших во взаимоотношения. Каковы же эти взаимоотношения? — Фактически их два — симбиоз и антибиоз (таблица 25).

235

Симбиотические взаимоотношения типа комменсализма при- сущи, например, рыбам прилипале и акуле, грибу пенициллу, образующему пенициллин, и кишечной палочке, продуцирующей фермент пенициллиназу, которая гидролизует антибиотик до пе- нициллоевой кислоты — он становится не активным.

236

4>К— со—ин—сн

:н—сн сь-|

III.

о=с

_{С N—СН—СООН}

I I

он н

пенициллоемя кислота

Оба вида могут расти на мясо-пептонном агаре, но кишечная палочка в этом случае использует вторичный метаболит пеницилла. Третий пример — ассоциация аэробных и анаэробных микроор- ганизмов. Представители второй группы начинают расти на среде лишь тогда, когда аэробы снизят концентрацию кислорода до необходимой им величины. Следовательно, вторые живут за счет функциональной активности первых, не принося им вреда.

Яркими природными симбиотическими ассоциациями типа мутуализма являются лишайники, где партнерами выступают ци- анобактерии (или зеленые водоросли) и грибы; муравьи-термиты и некоторые грибы; микробы рубца жвачных животных; грибы- микоризообразователи и соответствующие растения; нитрифици- рующие бактерии-симбионты в клубеньках бобовых растений; отдельные представители нормальной микрофлоры кишечника человека; некоторые бактерии — эндосимбионты внутри клеток простейших, и т. д.

При редком явлении — нейтрализме партнеры — ассоцианты ведут себя так же, как если бы их культивировали по отдельности — скорости роста одинаковы в обоих случаях. Напри- мер, молочнокислые бактерии и молочнокислые стрептококки в закваске для кисломолочного продукта (йогурта) не проявляют отклонений в скоростях роста в сравнении с таковыми для культур в изолированном состоянии. По другим показателям (кроме ско- рости роста) данные не накоплены, поэтому возможно "голый" нейтрализм в природных ассоциациях отсутствует.

В случаях паразитизма один из ассоциантов всегда наносит вред другому. Среди микробов хорошо известно пораже- ние прокариотических видов фагами; растений, теплокровных животных и человека — вирусами, патогенными бактериями и грибами; комнатных мух — энтомофторовыми грибами (например, Етрива тивсае), некоторых холоднокровных животных (лягушек, рыб) грибами из родов ВазкНоЪоШв и 5арго1едша, и т. д. В случае использования таких видов (паразитов) в биотехнологии требуются особые подходы и условия работы с ними.

Антибиоз присущ многим видам микро- и макроорганизмов. Ведущую роль в подавлении партнера(-ов) в" ассоциации могут играть собственно антибиоз и конкуренция за источники питания. Собственно антибиоз обеспечивается пре- имущественно за счет первичных (ферменты) .или/и вторичных метаболитов, например, токсинов, антибиотиков (или фитонцидов растений — по Б. П. Токину); он может быть односторонним и двусторонним. Пример одностороннего — Бхгерготусев капатусеисив образует аминогликозидный антибиотик канами- цин, который губительно действует на партнера — 5а1топе11а гурЫ; пример второго — разные виды стрептомицетов, угнетающих друг друга при росте на питательной среде, например взаимно антаго- нистичны Бггерготусев дюЫлгшдапв и Зггерготусев дпзеив, 5. дюЪтпдапв и 5.1етопв, и др.

В случае конкурентного антибиоза проявляется антаго- низм (от греч. апгадошвта — спор, борьба) между видами прежде всего из-за потребностей в питательных веществах; преимущество получает здесь наиболее приспособленный вид, менее приспособ- ленный угнетается или погибает (при наличии в среде Е. соН и БхарЪ. аигеив преимущество остается за Е. соп).

Антибиоз может быть моно- и полинаправленным, или одно- и многонаправленным, то есть антибиотически или антагонистиче- ски активный вид проявляет свое ингибирующее (губительное) действие лишь в отношении одного вида или более, чем одного вида. Такой эффект зависит от сложив- шейся ситуации в природных усло- виях (спонтанно) или в искусствен- ных условиях — производственных или лабораторных (направленно). В соответствующих экспериментах не- редко определяют активность каких- либо продуцентов антибиотиков в от- ношении многих бактерий и грибов, подсевая их, например, к "штрихово- му росту" такого продуцента (рис. 76). Здесь гриб естественно или вы- нужденно (насильственно) продуци- рует пенициллин, который тормозит рост чувствительных бактерий. По- добные ситуации вынужденного (на-

сильственного) антибиоза или антагонизма могут возникать не только в природных условиях, но и в макроорганизме (И. Г. Шиллер, 1952).

Под аутоантибиозом следует понимать ингибирование или гибель организма(-ов) от действия собственных метаболитов. Например, молочнокислые кокки и бактерии, накапливающие молочную кислоту в среде обитания, погибают в результате дей- ствия этого метаболита. Другой пример с дрожжами — сахароми- цетами, использующимися в производстве этилового спирта. В процессе брожения лишь отдельные расы их могут накапливать до 15% этанола. Более высокие концентрации губительно действуют на ЗассЬаготусев сегелаыае.

Аутоантибиоз во многом зависит от возраста культуры, и он проявляется, как правило, в конце стационарной фазы роста и начале фазы отмирания. Все другие виды ассоциативных взаимо- отношений складываются преимущественно раньше.

Следует иметь в виду и адаптивные возможности видов в ассоциациях. Если чистые культуры, используемые в соответству- ющих производствах, не проявляют, например, какой-либо фер- ментативной активности, то это не значит, что в ассоциациях с другими видами они поведут себя аналогичным образом по данно- му признаку. При наличии соответствующего субстрата в среде может индуцироваться выработка адаптивных ферментов, не вы- рабатывавшихся ранее без индуктора. И в результате этого ассо- циант может подвергнуться, например, лизису (растворению).

По условиям проведения процесса различают нестериль- ные (крупнотоннажное производство кормовых дрожжей) и стерильные производства (получение антибиотиков, витаминов, моноклональных антител и др.); аэробные, или с подачей воздуха и анаэробные (без подачи воздуха) — соответственно производства лимонной кислоты и полисахарида декстрана.

Многие каллусные культуры растений выращивают поверхно- стно, то есть используя подл°^жкУ ^из питательных сред (чаще — агаризованную), тогда как микробная биотехнология рассчитана преимущественно на глубинные процессы (погружение биообъек- тов в жидкие питательные среды).

При реализации процессов их стремятся вести в одном из трех режимов: периодическом, по л у непрерывном и непрерывном. В первом случае биотехнологический процесс проводят от начала до конца согласно регламенту, и после

239

завершения всех операций его повторяют. Во втором случае осуществляют так называемый отливно-доливной процесс, когда, например, на "пике" биосинтеза какого-либо антибиотика отбира- ют 25—75% культуральной жидкости и однократно добавляют столько же свежей питательной среды. Непрерывные процессы рассчитаны на непрерывный отбор культуральной жидкости и непрерывное поступление равного количества свежей питательной среды. Непрерывный режим используется в производстве дрож- жей на гидролизатах древесины, в производстве пива, бутанола и ацетона, и др.

Выход микробных клеток при непрерывном процессе в срав- нении с периодическим будет выражаться следующими соотноше- ниями (с учетом времени удвоения массы — в. у.); 11,9 (в. у. 0,5); 7,6 (в. у. 1,0); 5,3 (в. у. 2,0); 4,3 (в. у. 4,0). Из этого следует, что с возрастанием времени генерации выходы биомассы в обоих про- цессах уравниваются.

Согласно Д. Герберту, Р. Элсуорту и Р. Теллингу при непре- рывном процессе максимальное образование продукта происходит при

ОшахХ = ЦтахУ-5с^^-^&, где

О_тах — максимальная скорость разбавления, % — концентрация микроорганизмов в биореакторе при установившемся режиме, р шах — максимальная удельная скорость роста, V — выход клеток в расчете на использованный субстрат, 5о —■ концентрация суб- страта в подаваемой свежей среде, К₈ — константа насыщения.

Применительно к фазовому состоянию ингредиентов в биотех- нологических производствах различают твердофазные процессы, например, при флуидизаций (от англ. Яшё — жидкость, жидкий) или протеинизации грубых кормов на основе соломы злаковых растений с участием некоторых грибов, получение тка- невых культур лекарственных растений на уплотненных средах, из которых затем экстрагируют действующие вещества, производ- ство сыра из белков молока и др.; газофазные процессы основаны на использовании газа (например, метана) для получения микробного белка с помощью ассоциаций метилотрофных бакте- рий.

Наконец, по условиям проведения процессов выделяют од- ноступенчатые, двухступенчатые и много- ступенчатые. Одноступенчатые проводятся, например, при

.240

получении 6-АПК из бензилпенициллина с помощью пеницилли- нацилазы, или пенициллинамидазы на колоннах, содержащих им- мобилизованный фермент.

/ место действия фермента

с_вн₆—сн₂—сог-ын—сн—сн с^-сн₃ •» нн₂—сн—сн сь-сн, ₊

0=С N—СН—СООН 0=С N—СН—СООН

6-аминопеницилиллановая кислота (б-АПК)

+ С,Н₅— СН₂-СООН фепилуксусная кислота

Двухступенчатые процессы базируются на использовании кле- ток, находящихся в разном фазовом состоянии (в трофофазе и идиофазе, см. 4.4). Так, например, двухступенчатый процесс воз- можен при получении полисахарида курдлана—на первой ступени выращивают продуцент (А1саИдепе8 Месанв уаг. туходепев) на питательной среде, поддерживая его в трофофазе; на второй ступени культуру переносят в другой биореактор, где нет пита- тельной среды, но имеется глюкоза, из которой синтезируется курдлан.

Многоступенчатые процессы присущи генетической инжене- рии и рДНК-биотехнологии (см.).

Процессы биохимической технологии подразделяют по ста- диям реализаци и технологической схемы производства: подготовка оборудования и питательных сред, их стерилизация, посев биообъекта и ферментация, выделение, очистка, сушка, упаковка. В зависимости от целевого продукта число стадий про- цесса может быть то больше, то меньше. Для сравнения можно назвать производство кормовых дрожжей и антибиотика стрепто- мицина. В первом случае целевым продуктом являются дрожжевые клетки, во втором — вторичный метаболит, предназ- наченный для парентерального введения больным людям и живо- тным. При получении антибиотика имеется больше стадий, чем в случае получения дрожжевых клеток.

Целевыми продуктами могут быть и первичные метаболиты — ферментные белки. Очевидно, что, например, экзогидролазы тех- нологически получать легче, нежели какие-нибудь эндоферменты, локализующиеся внутри клеток, и число стадий в этом последнем случае может возрастать.

Очевидно, что подготовка оборудования, питательных сред, и все другие этапы регламентированной схемы производства како-

241

го-либо целевого продукта различны по многим показателям, если это будут, например, процессы получения экзотоксинов и органи- ческих кислот. С биотехнологических позиций работа с токсиген- ными культурами должна проводиться на таком уровне, чтобы исключить возможность попадания ее за пределы биореактора в живом состоянии. Строгий контроль осуществляется также за внутрипроизводственной обработкой и транспортировкой культу- ральной жидкости, содержащей экзотоксин. Эксплуатация воз- можностей, например АврегдШив шдег продуцировать лимонную кислоту не сопряжена с подобной опасностью. Тем не менее, во избежание рассеивания грибных спор во внешней среде желатель- но и в этом случае ферментацию осуществлять в герметизирован- ных биореакторах.

После завершения ферментации отделяют либо клетки (кле- точную массу), содержащие необходимое нам вещество, либо жидкость, в которой накопился конечный продукт. В первом случае отходом является жидкая часть культурального "бульона", во вто- ром — плотная часть (клетки). Культуральная жидкость содержит биообъект, недоиспользованные компоненты питательной среды, продукты метаболизма, включая ожидаемый конечный (целевой) продукт. От качества целевого продукта зависит выбираемый метод сепарирования клеток. Например, при производстве экзо- полисахаридов, или экзогликанов культуральные жидкости стано- вятся вязкими и, даже, гелеобразными, из которых выделить клетки продуцента удается лишь после разбавления их водой в 10—20 раз с последующим нагреванием, например, до 80°С, и сепарированием в подогретом виде на мощных сепараторах типа "Альфа Лаваль" (Швеция). Полученный разбавленный раствор полисахарида подвергается концентрированию путем мембранной фильтрации и вакуум-упаривания. Если минорные компоненты в полидисперсном полисахариде количественно малы, то такой поли- сахарид может быть использован в качестве готового продукта, например, как вспомогательное вещество при изготовлении раз- личных лекарственных средств.

В других случаях необходимо спиртовое осаждение гликана с последующим удалением надосадочной жидкости и высушивание полисахарида, поступающего на хранение и на реализацию.

В производстве некоторых антибиотиков используют ротаци- онные вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Если биообъектами оказываются бактерии или дрожжи, то можно применить центрифугирование в целях концентрирования суспен-

242

зий и отделения клеточной биомассы. Применяют центрифуги непрерывного или осадительного действия. В первом случае клетки выгружаются через сопла, во втором — с помощью шнеков.

Клеточную массу можно отделять методом осаждения (седи- ментации), используя коагулянты (например, поликатионные ве- щества). Некоторые штаммы дрожжей, использующиеся в пиво- варении, обладают выраженной флокулирующей способностью, и поэтому они легко могут быть отделены таким способом.

В целях концентрирования клеток может быть полезной фло- тация (от франц. ЯоНаиоп — плавание), когда на границе раздела фаз "воздух — жидкость" собираются, например, клетки бактерий (Асте1:оЪас1ег вр.), рекомендованные в качестве продуцентов бел- ка.

В целях выделения конечных продуктов из культуральных жидкостей после сепарирования клеток прибегают к осаждению, экстракции, сорбции, ультрафильтрации (см. 7.4) или их сочета- нию.

Применительно к механизму образования конечных продуктов можно говорить о процессах биосинтеза и биотран- сформации. При биосинтезе имеет место конститутивное или

глюкозы по Вар-

бургу-Дикенсу ^ с ( м

-Хорекеру), апу- N4 * $С"^и

риновое ядро ' А Г_л\

(гипоксантин, ^ '

адаптивное образование метаболи- тов, относящихся к числу преметабо- литов, первичных или вторичных ме- таболитов. Так, нуклеозид инозин синтезируется некоторыми бактери- ями (Вас. виЪгШв, Вас. ритШв, ВгелаЬас1;епит аттошадепев и др.). Пентоза в структуре инозина образу- ется в гексозомонофосфатном шунте (путь окисления

пуриковое ЯДР°

или 6-оксипурин) в общем виде синтезируется из глицина (атомы в позициях 4, 5, 7), форми- ата (позиции 2 и 8), диоксида углерода (пози- ция 6), аспарагиновой кислоты (позиция 1) и глутамина (позиции 3 и 9).

Из первичных метаболитов можно назвать производство фер- ментов амилаз для хлебопекарной и текстильной промышленности, Ь-аспарагиназы — для здравоохранения и др. Из вторичных мета- болитов хорошо известны поликетидные антибиотики—тетрацик- лины, продуцируемые некоторыми стрептомицетами. Они образу- ются путем конденсации молекул малонилКоА. Донором металь- ной группы для некоторых

м(сн₃)₂

ОН

тетрациклинов является ^ ^

метионин, донором ами- ногруппы — глутамин.

СОШ,

В процессах биотранс- формации имеет место ви- доизменение какой-либо молекулы — предшествен- ника конечного продукта или превращение одного продукта в другой. Напри- мер, почвенные грибы и некоторые другие микроорганизмы пре- вращают фенолкарбоновые кислоты в другие формы фенолов с помощью реакций окисления, гидроксилирования и декарбокси- лирования.

СООН

СООН

он у он он

шикимовая кислота

ОН Т он ОН

галловая кислота

он 1 он он

пирогаллол

.Биотрансформация имеет место при компостировании отходов, при получении биогаза, силосовании кормов и др.

Тем не менее, подразделение процессов в биохимической технологии на биосинтез и биотрансформацию связано в основном с результирующим эффектом, а не с механизмом протекающих при этом биохимических реакций.

Подразделение биотехнологических процессов на управ-

244

ляемые и неуправляемые опирается на глубину и масштабность контроля, осуществляемого с применением средств автоматики и ЭВМ. К числу неуправляемых процессов можно отнести спонтанно протекающие компостирование плотных отхо- дов в животноводческих комплексах и фермах. К управляемым относятся все производственные процессы, основанные на исполь- зовании микробных, растительных и животных клеток. При этом уровень управления может быть двояким — операторским и автоматическим. В первом случае поддержание заданных режимов осуществляет оператор, во втором — соответствующие контроль- но-измерительные приборы, автоматы, ЭВМ.

Некоторые авторы (Ф. X. Дейндорфер, 1960) подразделяют биотехнологические процессы по типу на простые, совместные, последовательные и ступенчатые. Под простыми понимается трансформация питательных веществ в продукты метаболизма без накопления интермедиатов при наличии строго определенной стехиометрии в утилизации субстрата (или клеточном росте) и образовании метаболита. Скорость образования метаболита можно выразить следующим уравнением: г/_р= - У_р/в, где г — скорость, /р — контролируемый продукт метаболизма, У_р/в — коэффициент отношения метаболита (р) к субстрату (5). В молярном выражении

коэффициент V составляет: Ур/_в = , где р/з — число молей

ап_р

метаболита, образующегося на 1 моль использованного субстрата, /— метаболит, п₅ — число атомов углерода в молекуле субстрата, а-число молекул субстрата, п_р-число атомов углерода в молекуле продукта. Кинетика простого процесса сопряжена с ростом клеток. Примером такого процесса является получение этанола из глюкозы при спиртовом брожении.

Совместными процессами считаются те из них, в которых имеет место превращение питательных веществ в продукты мета- болизма без накопления интермедиатов, но с возможным измене- нием стехиометрии процессов. Следовательно в таких случаях стехиометрию можно выразить только с помощью уравнения реакции конечного продукта. Нередко скорость образования ме- таболита принимается пропорциональной концентрации клеток, а не скорости их размножения. В качестве примера такого типа процессов можно назвать молочнокислое брожение.

Последовательные процессы биохимической технологии характеризуются накоплением интермедиатов в ходе трансформа- ции питательных веществ в целевые продукты. Это имеет место, например, при ацетоно-бутиловом брожении, когда вначале из глюкозы образуются интермедиаты — ацетат и бутират, которые затем (наряду с глюкозой) превращаются в конечные продукты — ацетон и бутанол.

При ступенчатых процессах биологической технологии питательные вещества вначале полностью трансформируются в интермедиат (и эта трансформация протекает избирательно в какой-либо определенной последовательности) и лишь после этого образуется конечный продукт. Пример — биосинтез лимонной кислоты.

6.2. Значение асептики в биотехнологических процессах. Би- отехнологические процессы, как правило, проводят в асептичных условиях, хотя могут быть исключения для некоторых из них. Например, при культивировании отдельных эукариот (дрожжи) в негерметизированных ферментаторах (нестерильный процесс) происходит заметное снижение рН среды, где доминирующее положение дрожжей не изменяется при попадании контаминиру- ющих бактерий (от лат. сопгагшпагю — загрязнение, заражение, смешение) — они не могут составить конкуренции основному виду.

Асептика (от греч. а—не, нет, зеряз—гниение) — это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду (объект) посторонних микроорганизмов, включая болезнетворные. Следовательно, асептика в биологической технологии и, например, в хирургии — это не одно и то же понятие. В первом случае предполагают использование какого-либо биообъекта (в том числе — микроба) и полное исключение попадания других микроорга- низмов, являющихся загрязнителями. Во втором случае стремятся исключить любую возможность попадания патогенных микробов и микробов — контаминантов на операционное поле или в рану.

Каждый из материальных потоков в биотехнологических про- цессах — потенциальный источник микробов — контаминантов.

Асептика может включать влажную уборку помещений, обра- ботку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средства- ми, использование стерильных инструментов, сред, технологичес-

246

кой одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного воздуха в боксированных помещениях, по- ступление в ферментатор стерильного воздуха через барботер — от франц. ЪагЪо1аде — перемешивание) и пр. Следовательно комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов, включает: механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости — и конечный продукт. К механической защите относятся: удаление механических примесей, например, из воздуха, культиваторов, герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к фи- зической — обработка воздуха и поверхностей приборов и аппа- ратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической — обработ- ка поверхностей химическими антисептиками.

В производственных условиях источниками микробов-конта- минантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорооб- разующие палочки-бациллы, конидии грибов, актиномицеты; эти же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, через по- средство которого они способны проникнуть в среду выращивания биообъекта или в конечный продукт производства.

Качественный состав и размеры частиц в воздушной пыли колеблются в широких пределах. В производственных помещениях это зависит от конструкционных особенностей здания, розы вет- ров, географической зоны расположения города и предприятия, наличия или отсутствия потоков автомобильного и другого транс- порта, количества непосредственно занятых в технологическом процессе людей, характера и локализации складских помещений и т. д.

Образующиеся пыль или/и капельки влаги в воздухе, как правило, содержат на своей поверхности слой адсорбированного воздуха и большее или меньшее количество микроорганизмов. Газовая оболочка предохраняет частицы от смачивания. Такие частицы представляют собой дисперсную фазу аэрозоля, устойчи- вость которой зависит от размеров (величины) частиц, их элект- рического заряда и поверхностной энергии. Необходимо помнить, что в случае нахождения на частицах аэрозоля микробных клеток, то их отрицательный электрический заряд будет привносить свою

247

долю в общий заряд частицы. Опираясьлишь на величину аэрозоля, содержащего микроорганизмы, можно выделить три фазы его: крупноядерную (диаметр частиц более 100 мкм), мелкоядерную (диаметр частиц менее 100 мкм) и фазу бактериальной пыли (диаметр частиц от 1 мкм до 100 мкм). Частицы крупноядерной фазы в течение нескольких секунд оседают из воздуха, тогда как частицы двух других фаз могут длительно находиться в воздухе, образуя устойчивую коллоидную систему. В таблице 26 представ- лены данные о скорости седиментации частиц в воздухе и, для сравнения, в воде.

Т а б л и ц а 26. Седиментационная скорость (мкм/с) для сферических частиц в воздухе при нормальных температуре и давлении (18°с, 1,01*10⁵Па) и в воде при 2ГС

Диаметр частиц, мкм	В воздухе	Вводе
0,1 1,0 5,0 10,0	1,0 42,0 960,0 3650,0	0,001 0,11 2,8 11,1

Бактериальная пыль может формироваться из первых двух фаз после их высыхания и повторного попадания в воздух. В разряд частиц с диаметром от 0,001 мкм до 1 мкм подпадают вирусы и некоторые бактерии. Аэрозоли могут быть вредными и для чело- века не только из-за микробов, находящихся на частицах пыли или капельках жидкости, но и сами по себе вследствие проникновения в альвеолы дыхательной системы с последующим расстройством ее функций. В таком понимании вредными являются следующие аэрозольные частицы: асбеста, алебастра, абразивного порошка, графита, гипса, диоксида титана, дорожной пыли, извести, каолина, корунда, карбида кремния, мрамора, оксида олова, стекловолокна и др. В альвеолы проникают частицы размером менее 3 мкм при скорости потока вдыхаемого воздуха уже около 1 см/с.

По степени загрязненности воздуха микробами и механически- ми частицами в расчете на 1м³ производственные помещения, в которых асептично изготавливают лекарственные средства, клас- сифицируют по классности следующим образом:

1-й класс чистоты с ламинарным потоком стерильного воздуха — для изготовления стерильных лекарств — не должно быть микробов, а механических частиц размером до 0,5 мкм — не более 3500;

2-й класс чистоты — до 50 микробных клеток, до 2500 частиц размером 5 мкм и до 350000 частиц размером 0,5 мкм;

3-й класс чистоты — до 100 микробных клеток (ЗА класс — до 200 и ЗБ класс — до 500 клеток), до 25000 частиц размером 5 мкм и до 3500000 частиц размером 0,5 мкм;

4-й класс чистоты — по ГОСТ 12.1.005 — 86.

Для помещений 2-го и 3-го классов чистоты, в которых изго- тавливают нестерильные лекарственные средства, нормирование воздуха по содержанию механических частиц не предусматрива- ется.

Лекарственные средства по "микробной чистоте" разделяют на 4 категории: 1) стерильные препараты для инъекций, приготовлен- ные на апирогенной воде;

2. глазные лекарства, препараты для введения в закрытые полости тела, средства для лечения обширных ожогов и открытых ран не должны содержать живых микроорганизмов — они также относятся к разряду стерильных;

3. лекарственные средства для наружного применения и для введения в открытые полости не должны содержать более 100 живых микробных клеток в 1 г(мл) препарата и при безусловном отсутствии в них бактерий, относящихся к семейству ЕпгегоЪасгепасеае, а также Рзеиёотопаз аегидтоза и 51арпу1ососсиз аигеиз;

4. все прочие лекарственные средства должны содержать в 1 г(1мл) не более 1000 жизнеспособных бактериальных клеток сап- рофитов и не более 100 клеток непатогенных грибов при отсутст- вии болезнетворных и условно патогенных микроорганизмов, включая энтеробактерии, Рзеийотопаз аегидтоза, 51арпу1ососсиз аигеиз, аспорогенные дрожжи рода СапсШа.

Работающие в помещениях различной степени чистоты должны одевать рекомендуемую и пригодную для таких целей технологи- ческую одежду (согласно требованиям системы СМР — см.). Так, в помещениях первого класса, где кратность обмена воздуха в час 600—200, одевают стерильный костюм, головной убор должен полностью закрывать волосы, включая бороду, и заворачиваться под ворот костюма; на лицо одевается маска во избежание попа- дания частиц и капель в окружающую среду; на руки одевают стерилизованные без сыпучих материалов перчатки из каучука или пластичных материалов, на ступни - стерилизованную или продезинфицированную обувь, включая бахилы. Низ брюк подво-

249

рачивают в обувь (как и рукава костюма — в перчатки). От защитной одежды не должны попадать в воздух частицы и волокна, а сама она должна задерживать частицы, исходящие с тела опера- тора. Указанная одежда должна быть разового использования или использоваться в течение одного дня, если результаты проверки подтверждают такую возможность. Перчатки рекомендуется по- стоянно дезинфицировать во время операций, маски и перчатки необходимо менять перед каждой рабочей процедурой. Стериль- ную зону желательно проектировать таким образом, чтобы все операции можно было наблюдать извне. В рабочих зонах таких помещений все открытые поверхности должны быть гладкими, непроницаемыми, неразбитыми, удобными для очистки и дезин- фекции, где и когда это необходимо, без труднодоступных высту- пов и углублений, полок, шкафов, излишнего оборудования, раз- движные двери здесь нежелательны из-за возможности скопления пыли в пазах; сточные и канализационные трубы не должны проходить в стерильных зонах. Комнаты для смены одежды необ- ходимо проектировать и строить с воздушными шлюзами, снабжа- ющимися стерильным воздухом. Двери с воздушными шлюзами не должны открываться одновременно; между шлюзами должна быть система для визуального или аудиоконтроля (от лат. лазиз — зрение, аисШиз — слух, слышание). Мытье рук и средства для этого должны быть только в комнате для" смены одежды.

В рабочие помещения должен подаваться стерильный воздух под положительным давлением.

В помещениях второго класса чистоты с кратностью обмена воздуха 20—60 следует одевать гладкий (без складок), не отделяю- щий ворса, комбинезон, стянутый на поясе, с манжетами, плотно облегающими щиколотки ног; на голову необходимо одевать шлем- капюшон, полностью закрывающий волосы, нос й подбородок; на лицо — маску, не отделяющую ворса; на руки — резиновые (или из эластичных полимеров) перчатки, на ноги — стерильную или продезинфицированную обувь, поверх которой рекомендуется одевать бахилы, полностью закрывающие ступню. Нижняя часть брюк должна заправляться в бахилы, а рукава комбинезона — в перчатки. Ни одна часть тела или разрешенного для использования нижнего белья не должна быть открыта.

В помещениях третьего класса чистоты с кратностью обмена воздуха 1—15 рекомендуется одевать не отделяющий ворса ком- бинезон или куртку с собранными рукавами на запястьях и

250

воротником-стойкой, шапочку или косынку, брюки, бахилы и маску.

В помещениях четвертого класса чистоты рекомендуется оде- вать комбинезон, или куртку и брюки, или халат, шапочку или косынку из хлопчатобумажных или льняных тканей.

Вот почему важно глубоко продумывать размещение помеще- ний в производственных зданиях (особенно — для стерильных лекарств).

С водой в сферу технологического процесса могут попасть грамотрицательные бактерии из групп энтеробактерий, псевдомо- насов и некоторых других. В природных открытых водоемах обнаруживаются целлюлозоразрушающие, нитрифицирующие и денитрифицирующие бактерии, цианобактерии, аммонификато- ры, железобактерии и многие другие. Лишь вода артезианских колодцев, глубоких скважин и родников отличается высокой чис- тотой. Следует помнить, что чем больше вода загрязнена органи- ческими веществами, тем больше в ней содержится микробов.

По степени загрязненности открытых водоемов различают 3 зоны сапробности (от лат. заргсЛез — гниль, гниение): полиса- пробная — сильно загрязненная, содержащая в 1 мл несколько миллионов микробных клеток, включая гнилостные и кишечные бактерии; мезосапробная — умеренно загрязненная, содержащая в 1 мл до 100000 микробных клеток с преобладанием аэробных видов; олигосапробная — зона чистой воды, содержащей в 1 мл не более 1000 микробных клеток из предста- вителей железо-, серобактерий и некоторых других видов. Поли- сапробные зоны характерны для рек, протекающих по населенным пунктам или вблизи них, и где в воду попадают жидкие отходы из крупных свиноводческих ферм, канализационные стоки и стоки промышленных предприятий. В такой воде могут быть санитарно- показательные (Е. соН, 5ггер1ососсиз ^аесаНз), условно патогенные псевдомонасы, протей и другие виды, а также болезнетворные микроорганизмы из группы энтеробактерий.

Седиментационная устойчивость бактерий в воде достаточно выраженная (см. таблицу 26). Следует также иметь в виду и минимальные значения активной воды (а™) для различных микро- организмов, под которой понимают отношение давления паров

Уз

раствора (Ув) к давлению паров чистой воды (У_Рш): а^ = ^— (таблица 27).

Для сырья опасным уровнем влажности при длительном хра- нении является показатель а™, превышающий 0,6, реже — 0,7.

С учетом всех характеристик необходимо осуществлять подго- товку воды для использования ее в биологической технологии.

Люди, занятые в биотехнологическом производстве, также могут быть источником контаминирующей микрофлоры — гра- мотрицательных бактерий, кокков, микоплазм, вирусов и др. Толь- ко на поверхности кожи может сосредоточиваться до 10¹⁰ микро- бных клеток. Наиболее загрязненными являются кисти рук, ступ- ни, локти, шея, грудь, промежность, паховые области. Разнообраз- на и многочисленна микрофлора ротовой полости: бактериальные и кокковые формы, вибрионы, спириллы и спирохеты, нокардий, дифтероиды, протозойные организмы, аспорогенные дрожжи рода СапсШа, микоплазмы, вирусы и др. При разговоре, кашле, чихании микробы в большом числе попадают в воздух. Установлено, что здоровый человек за одно чихание выделяет до 20000 микробных клеток, способных распространяться по горизонтали, в среднем, до 1,5 м. Капельки носовой слизи, слюны и мокроты, подсыхая, образуют частицы, покрытые белковой или гликопротеиновой оболочкой, и содержащие микробные клетки. В таких частицах микроорганизмы длительно сохраняются и могут являться причи- ной нестерильности материалов (объектов) на каких-либо техно- логических операциях.

Источником микробов-загрязнителей могут быть некоторые компоненты питательных сред, например, кукурузный экстракт (фаги, дрожжи и др.).

Растительные вирусы часто выявляются в культурах каллусных тканей; высокую озабоченность в этом смысле вызывают также культуры клеток животных тканей и клеток человека, будучи исключительно благоприятными средами для контаминирующей микрофлоры.

Микробы-контаминанты не только могут подавить развитие и функции биообъекта в силу конкуренции и антибиоза, но и дезорганизовать какую-либо ткань — среду выращивания; более того, некоторые из них способны продуцировать токсические вещества, которые могут попасть в целевой продукт (равно как и сами микробы-загрязнители).

6.3. Борьба с микробами-контаминантами в биотехнологиче- ских производствах. Защита биотехнологических процессов от микробов-контаминантов эффективно осуществляется с помощью различных фильтров. В последнее десятилетие широкое распрост- ранение приобрела мембранная фильтрация в целях получения стерильных воздуха и различных жидкостей (разновидность хо- лодной стерилизации). Более того, мембраны нашли применение в рДНК-биотехнологиии, в дисперсионном и других анализах * биомолекул. Многие термолабильные вещества стерилизуют таки- ми же способами. Следовательно, мембранная фильтрация может рассматриваться как самостоятельный (лабораторный или про- мышленный) процесс.

В биологической технологии, независимо от условий проведе- ния процессов (поверхностно и глубинно, в периодическом, полу- непрерывном и непрерывном режимах, в виде твердофазных или газофазных процессов, одно-, двух- и полиступенчато), широко используют стерильный воздух, подаваемый: в ферментаторы для аэробных организмов (клеток, клеточных систем); в специальные помещения в виде ламинарных потоков для асептичного приготов- ления лекарственных средств, в боксы и операционные виварии, в распылительные сушилки для высушивания некоторых веществ, в шлюзы между (перед) асептическими блоками. Стерилизующая мембранная фильтрация здесь оказывается наиболее приемлемой.

Промышленный выпуск мембранных фильтров был начат с конца 40-х годов текущего столетия. Согласно Р. Е. Кестингу (1971) наиболее распространенными процессами фильтрации являются обычная фильтрация (ее можно назвать макрофильтрацией, Н. Е.), микрофильтрация, ультрафильтрация, диализ (и обратный осмос). Для макрофильтрации применяют обычно бумажные или стеклян- ные фильтры. При этом отделяют частицы, размеры которых находятся в пределах от 1 до 10³ мкм. Для других типов фильтрации используют нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, поливиниль- ные, полиамидные, фторуглеводородные мембраны толщиной ме- нее 0,1 мкм с высокой степенью пористости и с диаметром пор в

пределах от 10"⁴ до 10 мкм. В случаях микрофильтрации отделяют частицы размерами 1-10"²—10 мкм, в случаях ультрафильтрации размеры отделяющихся при этом макромолекул находятся в при- мерных пределах от 0,001 до 0,02 мкм, а их молекулярные массы соответствуют 1—1000 кДа.

При диализе через мембраны отделяют небольшие молекулы, сопоставимые по размеру с молекулами растворителя (10"³ мкм и менее, или до 1 нм). Здесь вещества разделяются вследствие различных скоростей диффузии через мембрану.

Осмос относится к разряду молекулярно-диффузионных про- цессов, когда через мембрану переносится не вещество (из области высокой концентрации в область низкой концентрации), а раство- ритель. Если заставить двигаться растворитель в обратном направ- лении через мембрану, то это и будет обратный осмос. Превысить осмотическое давление в подобных случаях удается с помощью внешнего повышенного давления. Обратный осмос рекомендуют обычно для понижения концентрации молекул или ионов в водных растворах (таблица 28).

В случаях стерилизации растворов фильтрованием они должны содержаться перед розливом и при последующем розливе в асеп- тичньгх условиях. При этом необходимо помнить и следить за тем, чтобы время между началом приготовления раствора и его стери- лизацией фильтрованием должно быть возможно кратким.

Для очистки растворов от бактерий-контаминантов в США, например, выпускают в продажу так называемый Спи Сар-капсу- лы, содержащие двойной слой гидрофильной полисульфоновой микропористой (диаметр пор 0,2 мкм) мембраны, обеспечивающей задерживание бактерий при высоком потоке жидкости.

Если применяют какой-либо газ для очистки раствора, то он перед использованием должен подвергаться фильтрующей стери- лизации.

В случаях, когда целевой продукт в виде раствора или жидкости нельзя стерилизовать упакованным в контейнеры, то его фильтру- ют через стерильный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. При обнаружении вирусов и/или микоплазм в растворе (жидко- сти), стерилизуемом (-ой) фильтрованием необходимо предусмот- реть возможность использования дополнительного метода стери- лизации (физического или химического).

Нельзя применять асбестовые фильтры для стерилизации инъ- екционных лекарственных форм.

Т а б л и ц а 28. Некоторые области практического применения мембранной фильтрации

Процесс рабочее давление, МПа	Проходящие через мембрану вещества	Частицы и вещества, задерживающиеся мембраной	Области использования
Микрофильтрация, 0,05	Вода, растворенные вещества	Суспендированные и коллоидные, частицы, бактерии и другие микробы размером более 0,1 мкм	Стерилизация растворов в биотехнологичес- ких и химико- фармацевти- ческих производствах, в бактериологич. анализах, при разделении веществ
Ультрафильтрация 0.5	Вода, растворенные неорганические вещества	Бактерии, коллоидные и суспендированные частицы размером более 10" мкм, растворенные органич. полимеры с ММ 1 кДа	Очистка растворов биополимеров, концентриро- вание, фракциони- рование, освобождение от пи ро генов (депироге- низация)
Обратный осмос 5	Вода, растворенные высоко полярные низкомолеку- лярные вещества	Бактерии, вирусы, суспендированные и коллоидные частицы, растворенные неорганические вещества, органические вещества с ММ 0,2 кДа	Концентриро- вание растворов в биотехнологии, глубокое обессоливание воды и т. д.

Любой фильтр, используемый для стерилизующей фильтрации, не должен качественно и количественно изменять конечный про- дукт (в том числе и антибиотическую активность культуральных жидкостей после их стерилизующей фильтрации через батареи фарфоровых свечей).

Качество мембран проверяют обычно биологическим методом, используя для этого виды из родов Рвеийошопаз и Зеггаиа.

При всех положительных качествах стерилизующей фильтра- ции через мембраны нельзя не отметить и недостатки этого способа, к которым относятся: адгезия частиц к мембранам, нео- днородность пор по диаметру ("абсолютных" мембран по стерили- зующей эффективности не существует, но стерильность может быть достигнута и достигается вследствие наложения других при- чин, например, адсорбции частиц на мембране), удержание части стерилизуемой дорогостоящей жидкости на мембране при фильт- рации малых объемов ее, а также возможная селективная адсор- бция ионов (чаще — катионов) из небольших объемов растворов, недостаточная или плохая смачиваемость мембран водой и др. К тому же по-прежнему актуальной остается проблема вирусного загрязнения БАВ и очистки БАВ от вирусов. Ситуация, связанная с очисткой биопродуктов от вирусов, обострилась еще и потому, что появилось сообщение о контаминации гормона роста человека, получаемого из гипофиза, "медленным" вирусом болезни Крейтц- фельда-Якоба, и это на фоне возрастающей роли ретровирусов (включая ВИЧ). Как следствие — усилилась настороженность к препаратам из крови, гормонам, экстрагированным из тканей млекопитающих; рекомбинантным белкам, образуемым культиви- руемыми клетками животных. Более того, ряд вирусов животных являются патогенными для человека (зоонозные вирусные инфек- ции).

Потенциальная контаминация названных выше продуктов воз- можна из различных источников: от лиц, чьи клетки используются в биотехнологических процессах; от миеломных клеток, применя- емых для получения гибридов; из питательных сред для культиви- рования клеток млекопитающих, из реагентов, используемых для очистки белковых продуктов, например, моноклональные антите- ла; наконец, несоблюдение требований СМР.

Принятая проверка инактивации вирусов-контаминантов в био- продуктах заключается в их температурной или химической обра- ботке. Однако эти методы не универсальны. К тому же выявление вирусов базируется не только на дорогостоящих, но и мало чувст- вительных процедурах. Корпорация "МШгроге" разработала тех- нологию так называемой наноселективной фильт- рации с включением вирусудаляющего модуля (Угге8о1уе/70),

снабженного уникальной запатентованной мембраной. Эта техно-

256

логия значительно отличается от технологий с использованием ультрафильтрационных мембран, хотя бы, например, тем, что в модуле не предусматривается применение открытой матриксной поддерживающей структуры, а поры уникальной мембраны иск- лючительно малы, благодаря чему проявляются отличные качества ее по задержке вирусов размерами от 23 нм и выше. За этими пределами остаются тогавирусы (18 нм) и вироиды (15 нм). К тому же однообразный матрикс мембраны обеспечивает эффективный поток жидкости и ее физическую стабильность. Модуль предназ- начен для фильтрации белковых растворов. Они (модули) выпу- скаются с мембранами разных размеров, в зависимости от объемов фильтруемых растворов. В промышленном модуле применена мем- брана с площадью 0,92 м² для фильтрации нескольких сотен литров.

Воздух, подаваемый в ферментаторы, должен быть чистым и стерильным. В этих случаях еще используют и другие фильтрую- щие материалы, которыми заполняются общие и индивидуальные (для каждого ферментатора) фильтры, например, из перхлорвини- ла (в фильтрах Петрянова — ФП), стекловаты и др. Профильтро- ванный воздух сжимается в компрессорах, охлаждается в тепло- обменнике, поступает в ресивер (от англ. геаеуег — емкость), устраняющий пульсации воздуха, из которого через брызгоулав- ливатель проходит общий и индивидуальный фильтры, и только после этого поступает через барботер в культуральную жидкость.

Питательная среда перед засевом каким-либо биообъектом также должна быть стерильной. В таких случаях прибегают к тепловой стерилизации, заботясь при этом о сохранении стабиль- ности ингредиентов среды. В микробной биотехнологии обычно используют методы периодической и непрерывной стерилизации. Первую из них осуществляют в аппаратах малой емкости непос- редственно в ферментаторах глухим или острым паром лод давле- нием в течение 30—40 мин. при температуре порядка 134°С (2,02650х10⁵ Па) после удаления воздуха из аппарата при нагреве до 100°С. Затем среду охлаждают водой через змеевик или рубашку аппарата и засевают тем или иным биообъектом.

Метод непрерывной стерилизации основан на том, что концен- трат питательной среды подают насосом через систему конструк- ций, включающую нагреватель, выдерживатель (собственно сте- рилизатор) и теплообменник (охладитель, в котором охлаждение среды происходит до температуры, оптимальной для культивиро- вания клеток).

9 т. 8524 ²⁵⁷

В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и некоторых других объектов осуществляют в автоклавах. Стерили- зацию проводят паром под давлением, соблюдая необходимые режимы (табл. 29). В отдельных случаях прибегают к сухожаровой стерилизации.

Таблица 29. Режимы стерилизации

1°, °С	Паром под давлением		Сухим жаром,
	время, мин.	давление, Па (атм.)	время, мин.
121 126 134 140 150 160 170	15 10 3	1,01»10^5(1) 1,414»10^5 (1,4) 2.02.10^5 (2)	180 150 120 60

Различные материалы по-разному влияют на рост и развитие биообъектов, к тому же — не все из них можно подвергать автоклавированию (таблица 30).

Таблица 30. Влияние некоторых материалов на рост клеток в культурах и возможность их стерилизации паром под давлением

(выборочно)

Из приведенных в таблице 30 данных видно, что лишь немногие перечисленные материалы могут быть использованы в биотехно- логических процессах-, оставаясь нейтральными в отношении био- объектов (резина пищевая, с оговорками — фторопласт).

Названные выше методы обеспложивания относят к числу наиболее распространенных, однако, учитывая необходимость сте- рилизации весьма широкого ассортимента различных материалов, приходится прибегать и к другим способам. Этим подтверждается то положение, что универсальных методов стерилизации не суще- ствует.

- Термолабильные материалы, например, не могут подвергаться тепловой стерилизации и тогда можно использовать холодную химическую стерилизацию, или газовую стерилизацию этиленок- сидом (температура его кипения + 12,5°С)

Этиленоксид (окись этилена) относится к раз- СН, СН ряду химических веществ, неспецифически губи- \ / ^ тельно действующих на различные микроорганиз- О

мы — вегетативные клетки бактерий и грибов, бактериальные споры и грибные конидии, вирусы. Стерилизуемые при этом объекты не должны вступать во взаимодействие с этиленоксидом и должны быть нейтральными, хорошо очищенны- ми, при необходимости — продезинфицированными, соответству- юще упакованными. Не рекомендуется использовать для упаковки пергаментную бумагу, стеклянную и металлическую тару, шелко- вые ткани и некоторые другие, не пропускающие этиленоксид. Упаковка должна обеспечивать диффузию газа и водяных паров к стерилизуемому объекту. В упаковку вкладывают индикатор (на- пример, лакмусовую бумагу, изменяющую свой цвет из желтого в синий при достижении стерильности; это — индикатор типа 1—21 производства "Медикор", Венгрия) и сертификат с указанием • номера серии стерилизации и гарантийный срок хранения (обычно — в течение Года) в стерильном состоянии, после чего ее помещают в полиэтиленовый пакет.

После стерилизации этиленоксидом упаковки выдерживают на предмет испарения газа. Для этого используют проветривание при температуре не' ниже 20°С в течение 4—5 суток, удаление газа в рабочей камере циркуляционного парового стерилизатора при 52—55°С в течение 3—4 суток, удаление газа с помощью проточного вакуума (остаточное давление 101—101,2 кПа) при 52—55°С в течение 2-3 суток.

Этиленоксид - токсичный газ, поэтому простерилизованные с

его помощью объекты и надлежащим образом проветренные хра- нят в специальном помещении.

Эффективность такой стерилизации определяется следующи- ми параметрами: концентрацией окиси этилена, давлением смеси газов, влажностью, температурой и временем стерилизации. Сте- рилизацию проводят в специальных газовых стерилизаторах раз- личной емкости (например, 20—25 л) с длительностью разовой стерилизации при этом до 5 часов, поддерживая температуру 50 ± 8°С (323± 8°К) и концентрацию этиленоксида около 750 мг/л (17,04 моль/м³). Запрещается выводить газовую смесь после стери- лизации в вентиляционную шахту; она не должна попадать в другие помещения; ее следует собирать в виде конденсата.

В некоторых случаях применяют для стерили-

СН₂ СН₂ зации р-пропиолактон, который отличается высо-

| | кой реакционной способностью и, например, лег-

0 ко взаимодействует с аминами и многими другими

веществами. В малых концентрациях он губитель- но действует на вирусы, бактерии и грибы, особен- но — при повышении температуры, однако водные растворы его быстро инактивируются при комнатной температуре. Р-Пропио- лактон токсичен для кожи, агрессивен в отношении некоторых металлов и многих пластмасс, в повышенных концентрациях про- являет свойства мутагена. Поэтому в биологической технологии его не следует применять в качестве стерилизующего агента.

В лабораторных и производственных условиях иногда приме- няют ультразвуковые установки, например, для мойки посуды (частота звука здесь выше 20000 щ). В случае распространения звука в воздухе за нулевую отметку принимают порог нормальной слышимости 1000 гц. Более высокие величины оценивают в деци- беллах — дц [от франц. <1еаЪе1 — единица акустической (электри- ческой) мощности, равная 0,1 бела и принятая в электроакустике], й если этот показатель выше ЮОдд, то звук оценивается вредным для людей и от такого звука следует экранировать занятых в соответствующих производствах операторов (особенно — при длительном воздействии). Ультразвук можно использовать для выделения некоторых действующих веществ из растений (напри- мер, алкалоиды), антигенов из некоторых бактерий.

Тем не менее, ультразвуковые генераторы не нашли широкого, распространения в биотехнологии, хотя в отдельных исследовани- ях было показано, что с помощью ультразвука можно стимулиро-

260

вать рост клеток, гасить пенообразование в биореакторах при ферментациях и т. д.

Для обработки стен некоторых помещений, мебели — можно использоватькатионные поверхностно-активные вещества—ПАВ, проявляющие губительное действие в отношении широкого спек- тра микроорганизмов. Растворы ПАВ можно применять не только для протирания стен и мебели, но, например, в боксированных помещениях заблаговременно распылять в виде аэрозолей (до прихода оператора).

Во избежание микробного загрязнения биотехнологических производств используют и специальные меры, как то медицинский осмотр персонала работниками медицинской службы предприятия и СЭС в целях выявления заболевших и носителей патогенной и условно патогенной микрофлоры и для исключения микробного загрязнения ими целевых продуктов; контроль за водоснабжением, особенно — на тех производствах, в которых воду забирают из открытых водоемов; предупреждение попадания микробов в скла- ды готовой продукции — здесь наиболее эффективен способ подачи воздуха через приточные вентиляционные устройства, в которых предусмотрена фильтрация поступающего воздуха в складские помещения.

6.4. Биотехнологические процессы в связи с массообменом. Принято считать, что диффузионные процессы, протекающие в биореакторах, не накладывают заметных ограничений на макси- мально проявляющуюся функциональную активность клеток и клеточных структур; главное при этом — поддержание массооб- мена (и прежде всего — кислорода в системе "газ-жидкость" применительно к аэробным организмам) на оптимальном уровне.

При выращивании биообъекта в реакторе образуется сложная система массопереноса О2, а именно - "газ-жидкость-твердое тело", понимая под твердым телом биообъект. Названная тройная система легко расчленяется на три самостоятельные системы: "газ-жид- кость", "жидкость-жидкость" и "жидкость-твердое тело". Это мож- но продемонстрировать следующим образом (рис. 77).

Перемещение О2 в этих системах неравноценно по интенсив- ности и зависит от растворимости газа в жидкой фазе, от мощности барботажа, размера пузырьков, скорости вращения вала и формы мешалки, химического состава питательной среды, температуры, толщины невозмущаемых слоев жидкости вокруг газового пузырь- ка и клетки, от наличия и химического состава капсул, толщины и особенностей клеточной стенки и клеточной мембраны биообъ- екта и некоторых других причин.

Рис. 77. Системы, образующиеся в биореакторе (8) при массопереносе кислорода (1) из среды (4) в клетку-продуцент (5); 2 — невозмущаемый слой жидкости, 3 — пограничная область раздела фаз "газ-жидкость", 6 — пограничная область раздела фаз "ж"идкость-твердое тело", 7 — условный путь перемещения Ог в системе "жцдкость-жидкость" от (1) до (5), где он расходуется в биохимических реакциях.

Из рис. 77 можно сделать вывод, что зона 2 вокруг клетки может не формироваться в случаях образования ее вокруг пузырька и клетки одновременно. Тогда и путь перемещения О2 от газового пузырька в клетку сокращается, а его содержание в жидкой фазе (4) не будет коррелировать со скоростью поступления его в клетку для поддержания реакций биологического окисления (в ряде слу- чаев О2 выступает химическим реагентом, обеспечивающим био- трансформацию, например, глюкозы в 5-кетоглюконовую кислоту с помощью уксуснокислых бактерий). Следует иметь в виду, что при избытке растворенного кислорода проявляется его токсиче- ское действие на биообъект. Вот почему желателен автоматический контроль за поддержанием оптимальных концентраций О2 в среде для соответствующих культур. Теперь известны РО-статы (прибо- ры для поддержания необходимого уровня растворимого Ог), обеспечивающие подобный контроль.

Если молекула кислорода приобретает дополнительный (экс- тра-) электрон, то образуются свободные кислородные радикалы: супероксидный (Ог), гидроксильный (НО) и синглетныйкислород ('Ог). Эти радикалы — потенциальные деструкторы липидов, бел- ков, нуклеиновых кислот. В частности, к ним чувствительны кле- точные мембраны, в которых первичной мишенью выступают липиды, протоны которых взаимодействуют с.радикалами и насту- пает так называемая "липидная пероксидация" с образованием пероксидов. Свободнорадикальное повреждение мембраны схема- тично представлено на рис. 78.

ООН ^/ \} Рис- ?8. Поперечный срез клеточной

{Г~^- —^ (ГГ!"" /6) ^мемоР^аны. повреждающейся от свобод-

д1~ \о 4 но-радикальных процессов, индуцируе-

д^Т^-Э *—/ мых супероксидным и гидроксильными

^^«тгадаб^, ОН ^""4^^ ' радикалами, синглетным кислородом: 1 —

■ с" МЯ 5 ядро, 2 — нарушенные белковые нити, 3

\}ч&~^г' ^5 V еа ⁴ — перекрестное связывание липидов, 4

^ г¹ 1 <\ ц\ — липидно-протеиновое перекрестное

•а ^- 4 / связывание, 5 — поврежденный мемб- .

ранный липид.

Известно, что с возрастанием температуры окружающей среды растворимость кислорода в воде уменьшается. Так, например, при 35°С и давлении кислорода в воде 1,01 • 105 Па его растворимость составляет 1,09 ммоля/л или в соотношении 1:28600; при 20°С растворимость возрастает до 1,38 ммоля/л или в соотношении 1:22640; при 14°С в воде растворяется 1,5 ммоля/л О2 или в соотношении 1:21000. В одномолярном растворе натрия хлорида при 25°С растворяется 0,89 ммоля О2А или в соотношении порядка 1:35000.

Таким образом, для переноса кислорода из одной фазы в другую (см. рис. 77) необходимо добиться разницы его концентрации в разных фазах с преобладанием в направлении слева направо, то есть от газового пузырька к клетке. Но поскольку растворимость О2 в воде и водных растворах мала, постольку необходимо подавать его в биореактор в несколько повышенных количествах, добиваясь указанной разницы в фазовых системах. При этом достигается некая критическая концентрация кислорода в культуральной сре- де, когда все аэробные клетки насыщаются О2. Для клеток микро- организмов показатели таких концентраций приходятся на диапа- зон 0,003—0,05 ммоля/л (примерно 0,1—10% наибольшей раство- римости О2 в воде) или, применительно к воздуху, от 0,5 до 50%-го насыщения. Так, для клеток кишечной палочки критическая кон- центрация растворенного кислорода составляет 0,0082 ммоля/л при 38°С, для пеницилла — продуцента пенициллина при 24°С — около 0,022 ммоля/л, для Засспаготусез сегелаз1ае при 20°С - 0,0037 ммоля/л.

Для некоторых нитчатых грибов, например, Мутохпесшт уегшсапа, удельная потребность в кислороде становится наивыс- шей в начале Ьод-фазы размножения клеток, хотя плотность

263

клеточной биомассы продолжает нарастать. В то же время общая потребность в Ог достигает максимума в конце Ьод-фазы и начале сопзг-фазы, то есть удельная скорость размножения клеток дости- гает своего пика раньше, чем скорость использования О2.

Скорость переноса кислорода (О02) рассчитывают на единицу объема биореатора, исходя йз отношения произведения плотности потока и площади поверхности раздела фаз (газ-жидкость) к

_ К1(С,-С1)А

объему жидкой фазы в реакторе, то есть Оо₂ = у , где Ю

• коэффициент массопередачи, С/ — концентрация растворен- ного вещества в жидкой фазе, находящейся в равновесии с газовой фазой, А — площадь поверхности раздела фаз "газ-жидкость", V

• объем жидкой фазы. Если весь кислород, поступающий в жидкую среду, быстро усваивается клетками, тогда С/=0 и мас- сообмен кислорода здесь максимален.

Средняя объемная скорость поглощения О2 (С/Ог моль*с/л) в объеме V выражается уравнением:

V

о

Когда гидродинамические условия в биореакторе, концентра- ция О2 и отношение площади поверхности раздела фаз к объему одинаковы, тогда Оо₂ равна Ось-

Обычно при вполне благоприятном аэрировании среды кон- центрация клеток в биореакторе может достигать величины 10⁸ /мл. Исходя йз усредненных размеров клеток бактерий по диамет- ру 1 мкм, дрожжей — 7 мкм, нитчатых грибов » 20 мкм объемы их в процентах к объему среды составят около 0,005, 1,8 и 2 соответственно, то есть бактериальная масса будет примерно в 400 раз меньше грибной массы. Удельная поверхность раздела всех клеток будет 3,1 см²/см³ - для бактерий, 153 см²/см³ - для дрожжей и 40 см²/см³ — для нитчатых грибов. Следовательно, эффективная поверхность в данных примерах будет больше у дрожжей. Поэтому адекватная доставка кислорода — как лимитирующего фактора зависит от морфофункциональных особенностей культивируемого биообъекта и условий его выращивания.

На скорость потребления кислорода биообъектом влияют:

1. возраст культуры (делящиеся, или размножающиеся клетки потребляют кислорода больше, чем не делящиеся);

2. межклеточная адгезия, когда при выраженной адгезии обра-

зуются аггломераты, или комочки клеток, и, напротив, при малой или совсем не проявляющейся адгезии клетки находятся в "изоли- рованном состоянии друг от друга; в первом случае потребление кислорода уменьшается в сравнении с вторым, когда клетки обла- дают большей площадью своей поверхности;

3. от быстроты динамических изменений в среде выращивания биообъекта (например, в производстве экзополисахаридов, проду- цируемых аэробными микроорганизмами, заметно возрастающая вязкость среды снижает поступление О2 к клеткам);

4. скорость накопления биомассы клеток — чем больше био- масса, тем скорость поглощения кислорода быстрее снижается, то есть зависимость здесь обратно пропорциональная;

5. качество источников питания, подлежащих окислению. Для сравнения можно назвать такие источники углерода, как глюкоза и предельные углеводороды из нефти. Молекулы глюкозы в пита- тельной среде и в клетках одинаковы, так как степень восстанов- ленности атомов углерода в данных молекулах одинаковы. Поэтому и отношение потребленного кислорода к количеству превращен- ной глюкозы меньше, чем это имеет место в случае использования углеводородов;

6. пеногасители, добавляемые к вспенивающимся культураль- ным жидкостям в процессе выращивания некоторых биообъектов. Так, например, натрия лаурилсульфат в концентрации 10 млн снижает коэффициент массопередачи О2 на 56% (в сравнении с водой);

7. продукты метаболизма, например, секретируемые белки, также снижают массопередачу кислорода.

Действие всех перечисленных факторов проявляется во време- ни и сказывается не только на показателях массообмена, но и теплообмена — ферментации протекают в растворах неньютонов- ских псевдопластических жидкостей. В биотехнологических про- цессах теплообмен — постоянно учитываемый и контролируемый фактор — либо требуется подача тепла, например, в случаях стерилизации питательных сред или при культивировании анаэро- бов при 55—56°С (биологическая обработка отходов в бескисло- родных условиях), либо, напротив, необходим отвод тепла, обра- зующегося в биореакторах, в которых выращивают аэробные клетки. В этих целях пользуются рубашками аппаратов, в которые подается горячая или холодная вода, змеевиками, вмонтированны- ми внутри аппаратов, "выносными" теплообменниками и др. Вза- имосвязь скоростей отвода и образования теплоты описывается

265

уравнением с?= 11ААТ, где О—теплота, 11—общий коэффициент теплообмена, А—площадь поверхности теплообмена, АТ—харак- терная межфазная разность температур между культуральной жидкостью и нагревающей (охлаждающей) жидкостью. Под общим коэффициентом теплообмена (17) понимают количество теплоты, передаваемое в единицу времени через единичную поверхность при разности температур в 1°С. Поэтому и теплообмен в общем виде можно определить как перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами в биореакторе. Теплообмен зависит от ряда факторов:

1. ламинарного или турбулентного движения теплоносителя,

2. толщины и качества материала стенок биореактора,

3. вязкости среды,

4) скорости потока при полунепрерывном и непрерывном способах культивирования биообъектов,

5) характера охлаждения биореактора.

Познание этих факторов является необходимым для констру- ирования оптимальных биореакторов и наиболее выгодного про- ведения биотехнологических процессов.

Массообмен в биологических системах связан не только с доставкой кислорода к клеткам аэробных видов и теплообменом, но и с выделением диоксида углерода как конечного продукта различных катализируемых реакций, транспортом других веществ через клеточные мембраны (в том числе — анаэробных организ- мов).

Диоксид углерода может находиться в четырех различных формах, с различной степенью растворяясь в воде: СОз", НСОз, НгСОз и СО2. Растворимость СОг зависит от рН жидкости и он переносится через границу раздела фаз "газ-жидкость" лишь в растворенном виде.

Для оценки газообмена при культивировании отдельных био- объектов, а также в целях контроля за микробами — загрязните- лями зерна, пищевых продуктов, других жидких и плотных мате- риалов используют специальное оборудование типа "О2/СО2 ре- спирометров", в том числе — с компьютерным контролем (напри- мер, "Микро-рксимакс О2/СО2 респирометр" фирмы СоштЬик 1пБ1гитеп1Б, США).

Транспорт питательных веществ через мембраны клетки осу- ществляется различными путями в системах "жидкость-твердое тело": простой (пассивной) диффузией, облег-

266

ченной диффузией и благодаря активному транспорту, ау ряда эукариотических организмов — с помощью эндоцитоза. В нормальном состоянии мембрана непро- ницаема для большинства полярных молекул, но некоторые газы (СО2, N2) и водные растворы многих веществ свободно диффун- , дируют через мембрану благодаря соответствующим концент- рационному и электохимическому гради- ентам. Градиент концентраций - это разность концентраций, а диффузия — суммарное перемещение вещества, зависимое от градиента концентраций. Электрохимический потенциал склады- вается из суммы зарядов диффундируемых веществ. Электроны медленно проходят через мембрану, и чем больше их заряд, тем меньше транспорт.

■ При пассивной диффузии молекула растворенного вещества не изменяет свою первоначальную молекулярную форму. Значе- ние свободной энергии (ДС7) при этом всегда отрицательно.

О ■

АС = КТЬп-^ , где С1 — область пониженной концентрации

вещества, С2 — область повышенной концентрации вещества. Ионизированные й полярные молекулы, плохо растворимые в полярных растворителях, обычно не транспортируются через мем- брану пассивной диффузией- Для этого существует механизм облегченной диффузии, или сопряженного транспорта, когда ве- щество связывается с молекулой-переносчиком, локализованной на наружной поверхности мембраны. Образующейся комплекс достигает внутренней поверхности мембраны, где и разъединяется, перенеся молекулу вовнутрь клетки.

Облегченная диффузия осуществляется при участии мембран- ных пор, генерирующих ион-проводящие пути; ионофоров-пепти- дов, формирующих ионные каналы (например, декапептиды— антам анид у базидиомицетов, грамицидин С у некоторых бацилл и др.); интегральных и периферических мембранных белков, дей- ствующих взаимосвязанно (например, пермеазы и др.).

Транспорт веществ при облегченной диффузии протекает не линейно (как при пассивной диффузии), а с определенным уровнем насыщения (тахптшт), после которого возрастание разности кон- центраций вещества не сказывается на скорости его переноса. Этот вид транспорта кинетически сходен с ферментативным ката- лизом.

Система активного транспорта через мембрану является энер- гозависимой. Она включает фермент АТФ-азу, белки-переносчики

267

различных веществ, фосфолипиды. АТФ-аза проявляет активность в присутствии фосфолипидов. Активный транспорт подразделяют на первичный и вторичный. Энергия для первого поставляется одним их двух способов:

1. когда транспорт сопряжен с одновременным прохождением через мембрану второго вещества, движущегося по градиенту концентраций и в том же направлении, что и первое вещество — симпорт, или в обратном направлении — антипорт; свободная энергия (ДС) этого процесса большая и отрицательная величина;

1. когда энергия поставляется за счет сопряженного гидролиза АТФ или какого-либо другого высокоэнергетического соединения (фосфоенолпируват, карбомоилфосфат, 1,3-дифосфоглицерат и др.). Этот способ называют насосом (АС) здесь положительная величина) (рис. 79).

За счет работы систем первичного активного транспорта на мембране создается градиент ионов, прежде всего — протонный

ЗЫа⁺ к*- АТФ - аза

АТФ

потенциал Лр7-Г, который индуцирует вторичный активный транспорт—пе- ренос с помощью белков-переносчи- ков (в частности, пермеаз) аминов, аминокислот, Сахаров и других ве- ществ (например, М-белок у Е. соИ является компонентом трансфераз- ной системы, и он переносит Р-галак- тозиды, и т. д.).

Рис. 79. Мембранная Ыа-1

К+—АТФ-аза (N3-1 К-1 на- сос), участвующая в активном транспорте катионов (1—олиго- сахариды, 2—периферические белки, 3—трансмембранные бел- ки, 4—периплазматическое про- странство или внеклеточная сре- да, 5—мембрана, 6—цитоплазма).

Функции системы активного транспорта: поддержание постоянст- ва концентраций метаболитов незави- симо от колебаний содержания их во внешней среде; стабильное поддержа- ние оптимальных концентраций неор- ганических ионов как кофакторов ферментативных реакций и для" акти- вирования других процессов; извлечение из окружающей среды необходимых веществ даже при низкой их концентрации; регуля- ция метаболизма.

Массообмен для многих веществ в различных системах еще далеко не изучен полностью и здесь биологическая технология имеет резерв совершенствования биотехнологических процессов в целях достижения более высокого выхода конечных продуктов.

'268

6.5. Биотехнологические процессы в связи с особенностями метаболизма клеток. Процессы в биохимической технологии в большинстве своем базируются на использовании продуктов вто- ричного метаболизма. Даже в тех случаях, когда преследуют цель промышленного производства биомасс *л клеток или тканей, опти- мизация условий ее выращивания также основывается на знаниях особенностей метаболизма тест-культур. Эффективность накопле- ния такой биомассы по-прежнему оценивается экономическим коэффициентом (ЭК), то есть отношением веса сухой массы клеток (ткани)-У к весу потребленного углевода (Сп). Величину экономи- ческого коэффициента выражают в процентах, и она, как правило, обратно пропорциональна концентрации сахара: ЭК%=У/Сп100.

Известно, что метаболизм различных организмов включает реакции анаболизма, амфиболизма и катаболизма. .Анабо- лизм (от греч. апаЪо1е — подъем) — это синтез веществ клетки; амфиболизм (от греч. атй—оба) объединяет реакции промежуточного обмена; катаболизм (от греч. са1аЪо1е —сбрасывание, разрушение] — расщепление веществ. В связи с энергетикой процессов первый и второй из них протекают с потреблением энергии, третий — с выделением энергии. Поэтому метаболизм в целом можно подразделить на энергетический и конструктивный. Энергия выделяется при брожении и дыхании, а потребляется в реакциях синтеза нуклеиновых кислот, белков, углеводов, липидов, их конъюгатов, при активном транспорте различных веществ через клеточные мембраны, и т. д.

Все организмы, использующие энергию солнечного света, на- зывают фототрофными; организмы, использующие энергию при окислении химических веществ, называют х.е м о т р о ф- н ы м и.

Реакции обмена веществ у прокариот и эукариот (акариоты не обладают собственным обменом веществ) катализируются фер- ментами, число которых в клетке может достигать 1,5—2 тысяч.

Скоординированные биохимические и биофизические процес- сы размножения, роста и развития клеток в конкретных условиях среды обитания и составляют сущность обмена веществ, или метаболизма. Наличие большого количества ферментов в клетках различных организмов обеспечивает им широкий диапазон адап- тивных, или приспособительных возможностей (хотя и не безгра- ничный). Среди различных групп организмов наиболее лабильны- ми являются одноклеточные виды и, прежде всего, бактерии и дрожжи. Высшие животные и растения имеют собственные меха-

269

низмы для поддержания своего, гомеостаза (от греч. огпоюб—подо- бный, одинаковый, 51а815—неподвижность, состояние), то есть динамического постоянства состава й свойств внутренней среды, а это значит, что при заметных отклонениях в среде обитания наступают отклонения от нормы либо в их структуре, либо в функциях (признаки патологии, или болезни).

Следовательно, кроме обеспечения тест-организмов питатель- ными веществами им необходимы более или менее постоянные условия функционирования в заданном направлении (накопление биомассы или метаболитов), в частности, стабильность температу- ры, снабжение или, напротив, исключение Ог, поддержание рН на определенном уровне.

Все биохимические реакции, катализируемые ферментами, не выходят за пределы классических законов термодинамики, и к ним (как и к чисто химическим системам) приложим принцип ле Шателье — равновесная точка системы смещается в направлении . уменьшения эффекта произведенного воздействия. Очевидно, что "метаболическое разнообразие-' определяется не столько механиз- мами реакций, а сколько ферментным набором в клетках различ- * ных организмов и подходящими условиями для их проявления, то есть первичными здесь являются ферменты, а вторичными — катализируемые ими реакции. .

Метаболизирующие клетки ограничены сроком выживания в конкретной среде обитания, а после отмирания в природе они подвергаются разложению и минерализации. Если Проследить за круговоротом веществ, входящих в состав клеток, то можно выде- лить определенную цикличность процессов для азота, углерода и других биоэлементов. Метаболизм детально рассматривается в курсах биологической химии и химической микробиологии.

Микроорганизмы, например, из рода ВасШиз, продуцирующие активную фосфатазу, превращают мало растворимые фосфаты в растворимые и легко доступные другим организмам, у которых он включается в состав нуклеиновых кислот, некоторых макроэрги- ческих соединений (например, АТФ) и др.

Выдающаяся роль серы в живых организмах обусловлена ти- ольными группами, которые в составе серусодержащих аминокис- лот участвуют в формировании и стабилизации третичных струк- тур белковых молекул.

Зная пути и механизмы превращения различных веществ, мож- но использовать отдельные процессы в практических целях либо для получения метаболитов, либо клеточной массы.

Трансформация различных веществ в природных или искусст-

270

венных условиях сопряжена с расходованием и накоплением энергии. Основными источниками энергии для живых существ является солнечная радиация, углеводы; только для прокариот — Нг, СОг, N113, N2 и его неорганические производные (Нг5, ЫагЗгОз, 50?Л, а также Ре²⁺. К первичным генераторам энергии, в которых происходит преобразование световой и химической энер- гии в доступную клеткам форму, относятся бактериородопсин, редокс-цепь фототрофов и дыхательная цепь. Все эти генераторы локализованы в мембранах (в пурпурных мембранах у галобакте- рии, в хроматофорах фотосинтезирующих бактерий, в тилакоидах у цианобактерии, в хлоропластах у водорослей и растений, цитоп- лазматической мембране у прокариот, и внутренней мембране митохондрий у эукариот). Под "редокс-цепью" понимают последо- вательность переносчиков восстановительных эквивалентов с лю- бым акцептором этих эквивалентов, кроме О2; "дыхательная цепь" — это последовательность переносчиков восстановительных экви- валентов с кислородом в качестве их конечного акцептора. Функ- ционирование "дыхательной цепи" всегда сопряжено с генерацией энергии, доступной для клетки, тогда как у "редокс-цепи" эта функция может отсутствовать. У фототрофных, или фотосинтези- рующих организмов возможны следующие окислительно-восста- новительные системы (рис. 80 а, б)

свет (1гу) свет (Ъу)

Г т

Д хлорофилл Ег) (р} хлорофилл Ег),

/ / _Нгд _А

/ растения, \ i /

\« данЖ $*«р« кофактор ! цитохром

\ ^тер™ #адф₊р ²Т ад^н®

кофактор надф*-5надф растения,

(атф)»адф+р+э восст. водоросли,

, _ч , „ бактерии

(а) (б)

Рис 80. Схемы окислительно-восстановительных процессов при цикличном (а) и нецикличном (б) фосфорилировании; НгА соответствует НаО — у растений и водорослей, Нг, Н гЗ или разные органические вещества — у других фотосинтезирующих аноксиген- ных бактерий.

У хемотрофных, или хемосинтезирующих видов набор окисли- тельно-восстановительных систем шире:

1) доноры водорода — неорганические вещества (литотрофия); акцепторы водорода:

а) кислород (аэробное дыхание)

271

№5 ► 5 - 50|" (Ведд1а1оа, ТпюЪасШив)

+ 20 _ ' ■ ■

N1+3 —- N02 (Мгговотопаз)

+ 0

N02 —► N03 (М1тоЪас1ег)

Ре²⁺ . Ре³⁺ (ЬерхоШпх)

+0

Н2 ► НгО (Нуйгодепотопав)

+ 0

СО ► СОг (СагЪохусютопаз)

б) -неорганические вещества (анаэробное дыхание): N03, 50?Г, СОз"

Н₂ ► НгО

} некоторые водородные бактерии

N03 ► N2

Н₂ — ► НгО

} некоторые виды Оевшгоуюпо

50₄-_ . Н₂0

Н₂ ► н₂о

} некоторые метаногенные бактерии

СО$ ►СН₄

4Н2.+ СО2 ► СНз СООН + 2НгО СЬвтпйшт асеисшп

5 ► 50₄-

} ТшоЪасШив шитпсапб • ■

N03—N2

2) доноры водорода — органические вещества (органотрофия); акцепторы водорода:

а) кислород (аэробное дыхание); в эту группу относят все гетеротрофные организмы, которые могут использовать органиче- ские вещества в качестве доноров водорода;

б) неорганические вещества (анаэробное дыхание): N03, 50?Г, СОз~

N03 ► N2 денитрификаторы

N03 ► N^13 нитратредуцирующие бактерии

50?Г ► Н₂5 ОевилотЛпо

СОз" »СН4 метаногенные бактерии

в) органические вещества (брожение); сюда относят все виды бродильных процессов (молочнокислое, маслянокислое, спиртовое и др.). ...

Уравнение, с помощью которого описывают взаимоотношение энергетических компонентов, включает общую энергию системы, или энталпию (Н, в Джоулях), меру разупорядоченности системы, или энтропию (5, в Джоулях/градусы) и свободную энергию системы (С, в кДж/моль), представляется в следующем виде:

С = АН — ТАЗ (Т— абсолютная температура),

С АТФ = —30,564 кДж/моль.

В большинстве случаев изучение энергетического метаболизма сводится к оценке продукции АТФ и трансмембранного потенциала (Ац^Г), пороговая величина которого, необходимая для окислитель- ного фосфорилирования, составляет 180—270 мВ; ДдгТ формиру- ется на клеточных мембранах у различных организмов (кроме облигатных анаэробов).

Клетки, как правило, метаболизируют при изотермических условиях и значительная часть энергии ими не используется (в противном случае мог бы возникнуть перегрев системы) — она теряется. При этом возрастает энтропия, и клетки могут погибнуть. Смерть — это большая положительная величина энтропии, тогда как негативная величина ее и упорядоченность — это жизнь.

Суммируя дыхательные процессы, сопряженные с получением энергии, приводим таблицу 31, в которой отражены основные типы дыхания и указаны представители, "ведущие" эти процессы, а на рис. 81 представлена схема путей образования и расходования унифицированных форм энергии [по В. П. Скулачеву (1984) в некотором видоизменении В. К. Акименко (1989)]. На рис. 81 обобщена сущность хемиосмотического принципа П. Митчелла о сопряжении процессов генерации и потребления энергии, доступ- ной для клетки. Здесь речь идет'о трансмембранном потенциале ионов водорода — Д рН* , который представляет собой унифици- рованную форму энергии, обеспечивающей (наряду с АТФ при гликолизе у анаэробов, и у некоторых видов - Дд№⁺) все энерго- потребности клеток.